本发明涉及一种检测内皮抑素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用。
背景技术
目前国内的内皮抑素浓度的检测方法主要是酶联免疫吸附试验法，但是该方法耗时且价格昂贵。免疫比浊法主要包括透射比浊法、散射比浊法和免疫胶乳比浊法。免疫胶乳比浊法具有灵敏度高，特异性好的特点，在大型医院临床检验中得到了广泛应用。但进口试剂费用较高，增加了患者的负担。
技术实现要素：
针对上述现有技术的不足之处，本发明解决的问题为：提供一种检测内皮抑素的胶乳增强免疫比浊试剂盒以及应用。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：
一种检测内皮抑素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括试剂r1、试剂r2、内皮抑素标准品溶液；所述的试剂r1包含电解质、促凝剂、防腐剂、缓冲液；所述的试剂r2包含重组人内皮抑素抗体包被的胶乳颗粒、电解质、稳定剂、防腐剂、缓冲液；所述的重组人内皮抑素抗体为将合成的重组人内皮抑素免疫兔、羊、鸡再经亲和层析纯化获得的免疫球蛋白；所述重组人内皮抑素标准品溶液为含有不同浓度重组人内皮抑素标准品的缓冲液。
进一步，所述的试剂r1中所述电解质选自氯化钠、氯化镁、氯化钾，浓度为0.01％-1.5％；试剂r2中所述的电解质选自氯化钠、氯化镁、氯化钾，浓度为0.01％-0.1％。
进一步，所述的试剂r1中所述促凝剂选自浓度为2.5％的peg6000或不同peg的混合体。
进一步，所述的试剂r1和r2中所述的防腐剂选自叠氮钠，浓度为0.05％-0.1％。
进一步，所述的试剂r1和r2中缓冲液选自pbs缓冲液、mes缓冲液、hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、dipso缓冲液或醋酸缓冲液中的一种，缓冲液浓度再20-200mm之间。
进一步，所述的试剂r2中所述的稳定剂选自edtana2和牛血清白蛋白，浓度为0.1％-1.0％。
进一步，所述的试剂r2中胶乳颗粒为直径范围0.05-0.20um的聚苯乙烯胶乳颗粒，试剂r2中胶乳颗粒浓度为0.1％-0.8％。
进一步，所述的胶乳颗粒为直径0.13um的聚苯乙烯胶乳颗粒，试剂r2中胶乳颗粒浓度为0.3％。
进一步，所述的试剂r2中内皮抑素抗体包被的胶乳颗粒是通过化学交联剂在交联缓冲液进行的；所述的化学交联剂为碳化二亚胺(edac)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)；所述的交联缓冲液选自pbs缓冲液、mes缓冲液、hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、dipso缓冲液或醋酸缓冲液，ph在6.0-8.0之间。
进一步，重组人内皮抑素标准品的缓冲液含有不同浓度，其中内皮抑素含量分别为0μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml，缓冲液为pbs缓冲液、hepes缓冲液或tris-hcl缓冲液中的一种或几种。
进一步，检测时试剂r1、r2分别加取225μl和75μl，样品加样量为4-12μl，或类似比例整体增减。
进一步，检测检测内皮抑素的胶乳增强免疫比浊试剂盒组成如下：
r1试剂：0.05mol/lpbs、2.5％peg6000，0.05％nan3,0.015％nacl；
r2试剂：致敏胶乳、30mmol/ldipso缓冲液，0.1％nan3，0.01％edtana2和0.09％bsa；
重组人内皮抑素标准品溶液：内皮抑素作为抗原标准品，50mmpbs缓冲液。
进一步，在本发明中，重组人内皮抑素与胶乳颗粒包被的鸡抗重组人内皮抑素多克隆抗体发生抗原抗体反应，形成抗原—抗体—胶乳颗粒复合物，导致浊度上升，优选的，测定此浊度在450-600nm(最优选的，510nm)波长处的吸光度，对照标准曲线即可计算样本中内皮抑素含量。
一种检测内皮抑素的胶乳增强免疫比浊试剂盒的应用，其特征在于，应用于内皮抑素的检测。
本发明的有益效果
1.目前免疫比浊法主要包括透射比浊法、散射比浊法和免疫胶乳比浊法。免疫胶乳比浊法具有灵敏度高，特异性好的特点，在大型医院临床检验中得到了广泛应用。但进口试剂费用较高，增加了患者的负担。目前内皮抑素通常采用酶联免疫吸附剂测定的方法进行检测，该方法在检测过程中消耗时间长，且价格较高，而本实验中研制的胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒操作简单,时间短,检测方便,试剂容易保存,无放射性，且可以用全自动生化分析仪进行批量化的测,具有一定的研究价值。
2.本研发明选择合适粒径的胶乳微球，交联重组人内皮抑素鸡抗体(igy)，将原来研究中的兔抗体(igg)换成igy，是由于igy具有以下优势，首先它能有效避免人体体液中补体、类风湿因子或fc受体的干扰从而保证试剂有较高的特异性。其次在遗传上与人类进化关系差别较大的禽类产生的抗体具有比哺乳动物多克隆抗体更高的亲和性。另外此类抗体效价高用量相对降低，试剂成本方面也有一定优势。
3.本发明对胶乳增强比浊法测定重组人内皮抑素进行探讨研究，从而确定最佳反应条件，对开发质优低价的国产重组人内皮抑素检测试剂盒的研发具有指导意义。因本发明试剂原材料多为国产和自制，成本较低，可以达到降低医疗成本的目的。
附图说明
图1为内皮抑素的胶乳增强免疫比浊试剂盒检测浓度标准曲线。
图2为0.13um的胶乳制备的r2在不同胶乳浓度检测结果比较。
图3为0.13um的0.3％浓度的胶乳配制成r2在不同波长检测结果比较。
具体实施方式
下面结合附图对本发明内容作进一步详细说明。
实施例1内皮抑素的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备
试剂r1：试剂r1：50mmpbs缓冲液(ph7.4)，2.5％peg6000，0.015％nacl，0.5％nan3，该试剂为无色透明溶液。
试剂r2：重组人内皮抑素抗体包被胶乳颗粒(粒径0.13μm)0.3％，30mm、ph7.4的hepes或dipso缓冲液，0.1％nan3，0.01％edtana2和0.09％bsa。
重组人内皮抑素的抗体利用化学交联剂碳化二亚胺(edac)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)定向固定在苯乙烯胶乳颗粒上的制备方法：
(1)取1ml0.05mol/lmes缓冲液(ph6.0)至10ml离心管中，加入60μl10％的胶乳，上下混匀，15000rpm/min离心30min，去上清；
(2)秤取3.0mgedac加入1mlmes缓冲液中，然后取100μl该溶液加入到900μlmes缓冲液中制成溶液；
(3)在步骤(1)离心管中加入1ml步骤(2)中所配的溶液，用枪头吹打混匀，22℃16rpm/min避光旋转反应10min；
(4)在上述离心管中加入100μl1.35mg/mlnhs(秤取13.5mgnhs加入10ml的mes缓冲液中)，22℃16rpm/min避光旋转反应30min；14000rpm离心30min，去上清；
(5)在上述离心管中加入1ml0.05mpbs(ph7.4)，用枪头上下混匀，15000rpm/min离心30min，去上清；
(6)在上述离心管中加入1ml0.05mpbs溶液(ph7.4)，超声混匀，然后加入抗体20μg，混匀后，37℃16rpm避光旋转反应2h；
(7)在上述离心管中加入10μl终止液，37℃条件下16rpm/min避光旋转反应1h；15000rpm离心30min，去上清；
(8)在上述离心管中加入1ml30mmol/ldipso缓冲液，超声混匀，15000rpm/min离心30min；
(9)加入1ml30mmol/ldipso缓冲液，超声混匀，4℃保存。
内皮抑素标准品溶液：在50mmpbs缓冲液中加入内皮抑素作为标准品，使其终浓度分别为0μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml。并且以此为定标，进行样品相对定量检测。
实施例2内皮抑素胶乳增强免疫比浊试剂盒的检测步骤以及标准曲线绘制
检测波长：510nm。
样品量：8μl；r1：250μl；r2：75μl；r1和r2组成同实施例1。
以日立7080生化分析仪为例，首先加入r1，37℃孵育30s，之后加入标准品(待测样本)，孵育5min，再加入r2，测定反应第10s和5min的吸光度值(分别为a1、a2)，计算吸光度差值od510＝a2-a1；
标准曲线绘制：以标准品浓度为横坐标，吸光度差值od510为纵坐标绘制检测浓度标准曲线并建立回归方程得校准曲线，见图1；
计算方法：将测得的待测样本吸光度差值od510代入回归方程即可计算出待测样品中的内皮抑素浓度。
实施例3内皮抑素胶乳增强免疫比浊试剂盒组分的筛选
将制备好的r1和r2以日立7080生化分析仪为例进行试剂盒组分的筛选，首先加入r1，37℃孵育30s，之后加入标准品(待测样本)，孵育5min，再加入r2，测定反应第10s和5min的吸光度值(分别为a1、a2)，计算吸光度差值od510＝a2-a1。
计算不同粒径的胶乳检测的吸光度差值，从线性关系优选0.13μm的胶乳制备的r2。
在其它条件相同时，优选0.13μm的胶乳制备的r2，在不同胶乳浓度情况下进行同上检测，结果见图2，优选0.3％浓度的胶乳配制成r2在检测范围内线性关系最好。
确定r2中胶乳的浓度后，进行最适检测波长，结果见图3所示，在其它条件相同时，在450-600之间选择3个常用波长进行检测，相对来说在检测范围内510处的线性关系最好，故选择该波长进行试剂盒的检测。
实施例4内皮抑素胶乳增强免疫比浊试剂盒性能检测
本实施例基于实施例4优化的检测条件考察试剂盒性能
统计分析：数据表示为平均数±标准误用(x±se)spss19.0软件进行单因素独立t检测分析，p＜0.05判定为差异显著，p≥0.05判定为差异不显著。
1.试剂盒检测限
用本发明试剂盒测定20个空白标准品，如表所示20个空白样品检测限平均值为0.185μg/ml，标准差为0.036μg/ml，因此试剂盒的检测限为0.185+3×0.036＝0.293μg/ml，考虑到试剂检测操作及应用时存在误差，试剂盒检测限确定为0.5μg/ml，试剂盒检测线性范围是0.5-20.00μg/ml。
表1本发明试剂盒检测限检测
2.试剂盒准确度
用本发明制备好的试剂盒对已知内皮抑素浓度为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml进行检测(n＝5)，以回收率和变异系数(cv)确定准确度。结果表明回收率范围是，cv均小于10％，说明试剂盒准确度较好。
表2本发明试剂盒准确度检测
3.试剂盒精确度
取3个不同批次的本发明检测试剂盒对已知内皮抑素浓度为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml进行测(n＝5)，以回收率和变异系数(cv)确定精确度。检测值的批内和批间的变异系数均小于10％，说明试剂盒的精密度较高。
表3本发明试剂盒精确度检测
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。