一种用于检测高原缺氧的生物标志物及其应用的制作方法

本发明属于检测高原缺氧技术领域，具体涉及一种用于检测高原缺氧的生物标志物及其应用。

背景技术：

高原旅行的人群通常面临诸如精神失常、记忆障碍、失眠、头晕、恶心、食欲不振、运动功能障碍等问题。如果缺氧严重或持续，将不可避免的导致多个器官的血样饱和度下降，最终导致多器官功能障碍综合症。在动物模型中，模拟的高原缺氧（0.9%持续24小时）能够导致大鼠肺水肿、炎症和出血，并伴有脑水肿、海马氧化应激和认知功能障碍。随着越来越多的人群工作、旅行和生活在高海拔地区，如何有效预防缺氧损伤受到越来越关注。急性高原病，特别是高原肺水肿的临床诊断主要通过病人体征检查、胸部x线、ct、磁共振等影像学手段，这些手段都依赖于临床医师的经验。当前仍然缺少可量化的客观灵敏的临床诊断指标，也未见有采用生物标志物诊断急性高原病的相关报道，若能筛选出急性高原病的诊断标志物，并研制相应的诊断试剂盒，必将改善高原病的诊断现状。

n-乙酰神经氨酸（neu5ac)是分布最广泛的唾液酸，存在于人体的各种组织细胞，是动物细胞膜上糖蛋白和糖脂的重要组成成分。正常代谢时，血清neu5ac含量稳定，当组织细胞恶变或损伤时，细胞表面糖蛋白在结构和功能上均发生明显改变，结合在糖蛋白上的血清neu5ac随异常表达的糖蛋白脱落入血，是循环血中neu5ac升高的可能原因。最近的研究表明neu5ac在血浆中的水平与冠心病事件呈显著正相关，功能代谢组学研究发现neu5ac可选择性结合rho家族中的rhoa和cdc42，通过激活rho-rock信号通路诱发心肌损伤；敲除neu5ac的上游调控蛋白-神经氨酸酶可抑制代谢标志物neu5ac的表达，减少缺血缺氧诱导的心肌损伤。

遗传和蛋白质组学研究表明某些标志物可能参与了急性高原病的发展。因此，筛选和发现新的急性高原病的生物标志物，特别是可作为即时检验的生化标志物，具有广泛的临床应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测高原缺氧的生物标志物及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种用于检测高原缺氧的生物标志物，所述生物标志物为n-乙酰神经氨酸或其特异性抗体。

所述的n-乙酰神经氨酸或其特异性抗体可用于制备检测高原缺氧的诊断试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述n-乙酰神经氨酸或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记包括生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述诊断试剂为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的高原缺氧检测是血清样品应用于elisa法。

在本发明的第二方面，提供了一种用于缺氧检测的诊断试剂盒，所述的试剂盒包含一个容器以及一份标签或说明书，所述容器中含有n-乙酰神经氨酸分子或其异性抗体，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于高原缺氧检测的使用方法和注意事项。

在另一优选例中，所述的neu5ac分子或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体。

在本发明的第三方面，提供了一种n-乙酰神经氨酸(neu5ac)的用途，它被用作血清学检测高原缺氧的标志物；或用于制备血清高原缺氧检测的试剂盒。

本发明的有益效果：本发明提供了一种通过血清标志物检测和判断机体高原缺氧程度的方法，有助于检测或辅助检测缺氧状态，从而有助于尽早采取相应治疗措施，检测方法更方便快速，容易为病人接受，更便于动态监察高原人群的缺氧损伤进展。

附图说明

图1是常氧组和模拟高原缺氧组的大鼠血清中的neu5ac含量比较；横坐标是常氧组和模拟高原缺氧组，纵坐标是neu5ac含量（mmol/l）,n=10,p＜0.01。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

动物及模拟高原缺氧暴露

大鼠为合格实验动物用sd大鼠，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于恒温（23±2℃）、恒湿动物室，每天12/12h昼夜循环，可自由进食进水。模拟高原环境的低压低氧动物实验舱购自贵州风雷航空军械有限责任公司，型号：dyc-dwi。该舱连接有两个抽气泵，可以将舱内气体不断抽出舱外，从而模拟某一海拔高度的低压低氧环境；同时接有电子显示屏和氧传感探头（实时显示舱内所处的海拔高度及氧浓度）。20只大鼠随机分为两组，常氧组和高原低氧组，每组各10只。将高原低氧组大鼠置于低压低氧舱内适应10min。然后设置低压低氧舱中的模拟海拔高度以20m/s的速度上升至海拔7000米，然后开始计时，处理时间为24小时。大鼠戊巴比妥钠麻醉处死，肝素抗凝管取全血，然后3000rpm，离心30min，取上清即血浆进行neu5ac含量测定，相应试剂盒购自上海古朵生物科技有限公司。

含量检测

血浆内neu5ac含量的检测参照试剂盒说明书进行操作，步骤如下：

[1]从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃；

[2]设置标准品孔孔（浓度依次为0,1,2,4,8,16mmol/l）和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；

[3]样本孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；空白孔不加；

[4]除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（hrp）标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃恒温孵育60min；

[5]弃掉液体，用吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

[6]每孔加入底物a、b各50μl，37℃恒温孵育15min；

[7]每孔加入终止液50μl，于15min内在450nm波长处测定各孔的吸光值（od）；

[8]绘制标准曲线，在excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应od值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本孔的浓度值。

[9]结果判断，高原低氧损伤后，大鼠血浆内neu5ac含量从5.31mmol/l下降到2.77mmol/l（图1）。血浆中neu5ac含量可作为高原低氧损伤的标志物，该检测简单易操作。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种用于检测高原缺氧损伤的生物标志物及其应用。所述生物标志物为N‑乙酰神经氨酸或其特异性抗体，用于制备检测高原缺氧的诊断试剂或试剂盒。通过血清标志物检测来判断机体高原缺氧程度的方法，有助于检测或辅助检测缺氧状态，从而有助于尽早采取相应治疗措施，方便快速，容易为病人接受，更便于动态监察高原人群的缺氧损伤进展。

技术研发人员：赵名;朱玲玲;成祥;赵彤;范明;周延召;韩莹;李改芬
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2018.09.06
技术公布日：2019.01.04