基于羟基氧化钴纳米片的乙酰胆碱酯酶活性检测试纸条及其制备方法与流程

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于羟基氧化钴纳米片(cooohnps)的乙酰胆碱酯酶(ache)活性检测试纸条及其制备方法。

背景技术

乙酰胆碱酯酶是人体内重要的丝氨酸酯酶，广泛存在于神经肌肉接头和胆碱能类型的化学突触中。作为降解剂，可特异性调节神经递质乙酰胆碱的水平。低水平的乙酰胆碱可导致胆碱能突触的神经传递终止，引起阿尔茨海默症和帕金森病症的产生。乙酰胆碱酯酶在上述胆碱能系统的退化中发挥重要作用，因此乙酰胆碱酯酶的高敏感度测定和现场筛查在疾病预防领域受到越来越多关注。随之许多检测方法应运而生，如荧光法、电化学法和化学发光法等。然而，这些检测方法的弊端是资源要求相对较高，例如成本高、操作复杂等。因此，开发简便、快速、高灵敏地检测乙酰胆碱酯酶的方法显得尤为重要。

近年来，基于酶的比色测定法已被广泛应用于快速检测，但由于天然酶的活性易受到环境条件的限制，其检测灵敏度无法得到显著改善。纳米科学技术的不断发展促进了纳米酶的产生，多种具有特殊的过氧化物酶或氧化酶活性的功能纳米材料被报道。纳米酶因其优异的仿酶特性和可设计性，同时还兼顾纳米材料特有的物理和化学性质(如超顺磁性、荧光性等)，使其在生物快速检测和疾病诊断等方面有望代替天然酶。二维结构的纳米酶具备高的比表面以及大量的结合位点，与其他纳米材料相比具备更高的酶催化活性。近年来，羟基氧化钴纳米片作为新兴的二维金属氧化物在电催化和生物催化领域引起了极大关注，羟基氧化钴纳米片具备易于快速合成、稳定性好、高亲水性等特点，其更适合应用于快速检测试纸的研究。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术中存在的测试时间较长、误差较大、对ache浓度要求较高、测试方法繁琐以及检测灵敏度较低等问题，提供一种基于cooohnps的ache活性检测试纸条。该试纸条可以简便、快速、高灵敏地检测ache的活性。本发明所述的基于cooohnps的ache活性检测试纸条的机理是当引入ache时、乙酰胆碱(ach)和胆碱氧化酶(cho)会发生氧化还原反应生成h2o2。随后，h2o2被cooohnps催化产生羟基自由基，使无色的3,3’,5-,5’-四甲基联苯胺(tmb)显色剂氧化成蓝色的oxtmb，造成试纸条的颜色变化(如图1所示)。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明所述的一种基于cooohnps的ache活性检测试纸条的制备方法，其步骤如下：

(1)将naoh水溶液与cocl2水溶液混合后超声1～3分钟，其中naoh与cocl2的摩尔比为2～4：1；将0.8moll^-1～1.2moll^-1的naclo溶液加入到上述naoh与cocl2的混合溶液中，naclo与naoh的摩尔用量比例为1：4～8，再次超声处理10～20分钟；然后加入去离子水，离心后收集cooohnps，最后将cooohnps用去离子水稀释至25μgml^-1；

(2)将试纸条浸入到含有25μgml^-1cooohnps、ach和cho(ach和cho的摩尔用量比例为1：2～8，cooohnps与ach的摩尔用量比例为1：200～300)的混合溶液中，在该混合溶液中浸润2～5小时，得到本发明所述的基于cooohnps的ache活性检测试纸条。

将检测试纸条取出后再浸润到0～20muml^-1ache的水溶液中5～10分钟，将浸润后的试纸条取出后干燥。当向上述试纸条上滴入50μl1mgml^-1tmb显色剂时，试纸条显色反应被触发，即可观察到随着ache浓度的增加，试纸条颜色逐渐由无色变为蓝色。

本发明具有以下特点：

(1)本发明制备的基于cooohnps的ache活性检测试纸条具有酶活性高、易于制备等优点，利用其仿酶特性可对ache进行定性定量分析。

(2)本发明所应用的试纸条具备构建过程简便、易于操作、响应速度快、成本低等优点。同时基于cooohnps的ache活性检测方法被用于构建纸基传感器，实现对ache进行现场手持化检测。

本发明基于cooohnps的ache活性检测试纸条在构建便携式微型诊断设备以实现即时检验(poct)方面具有巨大的潜力。

附图说明

图1：基于cooohnps的ache活性检测试纸条检测乙酰胆碱酯酶的机理示意图。

图2：实施例2所述的试纸条制作及显色流程图(a)及实施例3中试纸条对于不同浓度ache活性检测结果示意图(b)。

具体实施方式

实施例1：cooohnps的合成

将300μlnaoh去离子水溶液(1.0moll^-1)加入到1000μlcocl2(10mmoll^-1)去离子水溶液中，混合物超声1分钟；将50μlnaclo(0.9moll^-1)溶液加入到上述naoh与cocl2的混合溶液中，超声处理10分钟。然后加入650μl去离子水，离心10分钟后，收集cooohnps，干燥后称其质量为1.5mg。将所得的cooohnps用去离子水洗涤3次。最后，将cooohnps用去离子水稀释至25μgml^-1备用。

实施例2：试纸条的制作

将试纸条(杭州富阳特种纸业有限公司，规格为1cm*1cm)浸入到由去离子水溶解的25μgml^-1cooohnps、50mmoll^-1ach和2.0uml^-1cho的混合溶液中3小时，得到本发明所述的基于cooohnps的ache活性检测试纸条。

将试纸条取出后再加入到浓度为20muml^-1的ache去离子水溶液中15分钟，最后将试纸条取出后干燥，当向试纸条上方滴入50μl显色剂tmb(1mgml^-1)时，显色反应被触发，试纸条呈蓝色并可在25分钟内保持颜色稳定。试剂的条的制作及显色过程如图2(a)所示。

实施例3：试纸条对ache活性检测的应用

本发明制备了具有不同浓度ache(0、1.25、2.5、5.0、10和20muml^-1)的cho/cooohnps/ach体系的试纸条，然后再滴加50μl1mgml^-1tmb显色剂后，用肉眼即可观察到随着ache浓度的增加，试纸的颜色从无色到深蓝色的变化，如图2(b)所示。

实施例4：对血清中ache的检测

本发明使用的健康人血清由吉林大学校医院友情提供。由于血浆中的高蛋白质，因此需要进行预处理来消除共存物质带来的干扰。处理步骤如下：将1ml人血清、2ml去离子水与2ml乙腈混合，通过涡旋处理5分钟。随后，加入5ml10％(w/v)三氯乙酸将人血清样品脱蛋白质。最后通过离心(10,000rpm，15分钟)获得除去蛋白质和其他大分子沉淀的血清溶液。

表1：应用试纸条检测复杂血清样品中的ache

将上述血清溶液用去离子水稀释10倍。通过标准加入法将5.0、10.0和15.0muml^-1的ache添加到上述经处理后的血清样品，然后应用cho/cooohnps/ach体系进行检测分析得到回收量。结果如表1所示，其中平均回收率根据计算回收量与加标量的比值得到96.5％～101.3％，相对标准偏差(rsd＝标准偏差/平均值)低于3.9％，结果表明本发明本发明试纸条可用于定量检测复杂血清样品中的ache。