本发明涉及文物检测领域，尤其涉及一种检测古代丝织品的方法。
背景技术：
中国自古以来就是纺织品大国，生产的纺织品种类丰富，工艺精美，舒适透气。其中最负盛名的纺织品就是中国的丝绸，故中国又被称为“丝绸之国”。丝绸的主要成分是桑蚕丝，桑蚕丝主要由丝素蛋白和丝胶两部分组成，丝素蛋白是蚕丝的主要组成部分，约占总重量的70%。并且桑蚕丝作为一种有机高分子材料，易受光、热、酸碱、微生物等的影响发生降解，从而造成结晶度、分子量等结构及性能的变化，所以常规的检测方法灵敏度低，受杂质干扰影响大，不适合对文物进行检测，因此需要开发一种灵敏度好，特异性强的检测古代丝织品的方法。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测古代丝织品的方法。本发明采用甲酸、硝酸钙溶液体系提取丝素蛋白，之后通过氧化石墨烯，丙二胺，六氯铂酸钠，硼氢化钠混合体系制备石墨烯纳米复合物修饰工作电极，在工作电极上相继修饰桑蚕丝素蛋白抗体、所测样品，分别使用电化学检测电流值，通过分析电流值的变化判断样品是否为丝织品。本发明提供的方法操作简单，灵敏度高。
本发明的具体技术方案为：一种检测古代丝织品的方法，以g、mg和ml计，包括以下步骤：
1）称取4-6g桑蚕丝置于180-220ml含0.018-0.022m的碳酸钠溶液中，水浴55-65min，水浴温度为75-85℃，取出用去离子水清洗三次以上，干燥。
2）取1.8-2.2g烘干的丝素，2.3-2.7g硝酸钙，加入甲酸48-52ml，搅拌80-100min，过滤加入碳酸氢钠直至溶液呈中性，透析冷冻干燥后，将得到的丝素蛋白研磨成粉备用，得到丝素蛋白粉。
本发明使用硝酸钙、甲酸体系溶解丝素，既能增加对丝素的溶解度，又能减小对丝素分子链的破坏，而且该体系在常温下即可完成对丝素的溶解，无需加热。
3）取2.8-3.2ml浓度为5-7mg/ml的氧化石墨烯浸泡在0.2-0.4m丙二胺中回流2.8-3.2h；然后加入5-6ml0.1％（w/v）的六氯铂酸钠，连续搅拌并在相同温度回流20-40min后将5-7ml1％w/的v硼氢化钠逐滴加入到反应体系中，并在相同温度下进一步回流20-40min，冷却最终的回流溶液并以5000-6000rpm离心9-11min后，用去离子水洗涤3-5次。
本发明制备的石墨烯纳米复合物具有良好的生物相容性，较大的比表面积和良好的吸附性能，不仅可以捕获大量抗体，还可以放大电化学发光信号，提高检测的灵敏度。
4）取1.8-2.2ml步骤3）所得溶液与5.8-6.2mln，n-二甲基甲酰胺混合超声处理10-20min。
5）电极1，2，3分别用0.02µm的al2o3打磨后，用去离子水超声清洗，用28-32µl步骤4）所得溶液滴加到电极表面后，在空气中干燥。
6）将步骤5）处理后的电极1，2，3置于8-12µl稀释至1000倍的桑蚕丝素蛋白抗体中，在1-5℃的环境中孵育5-7h后用pbs7.4缓冲液冲洗，继而用1wt%的bsa溶液孵育28-32min，用pbs7.4缓冲液冲洗。
7）取步骤2）所得蚕丝素蛋白粉，用cb9.6缓冲液配制成90-110µg/ml的丝素蛋白溶液；取0.02-0.2g文物样溶解于100mlcb9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
8）取步骤7）中丝素蛋白溶液8-12µl滴加至步骤6）中处理后的电极1上，取步骤7）中文物样溶液8-12µl滴加至步骤6）中处理后的电极2上，并在37℃潮湿的环境下孵育50-70min，用pbs7.4缓冲液冲洗。
9）取经步骤6）处理的金电极3和步骤8）处理的电极1，2，在5mm[fe(cn)6]3-/4-溶液中进行电化学检测，扫描电位为-0.2-0.6v，振幅为0.05v；将电极1，3所得电流峰值出现的差值作为对照，若电极2，3电流峰值出现差值，说明文物样含有桑蚕丝，反之则说明不含有桑蚕丝。
本发明采用甲酸、硝酸钙溶液体系提取丝素蛋白，之后通过氧化石墨烯，丙二胺，六氯铂酸钠，硼氢化钠混合体系制备石墨烯纳米复合物修饰工作电极，在工作电极上相继修饰桑蚕丝素蛋白抗体、所测样品，分别使用电化学检测电流值，通过分析电流值的变化判断样品是否为丝织品。本发明提供的方法操作简单，灵敏度高。
作为优选，步骤2）中，过滤所得溶液用截留分子量为8000-10000的纤维素透析袋在去离子水中透析2-3天，并每隔5-7h换一次水，将丝素蛋白溶液真空冷冻2-3天。
作为优选，步骤3）中，回流温度为65-75℃。
作为优选，步骤6)和步骤8）中，pbs7.4缓冲液的配制方法为：称取0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾，8g氯化钠和1.42g磷酸氢二钠加入到800ml去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000ml，调节溶液的ph至7.4。
作为优选，步骤7）中cb9.6溶液的配制方法为：称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠加入到800ml去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000ml，调节溶液的ph至9.6。
作为优选，步骤9）中，电化学检测包含三个电极，金电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
（1)本发明桑蚕丝素蛋白提取方法使用硝酸钙、甲酸体系溶解丝素，既能增加对丝素的溶解度，又能减小对丝素分子链的破坏，而且该体系在常温下即可完成对丝素的溶解，无需加热。
（2）本发明合成的石墨烯纳米复合物，因较大的比表面积和纳米尺寸，具有优异的增敏性和可修饰性，用其修饰工作电极，可以加强检测结果的灵敏度。
（3）本发明样品用量少，可以快速、准确、高灵敏性地检测出丝素蛋白，对于检测降解严重的丝织品文物具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：
1）称取5g桑蚕丝置于180ml含0.018m的碳酸钠溶液中，水浴55min，水浴温度为80℃，取出用去离子水清洗三次，放入烘箱干燥。
2）取2g烘干的丝素，2.3g硝酸钙，加入甲酸48ml，用磁力搅拌80min，过滤加入碳酸氢钠直至溶液呈中性，将所得溶液用截留分子量为8000的纤维素透析袋在去离子水中透析2天，并每隔5h换一次水，将丝素蛋白溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥2天后，将得到的丝素蛋白研磨成粉备用。
3）取2.8ml浓度为5mg/ml的氧化石墨烯浸泡在0.2m丙二胺中在65℃温度下回流2.8h;然后，将5ml0.1％（w/v）六氯铂酸钠加入到先前的混合物中，连续搅拌并在相同温度回流30分钟后将5ml1％w/v硼氢化钠逐滴加入到反应体系中，并在相同温度下进一步回流30分钟，冷却最终的回流溶液并以5000rpm离心9分钟后，用去离子水洗涤3次。
4）取1.8ml步骤3）所得溶液加入5.8mln，n-二甲基甲酰胺混合超声处理15min。
5）金电极1，2，3用0.02µm的al2o3打磨后，用去离子水超声清洗，用28µl步骤4）处理后的溶液滴加到金电极表面后，在空气中干燥。
6）将步骤5）处理后的电极1，2，3置于8µl稀释到1000倍的桑蚕丝素蛋白抗体中，在4℃的环境中孵育5h后用pbs7.4缓冲液冲洗，继而用1wt%bsa溶液孵育28min，用pbs7.4缓冲液冲洗。
其中pbs7.4缓冲液的配制：称取0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾，8g氯化钠和1.42g磷酸氢二钠加入到800ml去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000ml，调节溶液的ph至7.4。
7）取步骤2）中提取的桑蚕丝素蛋白粉末用cb9.6缓冲液配制成100µg/ml的丝素蛋白溶液；取0.02g文物样溶解于100mlcb9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
其中cb9.6溶液的配制：称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠加入到800ml去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000ml，调节溶液的ph至9.6。
8）取步骤7）中丝素蛋白溶液8µl滴加至步骤6）中处理后的电极1上，取步骤7）中文物样溶液8µl滴加至步骤6）中处理后的电极2上，并在37℃潮湿的环境下孵育50min，用pbs7.4缓冲液冲洗。
9）取经步骤6）处理的电极3和步骤8）处理的电极1，2，在5mm[fe(cn)6]3-/4-溶液中进行电化学检测，扫描电位为-0.2-0.6v，振幅为0.05v，金电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极；将电极1，3所得电流峰值出现的差值作为对照，如果电极2，3电流峰值出现了差值，说明文物样含有桑蚕丝，反之则说明没有。
实施例2：
1）称取5g桑蚕丝置于200ml含0.02m的碳酸钠溶液中，水浴60min，水浴温度为80℃，取出用去离子水清洗四次，放入烘箱干燥。
2）取2g烘干的丝素，2.5g硝酸钙，加入甲酸50ml，用磁力搅拌90min，过滤加入碳酸氢钠直至溶液呈中性，将所得溶液用截留分子量为9000的纤维素透析袋在去离子水中透析2.5天，并每隔6h换一次水，将丝素蛋白溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥2.5天后，将得到的丝素蛋白研磨成粉备用。
3）取3ml浓度为6mg/ml的氧化石墨烯浸泡在0.3m丙二胺中在70℃温度下回流3h;然后，将5.5ml0.1％（w/v）六氯铂酸钠加入到先前的混合物中，连续搅拌并在相同温度回流30分钟后将6ml1％w/v硼氢化钠逐滴加入到反应体系中，并在相同温度下进一步回流30分钟，冷却最终的回流溶液并以5500rpm离心10分钟后，用去离子水洗涤4次。
4）取2ml步骤3）所得溶液加入6mln，n-二甲基甲酰胺混合超声处理15min。
5）金电极1，2，3用0.02µm的al2o3打磨后，用去离子水超声清洗，用30µl步骤4）处理后的溶液滴加到金电极表面后，在空气中干燥。
6）将步骤5）处理后的电极1，2，3置于10µl稀释到1000倍的桑蚕丝素蛋白抗体中，在4℃的环境中孵育6h后用pbs7.4缓冲液冲洗，继而用1wt%bsa溶液孵育30min，用pbs7.4缓冲液冲洗。
其中pbs7.4缓冲液的配制：称取0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾，8g氯化钠和1.42g磷酸氢二钠加入到800ml去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000ml，调节溶液的ph至7.4。
8）取步骤2）中提取的桑蚕丝素蛋白粉末用cb9.6缓冲液配制成100µg/ml的丝素蛋白溶液；取0.02-0.2g文物样溶解于100mlcb9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
其中cb9.6溶液的配制：称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠加入到800ml去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000ml，调节溶液的ph至9.6。
8）取步骤7）中丝素蛋白溶液10µl滴加至步骤6）中处理后的电极1上，取步骤7）中文物样溶液10µl滴加至步骤6）中处理后的电极2上，并在37℃潮湿的环境下孵育60min，用pbs7.4缓冲液冲洗。
9）取经步骤6）处理的电极3和步骤8）处理的电极1，2，在5mm[fe(cn)6]3-/4-溶液中进行电化学检测，扫描电位为-0.2-0.6v，振幅为0.05v，金电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极；将电极1，3所得电流峰值出现的差值作为对照，如果电极2，3电流峰值出现了差值，说明文物样含有桑蚕丝，反之则说明没有。
实施例3：
1）称取5g桑蚕丝置于220ml含0.022m的碳酸钠溶液中，水浴65min，水浴温度为80℃，取出用去离子水清洗五次，放入烘箱干燥。
2）取2g烘干的丝素，2.7g硝酸钙，加入甲酸52ml，用磁力搅拌100min，过滤加入碳酸氢钠直至溶液呈中性，将所得溶液用截留分子量为10000的纤维素透析袋在去离子水中透析3天，并每隔7h换一次水，将丝素蛋白溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥3天后，将得到的丝素蛋白研磨成粉备用。
3）取3.2ml浓度为7mg/ml的氧化石墨烯浸泡在0.4m丙二胺中在75℃温度下回流3.2h;然后，将6ml0.1％（w/v）六氯铂酸钠加入到先前的混合物中，连续搅拌并在相同温度回流30分钟后将7ml1％w/v硼氢化钠逐滴加入到反应体系中，并在相同温度下进一步回流30分钟，冷却最终的回流溶液并以6000rpm离心11分钟后，用去离子水洗涤5次。
4）取2.2ml步骤3）所得溶液加入6.2mln，n-二甲基甲酰胺混合超声处理15min。
5）金电极1，2，3用0.02µm的al2o3打磨后，用去离子水超声清洗，用32µl步骤4）处理后的溶液滴加到金电极表面后，在空气中干燥。
6）将步骤5）处理后的电极1，2，3置于12µl稀释到1000倍的桑蚕丝素蛋白抗体中，在4℃的环境中孵育7h后用pbs7.4缓冲液冲洗，继而用1wt%bsa溶液孵育32min，用pbs7.4缓冲液冲洗。
其中pbs7.4缓冲液的配制：称取0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾，8g氯化钠和1.42g磷酸氢二钠加入到800ml去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000ml，调节溶液的ph至7.4。
9）取步骤2）中提取的桑蚕丝素蛋白粉末用cb9.6缓冲液配制成100µg/ml的丝素蛋白溶液；取0.2g文物样溶解于100mlcb9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
其中cb9.6溶液的配制：称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠加入到800ml去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000ml，调节溶液的ph至9.6。
8）取步骤7）中丝素蛋白溶液12µl滴加至步骤6）中处理后的电极1上，取步骤7）中文物样溶液12µl滴加至步骤6）中处理后的电极2上，并在37℃潮湿的环境下孵育70min，用pbs7.4缓冲液冲洗。
9）取经步骤6）处理的电极3和步骤8）处理的电极1，2，在5mm[fe(cn)6]3-/4-溶液中进行电化学检测，扫描电位为-0.2-0.6v，振幅为0.05v，金电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极；将电极1，3所得电流峰值出现的差值作为对照，如果电极2，3电流峰值出现了差值，说明文物样含有桑蚕丝，反之则说明没有。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。