本发明属于生命科学领域，具体涉及一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒及其方法。
背景技术
gls（ec3.5.1.1）是谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶可催化谷氨酰胺水解成l-谷氨酸和氨，在氮素代谢中，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢中具有重要调控作用。目前已有的测定谷氨酰胺酶活性的方法为奈氏法，应用奈氏试剂测定氨的增加量来反映谷氨酰胺酶活性的高低。
不过，奈氏法缺存在以下几个缺点：1、配制繁琐，需要五种试剂，其中hgcl2为剧毒品，一般实验室无法获得；2、该方法受到的干扰较大，存在假阳性；3、测定结果不稳定，重复性差。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒及其方法，具有试剂配制简单，检测专一性高，重复性较好和适用性广泛等特点。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒，包括以下试剂：
试剂一，ph8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液60ml×2瓶，4℃保存；
试剂二，0.05﹪的谷氨酰胺水溶液40ml×1瓶，4℃保存；
试剂三，20﹪的tca水溶液60ml×1瓶，常温保存；
试剂四，茚三酮粉剂×1瓶，4℃保存。
进一步的，每瓶所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液均由0.1795gna2hpo4、0.0347g柠檬酸和60ml蒸馏水混合而成，并置于60ml的容量瓶中。
进一步的，所述谷氨酰胺水溶液由0.02g谷氨酰胺和40ml蒸馏水混合而成，并置于40ml的容量瓶中。
进一步的，所述tca水溶液由12gtca和60ml蒸馏水混合而成，并置于60ml容量瓶中。
进一步的，所述茚三酮粉剂包含0.025g茚三酮，并置于5ml棕色瓶中。
一种利用上述试剂盒的基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定方法，具体步骤如下：
步骤1仪器和用品的准备；
准备台式离心机、可见分光光度计或酶标仪、微量石英比色皿或96孔板、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2粗酶液提取；
1）细菌、细胞样品的制备：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照一定比例加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
2）组织样品的制备：
先称取组织；然后按照一定的比例加入试剂一，进行冰浴匀浆；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
3）血清或血浆样品：直接检测；
步骤3将分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零；
步骤4试剂四在临用前，加入5ml蒸馏水充分溶解混匀，配制成茚三酮水溶液（用不完的试剂仍4℃保存）；
步骤5样本测定；
1）取2支ep管，分别设定为第一测定管和第一对照管；
2）在第一测定管中加入25μl样本、100μl试剂一和400μl试剂二，同时在第一对照管中加入25μl蒸馏水、100μl试剂一和400μl试剂二；
3）分别将第一测定管和第一对照管混匀，37℃水浴1小时；
4）水浴后分别在第一测定管和第一对照管中加入525μl试剂三；
5）分别将上述加入试剂三的第一测定管和第一对照管混匀，并在离心率8000g，25℃下离心10min，取上清液；
6）另取2支ep管，分别设定为为第二测定管和第二对照管；
7）在第二测定管中加入250μl第一测定管中的上清液和50μl试剂四的水溶液，同时在第二对照管中加入250μl第一对照管中的上清液和50μl试剂四的水溶液；
8）分别将第二测定管和第二对照管混匀，90℃水浴20min，并流水冷却；
9）在上述冷却后的第二测定管和第二对照管中各取200μl混合溶液至微量石英比色皿或96孔板中，于570nm波长处分别记录测定管的吸光值a测定管和对照管的吸光值a对照管；
10）计算δa=a测定管-a对照管；
步骤5酶活性的计算；
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y=0.0074x-0.5255；
其中，x为标准品浓度，单位为μg/ml；y为吸光值，取值为δa；
1）血清或血浆中的gls活性；
单位定义：每ml血清或血浆每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/ml)=(δa+0.5255)÷0.0074×v反总÷v样÷t=94.59×(δa+0.5255)；
2）组织、细菌或细胞中的gls活性；
2.1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg蛋白质每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/mgprot)=(δa+0.5255)÷0.0074×v反总÷(v样×cpr)÷t=94.59×(δa+0.5255)÷cpr;
2.2）按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/g鲜重)=(δa+0.5255)÷0.0074×v反总÷(w×v样÷v样总)÷t=94.59×(δa+0.5255)÷w；
2.3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/104cell)=(δa+0.5255)÷0.0074×v反总÷(500×v样÷v样总)÷t=0.189×(δa+0.5255)；
其中，v样总表示加入提取液体积，且v样总=1ml；
t表示反应时间，且t=60min；
v反总表示反应体系总体积，且v反总=1.05ml；
v样表示加入反应体系中样本体积，且v样=0.025ml；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示细菌或细胞总数，代表500万个；
b.用96孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y=0.0037x-0.5255；
其中，x为标准品浓度，单位为μmol/ml，y为吸光值，取值为δa；
1）血清或血浆中的gls活性；
单位定义：每ml血清或血浆每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/ml)=(δa+0.5255)÷0.0037×v反总÷v样÷t=189.19×(δa+0.5255)；
2）组织、细菌或细胞中的gls活性；
2.1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg蛋白质每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/mgprot)=(δa+0.5255)÷0.0037×v反总÷(v样×cpr)÷t=189.19×(δa+0.5255)÷cpr;
2.2）按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/g鲜重)=(δa+0.5255)÷0.0037×v反总÷(w×v样÷v样总)÷t=189.19×(δa+0.5255)÷w；
2.3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/104cell)=(δa+0.5255)÷0.0037×v反总÷(500×v样÷v样总)÷t=0.378×(δa+0.5255)；
其中，v样总表示加入提取液体积，且v样总=1ml；
t表示反应时间，且t=60min；
v反总表示反应体系总体积，且v反总=1.05ml；
v样表示加入反应体系中样本体积，且v样=0.025ml；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示细菌或细胞总数，代表500万个。
进一步的，步骤2的1）中，试剂一的加入比例为细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1，建议500万细菌或细胞加入1ml试剂一。
进一步的，步骤2的1）中，所述的超声波破碎细菌或细胞的方法为先冰浴样本，然后采用功率20％或200w，超声3s，间隔10s，重复30次的超声条件超声破碎样本。
进一步的，步骤2的2）中，试剂一的加入比例为组织质量（g）：试剂一体积（ml）为1：5~10，建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一。
本发明的测定原理为gls催化谷氨酰胺水解成l-谷氨酸和氨，利用茚三酮显色法测定谷氨酸的增加速率来间接反应gls酶活性。目前尚未发现有文献和已有发明采用此方法检测gls的酶活性。
本发明的有益效果是：
1、本发明的测定原理为利用茚三酮显色法测定谷氨酸的增加速率来间接反应gls酶活性，所用试剂茚三酮配制简单，为实验室常用试剂。
2、本发明的测定方法通过合理设置对照管，可以排除杂质影响，检测专一性极高。
3、本发明的测定方法重复性较好，变异系数(cv值)在2％以内。
4、本发明的测定方法适用于动物、植物、微生物和培养细胞等各种样本，适用范围广。
5、本发明的测定方法首次利用茚三酮比色法测定谷氨酰胺酶活性，在测定原理上具有独创性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒，包括以下试剂：
试剂一，ph8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液60ml×2瓶；每瓶所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液均由0.1795gna2hpo4、0.0347g柠檬酸和60ml蒸馏水混合而成，并置于60ml的容量瓶中，4℃保存；
试剂二，0.05﹪的谷氨酰胺水溶液40ml×1瓶；所述谷氨酰胺水溶液由0.02g谷氨酰胺和40ml蒸馏水混合而成，并置于40ml的容量瓶中，4℃保存；
试剂三，20﹪的tca水溶液60ml×1瓶；所述tca水溶液由12gtca和60ml蒸馏水混合而成，并置于60ml容量瓶中，常温保存；
试剂四，茚三酮粉剂×1瓶，所述茚三酮粉剂包含0.025g茚三酮，并置于5ml棕色瓶中，4℃保存。
一种利用上述试剂盒的基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定方法，具体步骤如下：
步骤1仪器和用品的准备；
准备台式离心机、可见分光光度计或酶标仪、微量石英比色皿或96孔板、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2粗酶液提取；
1）细菌、细胞样品的制备：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例加入试剂一（建议500万细菌或细胞加入1ml试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200w，超声3s，间隔10s，重复30次）；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
2）组织样品的制备：
先称取组织；然后按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一）加入试剂一，进行冰浴匀浆；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
3）血清或血浆样品：直接检测；
步骤3将分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零；
步骤4试剂四在临用前，加入5ml蒸馏水充分溶解混匀，配制成茚三酮水溶液（用不完的试剂仍4℃保存）；
步骤5样本测定；
1）取2支ep管，分别设定为第一测定管和第一对照管；
2）参见表1所示，在第一测定管中加入25μl样本、100μl试剂一和400μl试剂二，同时在第一对照管中加入25μl蒸馏水、100μl试剂一和400μl试剂二；
表1
3）分别将第一测定管和第一对照管混匀，37℃水浴1小时；
4）参见表2所示，水浴后分别在第一测定管和第一对照管中加入525μl试剂三；
表2
5）分别将上述加入试剂三的第一测定管和第一对照管混匀，并在离心率8000g，25℃下离心10min，取上清液；
6）另取2支ep管，分别设定为为第二测定管和第二对照管；
7）参见表3所示，在第二测定管中加入250μl第一测定管中的上清液和50μl试剂四的水溶液，同时在第二对照管中加入250μl第一对照管中的上清液和50μl试剂四的水溶液；
表3
8）分别将第二测定管和第二对照管混匀，90℃水浴20min，并流水冷却；
9）在上述冷却后的第二测定管和第二对照管中各取200μl混合溶液至微量石英比色皿或96孔板中，于570nm波长处分别记录测定管的吸光值a测定管和对照管的吸光值a对照管；
10）计算δa=a测定管-a对照管；
步骤5酶活性的计算；
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y=0.0074x-0.5255；
其中，x为标准品浓度，单位为μg/ml；y为吸光值，取值为δa；
1）血清或血浆中的gls活性；
单位定义：每ml血清或血浆每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/ml)=(δa+0.5255)÷0.0074×v反总÷v样÷t=94.59×(δa+0.5255)；
2）组织、细菌或细胞中的gls活性；
2.1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg蛋白质每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/mgprot)=(δa+0.5255)÷0.0074×v反总÷(v样×cpr)÷t=94.59×(δa+0.5255)÷cpr;
2.2）按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/g鲜重)=(δa+0.5255)÷0.0074×v反总÷(w×v样÷v样总)÷t=94.59×(δa+0.5255)÷w；
2.3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/104cell)=(δa+0.5255)÷0.0074×v反总÷(500×v样÷v样总)÷t=0.189×(δa+0.5255)；
其中，v样总表示加入提取液体积，且v样总=1ml；
t表示反应时间，且t=60min；
v反总表示反应体系总体积，且v反总=1.05ml；
v样表示加入反应体系中样本体积，且v样=0.025ml；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示细菌或细胞总数，代表500万个；
b.用96孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y=0.0037x-0.5255；
其中，x为标准品浓度，单位为μmol/ml，y为吸光值，取值为δa；
1）血清或血浆中的gls活性；
单位定义：每ml血清或血浆每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/ml)=(δa+0.5255)÷0.0037×v反总÷v样÷t=189.19×(δa+0.5255)；
2）组织、细菌或细胞中的gls活性；
2.1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg蛋白质每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/mgprot)=(δa+0.5255)÷0.0037×v反总÷(v样×cpr)÷t=189.19×(δa+0.5255)÷cpr;
2.2）按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/g鲜重)=(δa+0.5255)÷0.0037×v反总÷(w×v样÷v样总)÷t=189.19×(δa+0.5255)÷w；
2.3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；
gls(μg/min/104cell)=(δa+0.5255)÷0.0037×v反总÷(500×v样÷v样总)÷t=0.378×(δa+0.5255)；
其中，v样总表示加入提取液体积，且v样总=1ml；
t表示反应时间，且t=60min；
v反总表示反应体系总体积，且v反总=1.05ml；
v样表示加入反应体系中样本体积，且v样=0.025ml；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示细菌或细胞总数，代表500万个。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。