一种用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条及其制备与应用的制作方法
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条及其制备与应用。
背景技术：
空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)是继沙门菌、志贺菌之后的一个重要的人兽共患病原菌，可导致肠胃炎和食物中毒，是人类格林-巴利综合征的前驱因子，人类主要通过食用被其污染的食品而患病。空肠弯曲菌常常定植于家禽的肠道内，并随粪便排出，在禽肉的屠宰、加工、运输、销售等环节大规模流行，污染严重且不可避免。及时快速地检测出禽肉表面的空肠弯曲菌对于食源性病原菌的危害防控、公共卫生、畜牧兽医和出入境检验检疫意义重大。空肠弯曲菌的培养条件苛刻，传统细菌培养法是检测空肠弯曲菌的国标方法，但存在操作繁琐、特异性不强、费时费力等弊端；而以pcr为代表的分子生物学检测方法虽然灵敏度高，特异性强，但需以实验室为依托，检测结果容易出现假阳性，不适合于现场使用。研发一种快速、灵敏、特异、准确的空肠弯曲菌可视化实时检测方法对禽肉及禽肉制品安全监控和食源性病原菌的流行病学调查意义重大。
技术实现要素：
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条。所述试纸条能够在禽肉生产加工现场高效地检测出禽肉表面擦拭样中的空肠弯曲菌。本发明的试纸条以空肠弯曲菌的cjaa蛋白为检测靶标蛋白，将两种识别目的蛋白不同表位的单克隆抗体分别作为胶体金偶联抗体和检测抗体进行试纸条的组装，用于对禽肉表面擦拭样进行现场检测。所述试纸条便携快速，不受环境条件的干扰，检测时长只需10分钟；与非空肠弯曲菌无交叉反应；灵敏度高，最低空肠弯曲菌的检出浓度为100cfu/μl。本发明可实现禽肉样品中空肠弯曲菌的现场快速检测，适用于禽肉生产加工企业、检验检疫等单位。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条，包括支持板、以及位于支持板表面的从加样端依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层和吸水垫，所述金标垫上包含胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体i，所述硝酸纤维素膜检测层上包被有检测线和质控线。
一种实施方式中，所述支持板为pvc底板。
一种实施方式中，所述硝酸纤维素膜检测层上，所述检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一侧。
一种实施方式中，所述检测线上包被有空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ。
一种实施方式中，所述质控线上包被有羊抗鼠igg。
一种实施方式中，所述空肠弯曲菌单克隆抗体i的检测靶标为空肠弯曲菌cjaa蛋白，也就是说空肠弯曲菌单克隆抗体i是针对空肠弯曲菌cjaa蛋白的单克隆抗体。
一种实施方式中，所述空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ检测靶标是空肠弯曲菌cjaa蛋白，也就是说空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ是针对空肠弯曲菌cjaa蛋白的单克隆抗体。
一种实施方式中，所述空肠弯曲菌单克隆抗体i和所述空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ所识别的检测靶标的抗原表位不同。
一种实施方式中，所述空肠弯曲菌单克隆抗体i包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如seqidno.1～3所示的cdr区，所述重链包括氨基酸序列如seqidno.5～7所示的cdr区。
一种实施方式中，所述重链和轻链通过二硫键连接。
一种实施方式中，所述空肠弯曲菌单克隆抗体i，其轻链可变区的氨基酸序列为seqidno.4或其保守型变异序列，其重链可变区的氨基酸序列为seqidno.8或其保守型变异序列。
一种实施方式中，所述轻链可变区的编码核苷酸序列为seqidno.12或其保守型变异序列，所述重链可变区的编码核苷酸序列为seqidno.16或其保守型变异序列。
一种实施方式中，所述空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如seqidno.17～19所示的cdr区，所述重链包括氨基酸序列如seqidno.21～23所示的cdr区。
一种实施方式中，所述重链和轻链通过二硫键连接。
一种实施方式中，所述空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ，其轻链可变区的氨基酸序列为seqidno.20或其保守型变异序列，其重链可变区的氨基酸序列为seqidno.24或其保守型变异序列。
一种实施方式中，所述轻链可变区的编码核苷酸序列为seqidno.28或其保守型变异序列，所述重链可变区的编码核苷酸序列为seqidno.32或其保守型变异序列。
一种实施方式中，所述样品垫选用玻璃纤维素膜。
一种实施方式中，所述金标垫选用玻璃纤维素膜。
本发明的第二方面提供前述用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1)用胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体ⅰ喷涂金标垫，制得包含胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体ⅰ的金标垫；
2)在硝酸纤维素膜检测层的检测线和质控线上分别喷涂空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ及羊抗鼠igg，制得包被后的硝酸纤维素膜；
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜检测层、吸水垫依次粘贴在支持板上，切裁制得检测试纸条。
一种实施方式中，所述空肠弯曲菌单克隆抗体i的检测靶标为空肠弯曲菌cjaa蛋白，也就是说空肠弯曲菌单克隆抗体i是针对空肠弯曲菌cjaa蛋白的单克隆抗体。
一种实施方式中，所述空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ检测靶标是空肠弯曲菌cjaa蛋白，也就是说空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ是针对空肠弯曲菌cjaa蛋白的单克隆抗体。
一种实施方式中，所述空肠弯曲菌单克隆抗体i和所述空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ所识别的检测靶标的抗原表位不同。
一种实施方式中，所述样品垫选用玻璃纤维素膜。
一种实施方式中，所述金标垫选用玻璃纤维素膜。
本发明第三方面提供前述金标试纸条用于制备空肠弯曲菌检测产品的用途。
本发明的第四方面，提供一种空肠弯曲菌检测试剂盒，包括前述用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条和卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有试纸条卡槽，前述用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条嵌于所述试纸条卡槽内，所述上盖设有测试窗和加样孔，所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合，所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。
一种实施方式中，所述卡壳为塑料卡壳。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)简便快速，检测过程只需10分钟，适用于大批量样品的快速检测；
(2)特异性强，灵敏度高，空肠弯曲菌的最低检出浓度为100cfu/μl；
(3)携带方便，直接上样，无需样本前处理，所需的检测样本量少，适合现场检测；
(4)检测准确度高，可作为空肠弯曲菌细菌培养法的替代检测方案或互补方法；
(5)应用价值高，商业前景好，为禽肉生产加工现场空肠弯曲菌快速检测提供技术支撑。
附图说明
图1：本发明的用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条的结构示意图，其中1为支持板(可以是pvc底板)、2为样品垫、3为金标垫、4为硝酸纤维素膜检测层、5为检测线、6为质控线、7为吸水垫。
图2：本发明的用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条的灵敏度测试结果图。
图3：本发明的空肠弯曲菌检测的金标试纸条的交叉反应分析结果图。
图4：本发明的空肠弯曲菌检测的金标试纸条的稳定性测试结果图。
具体实施方式
胶体金免疫层析反应(goldimmunochromatographyassay，gica)是一种新兴的基于抗原抗体免疫反应、胶体金标记、蛋白层析的快速诊断技术，具有简便快速、结果可视，无需复杂的操作技巧、携带方便等优点，己成为体外诊断领域的研究热点，适用于现场检测。作为一种膜依赖的免疫分析技术，gica试纸条已被广泛地应用于小分子物质的检测，如农药残留，孕激素，血清中的抗体等。然而在大分子物质的检测领域，试纸条研发难度重重，尤其是细菌的检测。细菌的体积较大，层析膜的爬速和蛋白承载量有限，这均在一定程度上影响了抗原抗体的有效结合，并限制了体系的敏感性。再加上空肠弯曲菌苛刻的培养条件，大多数弯曲菌病都具有自限性。cjaa蛋白属于空肠弯曲菌abc型半胱氨酸转运系统，其大部分氨基酸暴露于外膜，本发明发现cjaa蛋白特异性好，保守性高、同源性高，可以作为空肠弯曲菌的检测靶标。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。
实施例1
1、空肠弯曲菌单克隆抗体i与空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的制备与获得
本发明中的空肠弯曲菌单克隆抗体i的检测靶标为空肠弯曲菌cjaa蛋白，也就是说空肠弯曲菌单克隆抗体i是针对空肠弯曲菌cjaa蛋白的单克隆抗体。本发明中的空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ检测靶标也是空肠弯曲菌cjaa蛋白，也就是说空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ是针对空肠弯曲菌cjaa蛋白的另一单克隆抗体。空肠弯曲菌单克隆抗体i和空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ所识别的检测靶标的抗原表位不同。
本发明通过杂交瘤细胞株筛选技术获得空肠弯曲菌单克隆抗体i与空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ，送公司进行测序鉴定。结果表明：
空肠弯曲菌单克隆抗体i的轻链可变区互补决定区1(cdr1)的氨基酸序列如seqidno.1所示，具体为：
rasqsisdylh。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的轻链可变区互补决定区2(cdr2)的氨基酸序列如seqidno.2所示，具体为：
yasqsis。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的轻链可变区互补决定区3(cdr3)的氨基酸序列如seqidno.3所示，具体为：
qnghsfplt。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.4所示，具体为：
mvstsqllglllfwtsasrcdivmtqspatlsvtpgdsvslscrasqsisdylhwyqqkshgsprllikyasqsisgipsrfsgsgsgsdftlsinsvepedvgvyycqnghsfpltfgagtklelk。
亦即空肠弯曲菌单克隆抗体i的轻链可变区含有127个氨基酸。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的重链可变区互补决定区1(cdr1)的氨基酸序列如seqidno.5所示，具体为：
syvif。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的重链可变区互补决定区2(cdr2)的氨基酸序列如seqidno.6所示，具体为：
yinpyndgtkydenfkg。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的重链可变区互补决定区3(cdr3)的氨基酸序列如seqidno.7所示，具体为：
simitrgwyfdv。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.所示，具体为：
mewswiflfllsgtagvhsevqlqqsgpelvkpgtsvkmsckasgytfisyvifwvkqkpgqglewigyinpyndgtkydenfkgkatltsdksssaaymelssltsedsavyycarsimitrgwyfdvwgagttvtvss。
亦即空肠弯曲菌单克隆抗体i的重链可变区含有140个氨基酸。
对应地，空肠弯曲菌单克隆抗体i的轻链可变区互补决定区1(cdr1)的核苷酸序列如seqidno.9所示，具体为：
agggccagccagtctattagcgactacttacac。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的轻链可变区互补决定区2(cdr2)的核苷酸序列如seqidno.10所示，具体为：
tatgcttcccaatccatctct。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的轻链可变区互补决定区3(cdr3)的核苷酸序列如seqidno.11所示，具体为：
caaaatggtcacagctttccgctcacg。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.12所示，具体为：
atggtgtccacttctcagctccttggacttttgcttttctggacttcagcctccagatgtgacattgtgatgactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagcgtctctctttcctgcagggccagccagtctattagcgactacttacactggtatcaacaaaaatcacatgggtctccaaggcttctcatcaaatatgcttcccaatccatctctgggatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggtcagatttcactctcagtatcaacagtgtggaacctgaagatgttggagtgtattactgtcaaaatggtcacagctttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa。
亦即空肠弯曲菌单克隆抗体i的轻链可变区的核苷酸序列含有381个碱基。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的重链可变区互补决定区1(cdr1)的核苷酸序列如seqidno.13所示，具体为：
agctatgttatcttt。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的重链可变区互补决定区2(cdr2)的核苷酸序列如seqidno.14所示，具体为：
tatattaatccttacaatgatggtactaaatacgatgagaacttcaaaggc。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的重链可变区互补决定区3(cdr3)的核苷酸序列如seqidno.15所示，具体为：
tcgattatgattacgaggggctggtacttcgatgtc。
空肠弯曲菌单克隆抗体i的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.16所示，具体为：
atggaatggagttggatatttctctttctcctgtcaggaactgcaggtgtccactctgaggtccagctgcagcagtctggacctgaactggtaaagcctgggacttcagtgaagatgtcctgtaaggcttctggatacacattcattagctatgttatcttttgggtgaagcagaagcctgggcagggccttgagtggattggatatattaatccttacaatgatggtactaaatacgatgagaacttcaaaggcaaggccacactgacttcagacaaatcctccagcgcagcctacatggagctcagcagcctgacctctgaggactctgcggtctattactgtgcaagatcgattatgattacgaggggctggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca。
亦即空肠弯曲菌单克隆抗体i的重链可变区的核苷酸序列含有420个碱基。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链可变区互补决定区1(cdr1)的氨基酸序列如seqidno.17所示，具体为：
kasdhinkwla。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链可变区互补决定区2(cdr2)的氨基酸序列如seqidno.18所示，具体为：
satslet。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链可变区互补决定区3(cdr3)的氨基酸序列如seqidno.19所示，具体为：
qqywstpwt。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.20所示，具体为：
mkfpsqlllfllfritgiicdiqmtqsssylsvslggrvtitckasdhinkwlawyqqkpgnaprllissatsletgvpsrfsgsgsgkdytlsitslqtedvatyycqqywstpwtfgggtkleik。
亦即空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链可变区含有127个氨基酸。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的重链可变区互补决定区1(cdr1)的氨基酸序列如seqidno.21所示，具体为：
sdvih。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的重链可变区互补决定区2(cdr2)的氨基酸序列如seqidno.22所示，具体为：
yfnpyndvtnynenfkg。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的重链可变区互补决定区3(cdr3)的氨基酸序列如seqidno.23所示，具体为：
sghaldy。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.24所示，具体为：
mewswiflfllsgtagvysevqlqqsgpelvkpgasmkmsckasgyiftsdvihwvrqkpgqglewigyfnpyndvtnynenfkgkatltsdkssstaymelssltsedsavyycarsghaldywgqgtsvtvss。
亦即空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的重链可变区含有135个氨基酸。
对应地，空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链可变区互补决定区1(cdr1)的核苷酸序列如seqidno.25所示，具体为：
aaggcaagtgaccacattaataaatggttagcc。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链可变区互补决定区2(cdr2)的核苷酸序列如seqidno.26所示，具体为：
agtgcaaccagtttggaaact。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链可变区互补决定区3(cdr3)的核苷酸序列如seqidno.27所示，具体为：
caacagtattggagtactccgtggacg。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.28所示，具体为：
atgaagtttccttctcaacttctgctcttcctgctgttcagaatcacaggcataatatgtgacatccagatgacacaatcttcatcctacttgtctgtgtctctaggaggcagagtcaccattacttgcaaggcaagtgaccacattaataaatggttagcctggtatcagcagaaaccaggaaatgctcctaggctcttaatatctagtgcaaccagtttggaaactggggttccttcaagattcagtggcagtggatctggaaaggattacactctcagcattaccagtcttcagactgaagatgttgctacttattactgtcaacagtattggagtactccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa。
亦即空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链可变区的核苷酸序列含有381个碱基。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的重链可变区互补决定区1(cdr1)的核苷酸序列如seqidno.29所示，具体为：
agcgatgttattcac。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的重链可变区互补决定区2(cdr2)的核苷酸序列如seqidno.30所示，具体为：
tattttaatccttacaatgatgttactaactacaatgagaacttcaaaggc。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的重链可变区互补决定区3(cdr3)的核苷酸序列如seqidno.31所示，具体为：
agcggacatgctttggactac。
空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.32所示，具体为：
atggaatggagttggatatttctctttctcctgtcaggaactgcaggtgtctactctgaggtccagctgcagcagtctggacctgagctggtaaagcctggggcttcaatgaagatgtcctgcaaggcttctggatacatattcactagcgatgttattcactgggtgaggcagaagcctgggcagggccttgagtggattggatattttaatccttacaatgatgttactaactacaatgagaacttcaaaggcaaggccacactgacttcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctcagcagcctgacctctgaagactctgcggtctattactgtgcaagaagcggacatgctttggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。
亦即空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的重链可变区的核苷酸序列含有405个碱基。
本领域技术人员在得知了空肠弯曲菌单克隆抗体i与空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ的轻链和重链序列后，通过常规的基因工程技术即可重复制备获得空肠弯曲菌单克隆抗体i与空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ。
例如，本发明采用如下基因工程重复制备获得空肠弯曲菌单克隆抗体i与空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ：
(1)将测序获得的抗体可变区编码序列用seamlesscloning方法将插入到表达载体中，获得重组表达载体；
(2)将获得的重组表达载体转化宿主细胞；
(3)在适合单克隆抗体表达的条件下培养步骤(2)所得转化后的宿主细胞；
(4)分离纯化获得单克隆抗体。
对获得的空肠弯曲菌单克隆抗体i与空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ进行测序鉴定，均表达正确，序列与预期一致。
2、胶体金溶液及金标单抗复合物的制备
(1)胶体金的制备
胶体金为现有技术，本领域技术人员可通过商购途径获得，也可自行制备获得。自行制备时，可通过如下方法：
采用柠檬酸三钠法制备胶体金纳米颗粒。在锥形瓶中加入200ml去离子水和2ml质量浓度为1％的氯金酸溶液，在均匀搅拌条件下加热至沸腾。快速加入3ml质量浓度为1％的柠檬酸三钠。氯金酸溶液依次由浅绿色变为黑色，最后变为红色后，继续加热10-15分钟，然后在室温中冷却，4℃避光保存待用。
(2)胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体i
取制备好的胶体金溶液10ml，用0.1m的k2co3调节ph值至8.0，搅拌中滴加265μg空肠弯曲菌单克隆抗体i，继续搅拌1小时。滴加0.5ml10％bsa溶液，搅拌反应0.5小时，随后滴加0.2ml10％peg-20000溶液，搅拌反应45分钟后于4℃静置过夜。最后将溶液4℃，1,500rpm离心15分钟，弃沉淀。将上清于4℃，10,000rpm，离心45分钟，弃上清并用1ml0.01mpb溶液(含有1％bsa和0.1％tritonx-100)重悬沉淀，获得胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体i。
2、抗体的喷涂与试纸条的组合
如图1所示，本发明的用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条包括支持板1(可以是pvc底板)、以及位于支持板表面的从加样端依次排列的样品垫2、金标垫3、硝酸纤维素膜检测层4和吸水垫7，所述金标垫上包含胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体i，所述硝酸纤维素膜检测层4上包被有检测线5和质控线6。所述硝酸纤维素膜检测层4上，所述检测线5位于离加样端较近一侧，质控线6位于离加样端较远一侧。所述检测线5上包被有空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ。所述质控线6上包被有羊抗鼠igg。
本发明的试纸条采用胶体金免疫层析技术，选用空肠弯曲菌单克隆抗体i作为固相物，利用双抗体夹心法检测样品中是否含有待测细菌。当待检样品中含有空肠弯曲菌时，抗原先与胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体i结合，并通过层析作用向前移动，当遇到检测线上的识别目的蛋白另一种抗原表位的空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ时，形成空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ-抗原-胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体i，在检测线上富集后形成红色沉淀线。没有和抗原结合的胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体i与质控线上包埋的羊抗鼠igg抗体结合，形成胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体i-二抗复合物，在质控线上富集，形成红色沉淀线。
制备时，
调试三维喷点膜喷金仪，将获得的胶体金标记的空肠弯曲菌单克隆抗体ⅰ均匀喷涂于玻璃纤维素膜上，喷液量为30μl/cm，室温干燥，，获得金标垫，封袋备用。将空肠弯曲菌单克隆抗体ⅱ(2mg/ml)和羊抗鼠igg(1.0mg/ml)分别均匀地喷在硝酸纤维素膜上，喷液量为0.7μl/cm，即得到检测线和质控线。将喷涂过抗体的硝酸纤维素膜，也就是硝酸纤维素膜检测层浸没于1％bsa溶液中，37℃水浴2小时，室温干燥，密封备用。将pvc底板、硝酸纤维素膜检测层、样品垫、金标垫、检测线、质控线和吸水垫组合，即得胶体金免疫层析试纸条，步骤简要如下：先将硝酸纤维素膜检测层粘在pvc底板的中间位置，然后将金标垫的前端粘贴压在硝酸纤维素膜检测层后端上约2mm处，再粘贴样品垫于pvc底板最末端并压住金标垫的后端，最后将吸水垫粘贴在pvc底板的最前端并使其末端压在硝酸纤维素膜检测层的前端，获得用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条(也可简称为胶体金试纸条或空肠弯菌胶体金免疫层析试纸条、或胶体金试纸条)。将试纸条切成3.8mm×60mm的规格，密封保存备用。
3、灵敏度测试
本发明的用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条的检测方法和结果判定依据如下：将待测样品溶液加入样品垫，10分钟后观察检测线和质控线的显色情况。如果检测线和质控线都显示出红色说明样品中有空肠弯曲菌；如果检测线处无红色条带而质控线处显示出红色则说明样品中没有空肠弯曲菌；如果质控线不出现条带，无论检测线是否出现红色条带，都代表试纸条体系失效。
通过空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌(表1和表2)菌悬液的加样测试检测已经制备好的用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条的特异性。将60μl待测样品溶液加入样品垫，10分钟后观察检测线和质控线的显色情况。实验重复3次。
复苏低温冻存的空肠弯曲菌标准株nctc11168，制备细菌悬液。将菌悬液10倍递增稀释至1.0×106cfu/μl-1.0×101cfu/μl这6个浓度，分别进行加样测试，设置空白对照组，考察试纸条的空肠弯曲菌检测下限，实验重复3次。结果显示，本发明的胶体金试纸条的空肠弯曲菌最低检出浓度为100cfu/μl(图2)。
4、交叉反应分析
通过空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌(表1和表2)菌悬液的加样测试检测本发明的胶体金试纸条的特异性。将60μl待测样品溶液加入样品垫，10分钟后观察检测线和质控线的显色情况。实验重复3次。
表1实验中使用的空肠弯曲菌
表2实验中使用的非空肠弯曲菌
anctc，中国医学微生物菌种保藏管理中心；
bcctcc，中国标准菌株保藏中心；
catcc，美国标准菌株保藏中心；
结果显示，本发明的胶体金试纸条检测空肠弯曲菌的特异性良好。96株空肠弯曲菌(包括标准株和分离株)的菌悬液检测结果均为阳性，试纸条与其它50株结肠弯曲菌、1株胎儿弯曲菌和9株非弯曲菌属的细菌无交叉反应(图3)。
5、稳定性测试
稳定性测试共设置2个实验组：批间稳定性测试组和批内稳定性测试组。每个测试组均包括5个阳性样品和5个阴性样品。批间稳定性测试组中的胶体金试纸条为不同批次制备的试纸条，批内稳定性测试组的试纸条为同一批次制备的胶体金试纸条。反应相同时间后，观察检测线和质控线的显色情况。实验重复3次。结果显示，胶体金试纸条的稳定性良好(图4)。
实施例2
采用本发明的空肠弯菌胶体金免疫层析试纸条检测样品中的空肠弯曲菌。
1.样品模拟检测
复苏低温冻存的空肠弯曲菌标准株nctc11168，收获细菌后，将细菌悬液10倍递增稀释至1.0×106cfu/μl-1.0×101cfu/μl这6个浓度，并设置空白对照组。取每个浓度的细菌悬液1ml，分别加入1g鸡的粪便样，混匀后作为模拟样本。吸取每个浓度的模拟菌液各60μl进行试纸条加样测试，同时以细菌培养法的检测结果作为对照。实验结果显示，本发明的胶体金试纸条的空肠弯曲菌最低检出浓度为100cfu/μl，模拟样本的检测灵敏度与空肠弯曲菌纯培养物的检测灵敏度一致，且试纸条检测出的空肠弯曲菌阳性模拟样本，细菌培养法也检测为阳性。
2.禽肉表面擦拭样中空肠弯曲菌的现场快速检测
在禽肉生产加工现场，采集猪肉表面擦拭样233份，使用pbs(灭菌，ph7.2)浸湿的棉球擦拭禽肉表面，随后放入无菌的塑料采样袋中。使用试纸条现场检测样品中的空肠弯曲菌时，挤压棉球样中的pbs，吸取60μl液体加入gica试纸条的样品垫。10分钟后观察试纸条的检测结果。随后将采样袋的袋口扎紧，即刻运回实验室，并通过传统细菌培养法检测采样袋中剩余样品中的空肠弯曲菌。
传统细菌培养法和胶体金试纸条法共检出空肠弯曲菌阳性样品35份(表3)，以传统细菌培养法的检测结果为标准，试纸条检测空肠弯曲菌的准确度为93％，可应用于大批量禽肉样品中空肠弯曲菌的现场快速检测。
表3胶体金试纸条检测禽肉表面擦拭样中空肠弯曲菌
综上所述，本发明所提供的胶体金免疫层析试纸条，可用于禽肉表面擦拭样中空肠弯曲菌现场快速检测。本发明的检测方法以空肠弯曲菌两种不同表位的单克隆抗体作为胶体金偶联抗体和检测抗体对空肠弯曲菌进行快速检测。该试纸条具有便携快速、操作简单、不受环境条件的干扰、特异性好、灵敏度高等优点，整个检测过程只需10分钟。本发明适用于禽肉加工企业、检验检疫等单位，并为空肠弯曲菌的实时大规模检测提供技术支持。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110>扬州大学
<120>一种用于空肠弯曲菌检测的金标试纸条及其制备与应用
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