用于诊断和治疗脑炎或癫痫的方法与流程

文档序号：16516678发布日期：2019-01-05 09:40阅读：567来源：国知局

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年9月29日提交的第61/246,843号美国临时专利申请的优先权，该申请以其整体通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及用于在对象中诊断和治疗自身免疫性脑炎或癫痫的方法，其使用针对抑制性γ-氨基丁酸-b(gabab)受体的抗体。

发明背景

突触可塑性是神经元的基本特性，其构成记忆、学习和认知机制的基础。可塑性依赖于离子通道和突触受体间复杂的相互作用，所述受体包括兴奋性谷氨酸n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(ampar)。这些受体被药物学或遗传学阻断的动物模型产生严重改变的记忆、学习、行为和癫痫发作。因此，可预期针对这些受体的胞外结构域的免疫应答将导致相似的症状。事实上，最近鉴定的两种与nmdar的nr1亚基和ampar的glur1/2亚基的胞外表位的抗体相关的疾病导致了表现出突出的精神、行为和记忆问题的脑炎，其通常伴有癫痫发作。在这两种突触自身免疫中，每一抗体均在培养的神经元中引起靶受体水平剧烈和特异的降低，表明它们是致病性的。此外，神经系统综合征通常响应治疗，并且在某些患者中免疫应答作为表达靶受体的肿瘤的副肿瘤表现而发生，其在许多方面与神经肌肉突触的自身免疫性疾病(如，兰伯特-伊顿(lambert-eaton)综合征和重症肌无力)类似。这些发现以及某些疾病(如，抗nmdar脑炎)显著的特异性和高频率的抗体综合征已经引起对其它记忆和行为受损和频繁发生癫痫发作的综合征的注意。在某些此类综合征中，经验性免疫疗法的临床疗效、表明边缘叶脑炎的脑脊液(csf)磁共振成像(mri)结果或针对仍未知的神经元胞外抗原的抗体的检出提示了免疫介导的发病机理。

对多种抗原功能的更好的理解可以帮助改进治疗策略。然而，对目前面临这些患者的临床医生，影响神经系统疗效的最好的机会取决于：(1)对疾病的快速诊断，(2)肿瘤的早期发现和治疗，和(3)免疫疗法的使用。因此，存在对改进的诊断和治疗自身免疫性脑炎或癫痫发作的方法的需要。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断对象中的脑炎的方法，其包括步骤：从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对gabab受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表自身免疫性脑炎，从而确定所述对象中脑炎的病因。在示例性的实施方案中，所述抗体结合gabab受体的b1亚基。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断对象中与自身免疫性脑炎相关的隐匿性肿瘤的方法，其包括步骤：从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对gabab受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述隐匿性肿瘤，并且该肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断对象中的癫痫的方法，其包括步骤：从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对gabab受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在肿瘤，并且所述肿瘤是所述癫痫的病因，从而诊断所述对象中的所述癫痫。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断患有癫痫的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤：从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对gabab受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在肿瘤，从而诊断所述患有癫痫的对象中的所述肿瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗对象中的自身免疫性脑炎的方法，其包括步骤：通过测试来自所述对象的体液中的针对gabab受体的抗体来检测与所述自身免疫性脑炎相关的肿瘤，其中在所述体液中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因；和治疗所述肿瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于检测针对gabab受体的抗体的方法，其中所述抗体的检出导致用免疫疗法来治疗癫痫或脑炎。

通过以下详细描述的实施例和附图，本发明其它的特点和优势将显而易见。然而，应理解详细的说明书和具体的实施例在表明本发明优选的实施方案的同时仅以说明性的方式给出，因为根据本详细说明书在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对本领域技术人员将是显而易见的。

附图概述

本专利或申请文件包含至少一幅彩色形式附图。在提出要求并支付必要的费用后，将提供含有彩色附图的本专利或专利申请出版物的拷贝。

图1显示了具有针对gabab受体的抗体并患有边缘叶脑炎的患者的mri。在初诊(presentation)时(a)拍摄的来自病例1的轴位flair脑mri，在内侧颞叶(箭头)显示了增强的信号，在左侧更显著。1个月后的重复研究(b)显示了改善。在初诊后的3个月和9个月后的重复研究(c，d)是稳定的。

图2显示了用患者的抗体免疫标记的大鼠脑。用患有边缘叶脑炎的患者的csf抗体免疫染色的大鼠脑矢状切面。在海马、丘脑、小脑和大脑皮质的神经毡中观察到广泛的染色。

图3显示了患者的抗体与胞外表位反应并沉淀gabab受体的b1和b2亚基。将大鼠海马神经元培养物(活的，非透化处理的)与患有le的患者的csf孵育。深色的点样反应代表患者的抗体与细胞表面抗原(a)；标尺＝10μm。使用患者的抗体沉淀的这些抗原示于用ezblue可视化蛋白质的凝胶中(b)。患者的抗体(p)沉淀了2条在～105-90kda的蛋白质条带；使用来自对照个体(n)的csf的沉淀中见不到这些条带。使用质谱分析对所有条带进行测序，确定了gabab受体的b1和b2亚基。其它较小的条带为蛋白降解片段和患者的免疫球蛋白g(igg)。随后将凝胶转移至硝酸纤维素膜并用特异性针对每一gabab亚基的单克隆抗体进行免疫印迹，确定了患者的抗体可沉淀b1和b2亚基(d)。

图4显示了患者的抗体在神经元突触中特异性地识别gabab受体。用患者抗体(绿色)、针对gabab1受体胞内表位的豚鼠多克隆抗体(红色)和突触前标记物巴松管蛋白(basson)(蓝色)三重标记的培养的大鼠胚胎海马神经元的共聚焦图像(a)。来自同一神经元的树突区域显示了患者的抗体染色(b)、豚鼠多克隆gabab1受体抗体染色(c)、患者和豚鼠抗体染色(d)和三重染色(e)。24个神经元树突的共定位标记定量示于(f)。

图5显示了使用基于hek293细胞的测定检测针对gabab1亚基的抗体。用gabab受体b1和b2亚基转染的hek293细胞显示了对来自患有边缘叶脑炎的患者的csf(a)和针对gabab受体b1亚基的多克隆抗体(b)的反应性；两种反应性整合在(c)中。同样的细胞不与来自对照个体(d)的csf反应；反应性整合在(f)中。免疫荧光法；×400倍。

图6显示了小细胞肺癌的gabab受体表达。用针对gabab1受体的多克隆抗体和生物素标记的来自具有针对gabab1受体的抗体的患者的igg免疫染色两个sclc(a，c)的连续切面。两种抗体显示了混合的免疫染色，表明在两个sclc中都表达gabab1受体。抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶方法；用苏木精轻度复染的切面；×400倍。

图7显示了使用基于hek293细胞的测定检测gababr-ab。转染hek293细胞使其表达gabab1/b2受体并且与患者活的非透化处理的csf孵育。之后，固定细胞并且与针对gabab受体b1亚基的胞内表位的多克隆抗体孵育。注意到患者的csf将特异性表达gabab受体的细胞的细胞表面染色(a)，如通过胞内报告抗体证实的那样(b)。两者的反应性整合示于c。细胞核用dapi复染。标尺＝20μm。

图8显示了与具有gababr-ab的患者的csf体内孵育的大鼠海马神经元的初级培养物。在神经元细胞膜中存在深色点状反应。标尺＝20μm。

发明详述

本发明涉及用于在对象中诊断和治疗自身免疫性脑炎或癫痫的方法，其使用针对gabab受体的抗体。

在一个实施方案中，本文提供的是用于诊断对象中脑炎的方法，其包括步骤：从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对gabab受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表自身免疫性脑炎，从而确定所述对象中脑炎的病因。在另一个实施方案中，本文提供的是用于诊断对象中与自身免疫性脑炎相关的肿瘤的方法，其包括步骤：从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对gabab受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在隐匿性肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因。

在另一个实施方案中，本文提供的是用于诊断对象中的癫痫的方法，其包括步骤：从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对gabab受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在肿瘤，并且所述肿瘤是所述癫痫的病因，从而诊断该对象中的该癫痫。在另一个实施方案中，本文提供的是用于诊断患有癫痫的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤：从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对gabab受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述肿瘤，从而诊断所述患有癫痫的对象中的所述肿瘤。

在另一个实施方案中，本文提供的是用于治疗对象中的自身免疫性脑炎的方法，其包括步骤：通过测试来自所述对象的体液中的针对gabab受体的抗体来检测与所述自身免疫性脑炎相关的肿瘤，其中在所述体液中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因；和治疗所述肿瘤。

在一个实施方案中，本发明提供了确定对象中的脑炎病因的方法，其包括步骤：测试所述对象的体液中的针对gabab受体的抗体，从而在对象中确定脑炎的病因。在另一个实施方案中，在体液中存在gabab受体b1亚基的抗体代表该脑炎为自身免疫病源的。在另一个实施方案中，在体液中存在gabab受体b2亚基的抗体代表所述脑炎为自身免疫病源的。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本文提供的方法和组合物有利于对严重形式的自身免疫性脑炎的识别，所述脑炎通常对治疗有响应。在另一个实施方案中，本文描述的方法和组合物强调了自身免疫可影响行为的概念，尤其是针对gabab受体的抗体可能改变情感(在一个实施方案中)或记忆，意识或它们的组合(在其它独立的实施方案中)。

在另一个实施方案中，本发明提供了确定对象中自身免疫性脑炎病因的方法，其包括步骤：测试所述对象的体液中的针对gabab受体的抗体，从而确定对象中自身免疫性脑炎的病因。在另一个实施方案中，在对象中存在抗体代表存在肿瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是自身免疫性脑炎的病因。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供了诊断对象中自身免疫性脑炎的方法，其包括步骤：测试对象的体液中的针对gabab受体b1亚基的抗体，从而诊断所述对象中的所述自身免疫性脑炎。

在本文描述的方法中使用的生物学样品为通过本发明的方法测试的体液，在另一个实施方案中为脑脊液(csf)。在另一个实施方案中，所述体液为血浆。在另一个实施方案中，体液为本领域已知的任何其它类型的流体。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，生物学样品是羊水、血液、血清、唾液或在另一个实施方案中为它们的组合。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的脑炎为自身免疫性脑炎。在一个实施方案中，自身免疫性脑炎是副肿瘤脑炎。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎为非副肿瘤脑炎。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎为副肿瘤自身免疫性脑炎。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎为非副肿瘤自身免疫性脑炎。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎为本领域已知的任何其它类型的自身免疫性脑炎。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在一个实施方案中，通过本文描述的方法诊断副肿瘤抗gabab脑炎的频率是未知的。在另一个实施方案中，副肿瘤抗gabab脑炎频繁地未被识别。这可能是由若干令该疾病在副肿瘤脑炎中独特的特征所引起的，包括在一个实施方案中，20岁～50岁之间的相对年轻的女性，或在另一个实施方案中，罕见的具有突出精神病学症状的表现，或在另一个实施方案中，正常或非典型的mri结果，其在75％的病例中由轻度、短暂的内侧颞叶外侧t2或flair异常组成，其在某实施方案中伴有皮质增强，或还在另一个实施方案中，伴有卵巢肿瘤的良性表现。在一个实施方案中，使用本文描述的方法诊断任何表现出上文描述的症状的对象。

在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎为边缘叶脑炎。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与边缘性机能失调相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与边缘性机能失调无关。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在一个实施方案中，边缘叶脑炎引起典型地由快速和严重短期记忆丧失主导的令人印象深刻的缺陷。在另一个实施方案中，患者在成年后生活中显示了亚急性的脑炎，其主要影响边缘区域，在一个实施方案中其显示为癌症。在一个实施方案中，术语“边缘叶脑炎”指对象显示出严重的短期记忆丧失和与支气管癌相关的痴呆。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的自身免疫性脑炎与癫痫发作相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与间脑综合征相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与精神病学症状相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与认知异常相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与行为异常相关。

在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与健忘症相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与记忆障碍相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与记忆问题相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与运动功能减退综合征相关。

在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与运动障碍相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与异常运动相关。在另一个实施方案中，运动障碍为本领域已知的任何其它运动障碍。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与意识水平下降相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与肺换气不足相关。

在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与脑或脊髓任何部分机能失调相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与任何上述症状或疾病的组合相关。每一类型的脑炎代表了本发明独立的实施方案。

在一个实施方案中，自身免疫性脑炎与肿瘤相关。在一个实施方案中，肿瘤为肺癌或小细胞肺癌(sclc)型神经内分泌肿瘤。在另一个实施方案中，肿瘤为卵巢畸胎瘤。在另一个实施方案中，肿瘤为胸腺肿瘤。

在另一个实施方案中，肿瘤为睾丸肿瘤。在另一个实施方案中，与脑炎相关的癌症为子宫颈癌肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为头颈癌肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为乳腺癌肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为肛门生殖器癌肿瘤。

在另一个实施方案中，癌症为黑色素瘤。在另一个实施方案中，癌症为肉瘤。在另一个实施方案中，癌症为恶性肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为淋巴瘤。在另一个实施方案中，癌症为白血病。在另一个实施方案中，癌症为间皮瘤。在另一个实施方案中，癌症为神经胶质瘤。在另一个实施方案中，癌症为生殖细胞瘤。在另一个实施方案中，癌症为绒毛膜癌。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，癌症为胰腺癌。在另一个实施方案中，癌症为卵巢癌。在另一个实施方案中，癌症为胃癌。在另一个实施方案中，癌症为胰腺的恶性病变。在另一个实施方案中，癌症为肺腺癌。在另一个实施方案中，癌症为结直肠腺癌。在另一个实施方案中，癌症为肺鳞腺癌。在另一个实施方案中，癌症为胃腺癌。在另一个实施方案中，癌症为卵巢表面上皮肿瘤(如，其良性增生或恶性变种)。在另一个实施方案中，癌症为口腔鳞状细胞癌。在另一个实施方案中，癌症为小细胞肺癌。在另一个实施方案中，癌症为子宫内膜癌。在另一个实施方案中，癌症为膀胱癌。在另一个实施方案中，癌症为头颈癌。在另一个实施方案中，癌症为前列腺癌。

在另一个实施方案中，癌症为急性骨髓性白血病(aml)。在另一个实施方案中，癌症为骨髓增生异常综合征(mds)。在另一个实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(nsclc)。在另一个实施方案中，癌症为韦氏肿瘤(wilm′stumor)。在另一个实施方案中，癌症为白血病。在另一个实施方案中，癌症为淋巴瘤。在另一个实施方案中，癌症为促纤维增生性小圆细胞肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为间皮瘤(如恶性间皮瘤)。在另一个实施方案中，癌症为胃癌。在另一个实施方案中，癌症为结肠癌。在另一个实施方案中，癌症为肺癌。在另一个实施方案中，癌症为乳腺癌。在另一个实施方案中，癌症为生殖细胞瘤。在另一个实施方案中，癌症为卵巢癌。在另一个实施方案中，癌症为子宫癌。在另一个实施方案中，癌症为甲状腺癌。在另一个实施方案中，癌症为肝细胞癌。在另一个实施方案中，癌症为甲状腺癌。在另一个实施方案中，癌症为肝癌。在另一个实施方案中，癌症为肾癌。在另一个实施方案中，癌症为kaposis肉瘤。在另一个实施方案中，癌症为肉瘤。在另一个实施方案中，癌症为另一恶性肿瘤或肉瘤。

在另一个实施方案中，肿瘤为本领域已知的任何其它类型的肿瘤。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供了确定对象中癫痫病因的方法，其包括步骤：测试所述对象的体液中的针对gabab受体的抗体，从而确定该对象中所述癫痫的病因。在另一个实施方案中，抗体代表在对象中存在肿瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是癫痫的病因。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的癫痫为原发性癫痫。在另一个实施方案中，癫痫响应igg消除疗法。在另一个实施方案中，癫痫与部分性发作相关。在另一个实施方案中，癫痫与简单部分性发作相关。在另一个实施方案中，癫痫与复杂部分性发作相关。在另一个实施方案中，癫痫与全身性发作相关。在另一个实施方案中，癫痫与失神发作(小发作)相关。在另一个实施方案中，癫痫与肌阵挛性发作相关。在另一个实施方案中，癫痫与强直阵挛发作(大发作)相关。

在另一个实施方案中，癫痫与west综合征相关。在另一个实施方案中，癫痫与lennox-gastaut综合征相关。在另一个实施方案中，癫痫与本领域已知的任何其它综合征相关。

在另一个实施方案中，癫痫无已知病因。在另一个实施方案中，癫痫为本领域已知的任何其它类型的癫痫。每一类型的癫痫代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎、癫痫等的“病因”，是指所述疾病的主要病因。在另一个实施方案中，该术语是指对所述疾病有贡献的病因。在另一个实施方案中，该术语是指间接的病因。在另一个实施方案中，该术语是指通过肿瘤诱导的免疫应答形成的病因。在另一个实施方案中，该术语是指所述疾病显著的病因。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断患有脑炎的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤：在所述测试对象的体液中针对gabab受体的抗体，从而诊断所述患有脑炎的对象中的肿瘤。在另一个实施方案中，在对象中存在所述抗体代表存在肿瘤。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于检测患有脑炎的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤：测试所述对象的体液中的针对gabab受体的抗体，从而检测所述患有脑炎的对象中的所述肿瘤。在另一个实施方案中，在对象中存在所述抗体代表存在肿瘤。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断患有癫痫的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤：测试所述对象的体液中的针对gabab受体的抗体，从而诊断所述患有癫痫的对象中的所述肿瘤。在另一个实施方案中，在对象中存在所述抗体代表存在肿瘤。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在一个实施方案中，本发明提供了用于检测患有癫痫的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤：测试所述对象的体液中的针对gabab受体的抗体，从而检测所述患有癫痫的对象中的所述肿瘤。在另一个实施方案中，在对象中存在所述抗体代表存在肿瘤。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在一个实施方案中，本发明提供了诊断或检测对象中的gabab介导的疾病的方法，其包括步骤：测试所述对象的体液中的针对gabab受体的抗体的抗体，从而诊断或检测所述对象中的所述gabab介导的疾病。

gabab受体通过两种机制介导突触前抑制：激活g蛋白质偶联的内向整流型钾离子通道(girk)和抑制钙离子通道。它们还减少突触前放电频率。在突触后，gabab受体通过相似的机制和通过诱导慢抑制性突触后电位(ipsp)介导抑制。在神经元网络水平，gabab受体通过限制网络高活性状态的持续时间、预防过度的神经元同步化和允许新刺激打破同步活性来调节其活性。gabab受体广泛地分布于脑和脊髓，但在海马、丘脑和小脑尤其丰富，其为用患者的抗体免疫标记大鼠脑更深色的区域。患者的抗体主要的自身抗原，gabab1亚基，对结合gaba(和受体功能)是必须的，而gabab2亚基是将该受体定位于细胞膜适当的区域和与g蛋白偶联所需要的。在转基因小鼠中gabab1缺失导致显著的癫痫发作、记忆障碍和焦虑行为增加。遗传学和药物学证据都支持gabab受体在控制焦虑和调节情绪中的重要作用。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗对象中自身免疫性脑炎的方法。在一个实施方案中，所述方法包括步骤：通过测试来自所述对象的体液中的针对gabab受体的抗体来检测与自身免疫性脑炎相关的肿瘤，其中在所述对象中存在所述抗体代表存在所述肿瘤，并且该所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因。在另一个实施方案中，所述方法包括治疗所述肿瘤的步骤。在另一个实施方案中，在早期阶段期间治疗所述肿瘤。在另一个实施方案中，在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的4个月内治疗肿瘤。在另一个实施方案中，在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的3个月内治疗肿瘤。在另一个实施方案中，在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的2个月内治疗肿瘤。在另一个实施方案中，在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的1个月内治疗肿瘤。

在一个实施方案中，治疗所述肿瘤的步骤包括去除该肿瘤。在另一个实施方案中，治疗所述肿瘤的步骤包括免疫治疗。在另一个实施方案中，治疗所述肿瘤的步骤包括联合免疫治疗去除该肿瘤。在另一个实施方案中，治疗所述肿瘤的步骤包括化学治疗。在另一个实施方案中，治疗所述肿瘤的步骤包括联合化学治疗去除该肿瘤组合。

在一个实施方案中，gabab受体包括亚基。在另一个实施方案中，gabab受体由b1和b2亚基的异聚体形成。在另一个实施方案中，需要两种亚基来产生功能性的受体，其包含b1和b2亚基。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的b1亚基为b1-a亚基。在另一个实施方案中，受体以b1亚基和b2亚基的异聚体存在。在一个实施方案中，b1与b2组合以形成具有不同药物学特性、定位和与胞内信使相互作用的能力的受体亚型。

在另一个实施方案中，b1亚基是gabab受体多聚体的单体。在另一个实施方案中，多聚体为包含两或多个亚基的同聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含两个b1亚基的同二聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含b1亚基的异聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含b1亚基和b2亚基的异聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含b1-a亚基和b2亚基的异聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含b1-b亚基和b2亚基的异聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含b1-c亚基和b2亚基的异聚体。

在一个实施方案中，gabab受体的b1亚基具有如下所示的序列：

在另一个实施方案中，gabab受体的b1亚基具有如下所示的序列：

在另一个实施方案中，b1亚基是seqidno：1、2或3的同源物。在另一个实施方案中，b1亚基是seqidno：1、2或3的变体。在另一个实施方案中，b1亚基是seqidno：1、2或3的异构体。在另一个实施方案中，b1亚基是seqidno：1、2或3的片段。在另一个实施方案中，b1亚基包含seqidno：1、2或3。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，gabab受体的b1亚基由具有如下序列的核苷酸序列编码：

在另一个实施方案中，b1亚基由与seqidno：4、5或6同源的核苷酸分子编码。在另一个实施方案中，所述核苷酸分子是seqidno：4、5或6的变体。在另一个实施方案中，所述核苷酸分子是seqidno：4、5或6的异构体。在另一个实施方案中，所述核苷酸分子是seqidno：4、5或6的片段。在另一个实施方案中，所述核苷酸分子包含seqidno：4、5或6。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的方法检测的抗体所识别的表位是构象表位。在另一个实施方案中，所述表位为线性表位。在另一个实施方案中，所述表位为本领域已知的任何其它类型的表位。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在一个实施方案中，在畸胎瘤包含的神经组织中异位表达b1亚基有助于阻断免疫耐受。在另一个实施方案中，因子的组合(如在大多数对象中存在的病毒样疾病潜伏期和在某些实施方案中的遗传易感性)在使用本文描述的诊断方法测试的初始免疫应答中发挥额外的作用。

在一个实施方案中，患者的症状与抗体滴度之间的相关性显示了b1抗体在副肿瘤抗gabab脑炎中的致病作用。

在另一个实施方案中，对象显示与胞外神经元抗原反应的抗体。在另一个实施方案中，对象显示与暴露于神经元细胞表面的抗原反应的抗体。在另一个实施方案中，在本文使用的条件下，具有针对胞外抗原的抗体的患者显示对免疫疗法增强的应答。

在另一个实施方案中，本发明的方法利用、检测或测试由本文公开的方法鉴定的靶抗原。在另一个实施方案中，通过文库筛选技术鉴定靶抗原。在另一个实施方案中，通过cdna文库筛选鉴定靶抗原。在另一个实施方案中，通过与培养的神经元的反应性鉴定靶抗原。在另一个实施方案中，通过患者的抗体免疫沉淀鉴定靶抗原。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供了诊断对象中的脑炎的方法，其包括步骤：从所述对象获得生物学样品；和测试该生物学样品中的针对gabab受体b1亚基的抗体，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表存在自身免疫性脑炎，从而确定所述对象中脑炎的病因。

在另一个实施方案中，本发明提供了诊断对象中与自身免疫性脑炎相关的肿瘤的方法，其包括步骤：从对象获得生物学样品；和测试该生物学样品中针对gabab受体b1亚基的抗体，其中存在所述抗体代表在所述对象中存在隐匿性肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因。

在另一个实施方案中，本发明提供了诊断对象中的癫痫的方法，其包括步骤：从对象获得生物学样品；和测试该生物学样品中针对gabab受体b1亚基的抗体的存在，其中存在所述抗体代表在所述对象中存在肿瘤，并且所述肿瘤是所述癫痫的病因，从而诊断对象中的癫痫。

在另一个实施方案中，本发明提供了诊断患有癫痫的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤：从对象获得生物学样品；和测试该生物学样品中针对gabab受体b1亚基的抗体的存在，其中存在所述抗体代表在所述对象中存在肿瘤，从而诊断所述患有癫痫的对象中的肿瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗对象中的自身免疫性脑炎的方法，其包括步骤：通过测试来自对象的体液中的针对gabab受体b1亚基的抗体来检测与自身免疫性脑炎相关的肿瘤，其中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因；和治疗所述肿瘤。在另一个实施方案中，在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的4个月内治疗肿瘤。

用于测试体液针对神经元抗原的反应性的方法是本领域众所周知的。在一个实施方案中，使用酶联免疫吸附试验(elisa)测试抗体的存在。在另一个实施方案中，使用免疫组织化学测试抗体的存在。在另一个实施方案中，使用免疫沉淀测试抗体的存在。在另一个实施方案中，利用了本文例举的方法中的一种。在另一个实施方案中，用pfa固定神经元组织。在另一个实施方案中，利用了本领域已知的任何其它方法。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括用于实施本发明的方法的化合物或组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括本发明的组合物、工具或仪器。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

用于抗体检测的方法和试剂盒为本领域众所周知的，并描述于，例如，ancesbm等人(treatment-responsivelimbicencephalitisidentifiedbyneuropilantibodies：mriandpetcorrelates.brain2005；l28：1764-1777)和vitaliani等人(paraneoplasticencephalitis，psychiatricsymptoms，andhypoventilationinovarianteratoma.annneurol2005；58：594-604.)。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

用于诊断边缘叶脑炎(le)的方法是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，患有le的患者发展出亚急性的精神错乱、易怒、抑郁、睡眠障碍、癫痫发作、短期记忆丧失和/或痴呆。在另一个实施方案中，le的病理学基础为主要涉及边缘性系统(海马、杏仁核和扣带回)的炎症性疾病。在另一个实施方案中，活检和尸检研究证实了t细胞和较低频率b细胞的间质和外周血管浸润，以及小胶质细胞活化、神经元退化和/或神经胶质增生。在另一个实施方案中，在远离边缘性系统的区域发现了炎症性浸润。在另一个实施方案中，浸润保持为轻度的和临床沉默的。在另一个实施方案中，浸润变得显著并发展成为称作脑脊髓炎的疾病。另外的诊断le的方法在，例如，gultekinsh等人(paraneoplasticlimbicencephalitis：neurologicalsymptoms，immunologicalfindingsandtumourassociationin50patients.brain2000；123：1481-1494)中描述。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的抗原与本文公开的肽是同源的。当涉及任何蛋白质或肽时，在一个实施方案中，术语“同源性”、“同源的”等是指，在将序列比对并引入缺口(如果需要的话)以实现同源性最大百分比，并不将任何保守取代考虑为序列相同性的部分之后，候选序列与对应的天然多肽的残基为相同的氨基酸残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。

在另一个实施方案中，通过用于序列比对的计算机算法确定同源性，该算法通过本领域已很好描述的方法建立。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可包括对任何数量的可用的软件包，如，例如，blast、domain、beauty(blast增强的比对应用程序)、genpept和trembl包的利用。

在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自seqidno：1-6的序列具有超过70％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自seqidno：1-6的序列具有超过72％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过75％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自seqidno：1-6的序列具有超过78％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过80％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过82％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自seqidno：1-6的序列具有超过83％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过85％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过87％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自seqidno：1-6的序列具有超过88％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过90％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过92％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自seqidno：1-6的序列具有超过93％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过95％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自seqidno：1-6的序列具有超过96％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过97％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过98％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有超过99％的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与seqidno：1-6之一具有100％的相同性。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，通过确定候选序列杂交来确定同源性，其方法在本领域已很好描述(见，例如，“nucleicacidhybridization”hames，b.d.和higginss.j.，eds.(1985)；sambrook等人，2001，molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborpress，n.y.；和ausubel等人，1989，currentprotocolsinmolecularbiology，greenpublishingassociatesandwileyinterscience，n.y)。在其它实施方案中，在对于编码天然半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)肽的dna的互补而言中度至严格的条件下实施杂交方法。杂交条件为，例如，在包含10-20％甲酰胺、5×ssc(150mm氯化钠，15mm柠檬酸三钠)、50mm磷酸钠(ph7.6)、5×denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml已变性剪切的鲑鱼精dna的溶液中于42℃孵育过夜。

在另一个实施方案中，通过本领域已很好描述的方法确定本文中列出的任何氨基酸(aa)序列的蛋白质和/或肽同源性，该方法包括免疫印迹分析，或通过计算机算法分析aa序列，其通过已建立的方法，利用许多可用的软件包中的任何一个。例如，一些这种包包括fasta、blast、mpsrch或scanps包，以及在另一个实施方案中，利用smith和waterman算法和/或全局/局部或blocks算法用于分析的用途。每一确定同源性的方法代表了本发明独立的实施方案。

在本发明的另一个实施方案中，“核酸”或“核苷酸”是指一串至少2个碱基-糖-磷酸的组合。在一个实施方案中，该术语包括dna和rna。在一个实施方案中，“核苷酸”是指核酸多聚物的单体单位。在一个实施方案中，rna处于trna(转运rna)、snrna(小核rna)、rrna(核糖体rna)、mrna(信使rna)、反义rna、小抑制rna(sirna)、微rna(mirna)和核酶(ribozymes)的形式。已经描述了sirna和mirna的用途(caudyaa等人，genes&devel16：2491-96和其中引用的参考文献)。在其它实施方案中，dna可以处于质粒dna、病毒dna、线性dna或染色体dna，或这些组的衍生物的形式。此外，这些形式的dna和rna可为单、双、三或四链的。在另一个实施方案中，所述术语还包括含有其它形式的骨架但相同碱基的人工核酸。在一个实施方案中，所述人工核酸为pna(肽核酸)。在一个实施方案中，pna含有肽骨架和核苷酸碱基，并且能与dna和rna分子相结合。在另一个实施方案中，核苷酸为环氧丙烷修饰的。在另一个实施方案中，通过将一或多个磷酸二酯键替换为硫代磷酸酯键来修改核苷酸。在另一个实施方案中，人工核酸含有本领域已知的天然核酸磷酸骨架的任何其它变体。硫代磷酸酯核酸和pna的用途为本领域技术人员已知的，并且已在，例如，neilsenpe，curropinstructbiol9：353-57；和raznk等人，biochembiophysrescommun.297：1075-84中描述。核酸的产生和用途为本领域技术人员已知的，并且已在，例如，molecularcloning，(2001)，sambrook和russell，eds.andmethodsinenzymology：methodsformolecularcloningineukaryoticcells(2003)purchioandg.c.fareed中描述。每一核酸衍生物代表了本发明独立的实施方案。

实施例

实施例1：gabab受体是具有显著癫痫发作的严重边缘叶脑炎的新自身抗原

材料与方法

患者和对照。本申请的发明人研究了410个怀疑为副肿瘤脑炎或针对神经元细胞表面抗原的免疫介导的脑炎的患者。在357个中鉴定到抗体：257个具有针对nmdar的nr1亚基的抗体，27个具针对电压门控钾离子通道(vgkc)的抗体，19个具针对谷氨酸脱羧酶(gad)的抗体，15个具针对ampar的glur1/2亚基的抗体，11个具针对ma2的抗体，8个具针对hud的抗体和2个具针对crmp5的抗体。在剩下的53个患者中，15个具有针对主要在大鼠脑神经毡可见的神经元细胞表面抗原的血清或csf抗体，全部显示了相似的免疫染色。指示病例(#1患者)的这些特征和其对治疗的剧烈响应将目前的研究集中于这15个患者。信息由作者获得或由咨询医师提供。来自104个患者的csf或血清，包括从上述随机选取的91个和作为对照的患有gad-抗体相关的综合征的13个。

动物组织、抗体和大鼠脑免疫组织化学。对雌性wistar大鼠实施安乐死并移除脑，进行矢状切片，浸入4％的多聚甲醛中于4℃2小时，在40％蔗糖中冷冻保护(cryoprotected)24小时，并且在冷冻的异戊烷中速冻。

大鼠脑和人体组织的免疫组织化学。将石蜡包埋的组织脱蜡并恢复抗原。将7微米厚的冷冻(或4μm的石蜡)组织切片连续地与0.3％h2o2孵育20分钟，与10％山羊血清孵育1小时，并与患者或对照的血清(1∶250)、csf(1∶10)或针对gabab受体的胞内表位的豚鼠多克隆抗体(1∶200；invitrogen，carlsbad，ca)4℃孵育过夜。在使用适当的二抗(全部1∶2000)后，用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶方法显影反应。在荧光显微镜下使用zeissaxiovision软件(zeiss，thornwood，ny)拍摄结果。

利用从患者的血清纯化并使用生物素标记的igg对人体组织(sclc肿瘤)进行免疫组织化学。这些研究中不需要二抗，避免了由存在于所述组织中的无关的人igg引起的背景。

用患者或对照的血清(1∶250)、csf(1∶10)或gabab1抗体对大鼠脑冷冻切片进行免疫组织化学，其使用标准的抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶方法，或随后使用适当的alexafluor二抗将患者的血清(或csf)和gabab1抗体双重免疫标记。

神经元培养物和kek293细胞的免疫组织化学。制备大鼠海马神经元培养物。生长于细胞培养玻片上的活的神经元与患者或对照的血清(最终稀释度1∶200)或csf(1∶10)于37℃孵育1小时。去除培养基并用大量磷酸缓冲盐水(pbs)清洗后，用4％多聚甲醛固定神经元，用0.1％tritonx-100透明化，并且用豚鼠多克隆gabab1受体抗体(1∶200)，随后用1∶2000稀释的对应的alexafluor二抗(molecularprobes，eugene，or)单独或双重免疫标记。在荧光显微镜下使用zeissaxiovision软件(zeiss，thornwood，ny)拍摄结果。

用含有啮齿动物gabab受体的gabab1或gabab2亚基的质粒或不含插入的质粒(对照)转染hek293细胞，其使用先前报道的方法。在其它实验中，以等摩尔比的gabab1和gabab2共转染细胞。转染后，细胞在评估前生长24小时。在4％多聚甲醛中固定转染的细胞，用0.1％tritonx-100透明化，然后与患者的血清(1∶250)或csf(1∶10)孵育，并与所指出的豚鼠多克隆gabab1受体抗体(1∶20000)或多克隆gabab2受体抗体(1∶10000，由dr.moss生产)于4℃孵育过夜，在pbs中洗涤，并且与适当的alexafluor二抗(1∶2000；molecularprobes)孵育。在荧光显微镜下使用zeissaxiovision软件(zeiss，thornwood，ny)拍摄结果。

使用表达gabab1/b2的hek293细胞与梯度稀释的血清和csf(从1/2稀释开始)孵育来确定抗体滴度。

如所报告的，使用所指出的转染的hek293细胞，和针对igg1、igg2、igg3和igg4(全部1∶200稀释；sigma，st.louis，mo)的抗人二抗确定患者血清或csf中的抗体igg亚型。

免疫沉淀和免疫印迹。如上述获得生长于100mm孔中(密度10⁶神经元/孔)的活的神经元，并且与过滤后的患者血清(1：500)于37℃孵育1小时。然后用pbs洗涤神经元，用含蛋白酶抑制剂(p8340；sigmalabs)的缓冲液(150mm氯化钠，1mmedta，100mm三(羟甲基)氨基甲烷盐酸([tris]-hcl)，0.5％脱氧胆酸，1％tritonx-100[sigmalabs，st.louis，mo]，ph7.5)裂解，并于4℃以16.1×10³g离心20分钟。保留上清并与蛋白质a/g琼脂糖珠(20423；pierce，rockford，il)4℃孵育过夜，离心，然后用pbs洗涤包含珠与结合靶细胞表面抗原的患者的抗体的沉淀，分装，并保存在-80℃。此沉底的分装物重悬于laemmli缓冲液，煮沸10分钟，在4-15％的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并且用ezblue凝胶染色剂(g1041；sigmalabs)可视化蛋白质。从凝胶上切下由患者血清沉淀的不同的蛋白质条带并在宾夕法尼亚大学的蛋白质组学部门使用质谱分析。鉴定抗原后，如前所述在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离所指出的冷冻分装的沉淀，转移至硝酸纤维素膜(162-0115；bio-rad，hercules，ca)，并用指出的针对gabab1(1：，000)或gabab2(1∶1000)受体亚基的多克隆抗体印迹。使用适当的生物素标记的二抗(1∶2000)和抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶，二氨基联苯胺法显影反应。

使用共聚焦显微镜定量分析gabab受体簇。14-21天的活的体外(div)大鼠海马神经元与患者csf(1∶30稀释于neuro-basalb27介质中；gibco，carlsbad，ca)孵育24小时，洗涤，在多聚甲醛(含4％多聚甲醛，4％蔗糖的pbs中)中固定5分钟，用0.25％tritonx-100透化处理10分钟，用5％正常山羊血清封闭1小时。然后将神经元与针对gabab受体表位的豚鼠多克隆抗体(1∶1000；invitrogen)和针对突触前标记物巴松管蛋白的小鼠单克隆抗体(1∶200；stressgen，victoria，britishcolumbia，canada)孵育，洗涤，并与适当的荧光素缀合的二抗(1∶1000，molecularprobes)孵育。

使用激光扫描共聚焦显微镜获得图像(leicatcssp2；leica，deerfield，il)。对每一图像，调整激光光水平和检测器增益和偏移使得没有像素值是饱和的。将标记后的神经元的图像数字化存储以供后续分析。将图像阈值化，选择包含树突的感兴趣的区域，并使用交互式软件(imagej；researchservicesbranch，nationalinstituteofmentalhealth，bethesda，md)沿神经元树突确定独立的簇的数目。在imagej中实施软件宏来定量标记有患者的抗体、商业化gabab抗体和突触标记物巴松管蛋白的共定位的簇

结果

指示患者(表中的#1，病例)：一名60岁的女性由于精神错乱、记忆问题和新发作的难以治愈的全身性强直阵挛和复杂部分发作而住院。在检查中，她对地点和时间均无判断力，并具有极差的注意力和短期记忆。除了侧向注视的扫视性眼球追踪，没有注意到颅神经异常。力量、感觉、反射和协调性正常。脑mri显示了与边缘叶脑炎相一致的双侧内侧颞叶液体衰减反转恢复(flair)信号增强(图1a)。脑电图(eeg)显示弥漫性慢波和双侧周期性单侧癫痫样放电(pleds)。csf表明9个白血细胞(wbc)/μl，总蛋白浓度35mg/dl，葡萄糖71mg/dl，以及寡克隆条带和细胞学阴性。单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒和圣路易斯脑炎的pcr结果均为阴性。注意到了由抗利尿激素分泌不当综合征(siadh)引起的低钠血症(119meq/l)。血清和csf的副肿瘤抗体分析为阴性。结合ct和氟代脱氧葡萄糖(fdg)-pet发现纵膈淋巴结肿大，经活检证实为小细胞肺癌(sclc)。用抗癫痫药物(左乙拉西坦、丙戊酸、苯妥英)和免疫疗法(静脉注射免疫球蛋白[ivig]，皮质类固醇)，立即跟着使用顺铂(cisplatin)和依托泊苷(etoposide)的化学疗法来治疗所述患者。短期记忆和认知出现了快速和剧烈的改善，并且完全解决了癫痫发作。完成这些治疗后，患者接受了标准的预防性全脑放射治疗。症状表现1个月后重复脑mri显示了改善的异常flair信号(图1b)；接下来的3和9个月后的mri保持不变，除了很可能继发于放射治疗的逐步的全身萎缩(图1c，d)。症状表现一年后，该患者仅有轻度记忆和认知障碍并且独立生活。

针对新神经元细胞表面自身抗原的抗体的检测。对指示病例和另外来自所指出选择病例的14个患者的血清和csf的分析显示了与大鼠脑神经毡的反应性，其模式不同于报告的nmdar的nr1亚基、ampar的glur1/2亚基或vgkc抗体的反应性。为确定抗体是否与胞外表位反应，将未固定的和非透化处理的大鼠海马神经元培养物与患者的血清或csf孵育，其显示了与细胞表面强烈的反应性(图3a)。

神经元细胞表面抗原是促代谢型受体。为鉴定细胞表面抗原，将活的大鼠海马神经元与患者的抗体孵育，免疫沉淀靶抗原。这些研究产生了2条大约105和90kda的蛋白质条带(图3b)，通过质谱分析证实其为源自促代谢型gabab受体的b1亚基的序列。因为gabab受体为包含具有相似分子量的两种亚基b1和b2的异二聚体，下一步发明人用免疫印迹和特异性针对每一亚基的多克隆抗体检验确定了患者的抗体是否已将两种亚基都沉淀。这些研究证实了患者抗体与gabab受体的b1和b2亚基共沉淀(图3c)。

如所报告的，通过3重免疫标记(患者抗体；非竞争性的gabab1受体胞内表位的豚鼠多克隆抗体；和突触前标记物[巴松管蛋白])的培养的神经元确定患者抗体对gabab受体的特异性，并且通过共聚焦显微镜定量共定位的程度(图4)。分析了4个独立的细胞培养玻片上的24个神经元树突上的抗体与gabab受体簇的结合。这显示了103±0.8％的患者抗体标记的gabab受体簇与豚鼠多克隆针对gabab受体的抗体标记的簇共定位，和107±0.7％的豚鼠抗体标记的簇与那些用患者抗体标记的共定位(由于少数被患者抗体标记的簇与2个被豚鼠抗体标记的簇重合或相反的情况，出现了略微高于100％的数字)。这些结果代表基本上所有的患者的抗神经元细胞表面抗体都靶向gabab受体，以及差不多所有神经元gabab受体都标记有患者的抗体。

为确定2种gabab受体亚基的哪一种包含靶表位，用gabab1、gabab2或两种受体亚基转染hek293细胞并与患者的抗体进行免疫组织化学测试。所有15个患者都具有与gabab1受体亚基特异反应的血清或csf抗体(图5)，而1个另外具有与gabab2亚基的反应性。这些发现表明表达gabab1/b2或gabab1受体亚基的hek293细胞为明确的诊断性测试提供了基础。对104个对照病例相似的研究显示了2个患者(都患有归因于gad自身免疫的综合征)具有低滴度(csf中1∶2，血清阴性)的gabab1受体抗体，在脑免疫组织化学中不可见。

在6个随机选择的患者的血清或csf中进行抗体igg亚型分析。全部具有igg1gabab1抗体；两个具有另外的igg3和一个具有igg2抗体。

神经系统症状。人口学信息、临床特征、治疗和预后示于表1和2。在具有高滴度gabab1受体抗体并患有边缘叶脑炎(#1-15病例)的15个患者中，平均年龄为62岁(范围，24-75)；8个为男性。13个患者表现出亚急性癫痫发作、精神错乱和严重的记忆损伤，在两个(#3和13)中记忆障碍和精神错乱先于癫痫发作数周。大多数癫痫发作具有继发性全身发作的颞叶发病，3个患者具有癫痫持续状态。10个患者具有与边缘叶脑炎相一致的单或双侧颞叶内侧flair/t2信号增强，1个在胼胝体具有小区域的flair信号增强，4个具有正常的脑mri。10个数据可得的患者中的9个为csf异常的。最常见的异常为在8个患者中的淋巴球增多。可得到来自12个患者的eeg研究；9个显示了颞叶癫痫发作、癫痫样放电或颞叶慢波；2个具有广泛性慢波和1个正常。在egg上注意到了若干类型的癫痫发作，包括复杂部分性发作(通常是颞叶发病)、癫痫持续状态和亚临床癫痫发作。

具有低滴度gabab1抗体的2个对照病例(表1和2中的#16和17病例)发展出不同的与血清和csf中高滴度gad抗体相关的综合征。这2个患者都没有发展出癫痫发作或边缘性机能失调。一个具有进行性小脑共济失调，而另一个步态不稳、肌肉僵硬、强直、肌阵挛和口齿不清，归类为强直性脑脊髓炎。

表1：人口学特征和症状

sclc：小细胞肺癌；fdg/pet：氟脱氧葡萄糖/正电子发射断层扫描术；siadh：抗利尿激素分泌失调综合征；gad：谷氨酸脱羧酶；tpo：甲状腺过氧化物酶；vgcc：电压门控钙离子通道；

表2.诊断性测试、治疗和预后。

wbc：白血细胞(正常＜4/μl)，flair：液体衰减反转恢复；n/a：不可得的；ivig：静脉注射免疫球蛋白。icu：重症监护病房。

其它自身免疫抗体。除了gabab抗体，15个患者中的6个(40％)具有下述一或多种抗体：3个具有gad抗体，2个具有甲状腺过氧化物酶(tpo)抗体，3个具有n型vgcc抗体和1个具有sox1抗体。3个具有gad抗体的患者中仅有1个患有内分泌失调，而3个具有vgcc抗体的患者中有1个患有sclc。具有sox1抗体的患者患有sclc。

相关肿瘤。7个患者患有肺结节或纵膈淋巴结肿大，在6个中病理学确认了sclc或神经内分泌肿瘤。在所有的例子中都在表现神经系统症状的时间检测到了肿瘤。由于大多数肺肿瘤是通过穿刺活检诊断的，无可获得的可用于gabab受体表达的组织。不过，来自对照病例(不具有抗体或患有脑炎)的4个sclc中的3个显示出与豚鼠多克隆gabab1受体抗体和生物素标记的患者的igg的反应性，表明sclc表达这些受体。

治疗和结果。9个患者(60％)对免疫疗法或治疗肿瘤具有实质性的神经系统响应。这些患者的平均随访为10个月(3-72)；1个随后死于肿瘤发展(15个月)和1个失访(4个月)。6个患者没有显示出持续的神经系统改善；3个(表1和2中的#4、14和15)在疾病表现后不久由于肿瘤或化疗相关的并发症死亡，而另外3个在死亡(#5和7)或失访(#12)后被确诊具有针对gabab受体的抗体。在后3个病例中，仅在接受了皮质类固醇和血浆置换的#7患者中考虑自身免疫过程；另两个患者没有接受免疫治疗。总的来说，排除失访的两个患者后，神经系统改善与肿瘤及时控制或免疫治疗相关(fisher′s精确检验＝0.003)。

本申请的发明人已发现了与gabab受体胞外表位的抗体相关的并且潜在地响应治疗的自身免疫性脑炎的新形式。基于临床、mri和eeg结果，最受影响的脑区为海马和颞叶。因此，毫不奇怪，尽管一些临床和免疫学特征可能表明了gabab受体自身免疫，作为结果的综合征与其它类型的边缘叶脑炎无明显区分。值得注意的发现是在所有患者中发展出显著的和严重的癫痫发作，其代表了就医或住院的主要原因。两个经常相关的特征是肺癌的鉴定和同时出现的针对与边缘性综合征显著性未明的抗原的自身免疫抗体。相比之下，药物学或遗传学阻断gabab受体导致与具有针对gabab受体的抗体的边缘性综合征患者非常近似的表型。另外，在人中，常见的gabab受体多态性与颞叶癫痫相关。

患有脑炎并具有针对gabab受体的抗体的患者的百分之四十七具有肺结节或纵膈淋巴结肿大，其病理学、放射学和人口学特征(年龄范围53-75岁，全部为吸烟者)与sclc或神经内分泌肿瘤相符。因此，gabab自身免疫很可能涉及多个患有边缘叶脑炎和sclc的患者，其先前被认为“无抗体”或归为胞内抗原抗体，特别是如果在治疗肿瘤或免疫治疗后发生了剧烈(及预期的)改善。另外，抗gabab受体脑炎可在没有癌症参与下发生。5个这样的患者是年轻的(中位年龄30岁，范围24-45)，无吸烟史，包括ct/fdg-pet的全面癌症筛查为阴性，并且在某些病例中的长期随访(41和72个月)使所有病例中不太可能存在隐匿性癌症。这方面，抗gabab受体脑炎与其它可能与癌症相关或不相关的，中枢(nmdar，ampar)或周围神经系统(乙酰胆碱受体，p/q型vgcc)的突触自身免疫是相似的。如在这些疾病中所发生的，40％的患有抗gabab受体脑炎(其中50％无肿瘤)的患者具有额外的自身抗体，代表自身免疫的倾向。最有趣的免疫学重叠为具有gad(胞内抗原)抗体，其将患有边缘叶脑炎的患者子集可具有gabab受体胞外表位抗体考虑为该综合征似乎可能的病因，该边缘叶脑炎归因于gad自身免疫。一起看来，针对gabab1受体的抗体可用于诊断脑炎，其通常表现为边缘性综合征，但伴有早期和显著的癫痫发作。当确定抗体的时候，血清滴度可能非常低，故优选检验血清和csf两者。尽管大约50％的患者不患有癌症，这些抗体的鉴定仍应促使对sclc的搜索。使用皮质类固醇、ivig或血浆置换的肿瘤治疗和免疫疗法经常导致改善。在活的神经元中抗体与gabab受体剧烈和特异性的结合，以及与受体功能消除的实验表型的相似性显示了所述抗体为致病性的。

实施例2：边缘叶脑炎和抗gad相关的神经系统疾病中的gabab受体抗体

我们在147个患有le或与gad-ab相关的神经系统综合征的患者中分析了gababr-ab的频率。我们在70个le(33个具有癌神经抗体的副肿瘤性患者，18个不具有癌神经抗体的副肿瘤患者和19个具有gad-ab或为血清阴性的原发性患者)患者中，和77个除了le外还患有gad-ab相关神经系统综合征(29个僵人综合征(sps)，28个小脑共济失调，14个癫痫和6个患有多种副肿瘤神经系统综合征)的患者中检验到gababr-ab的存在。通过对gabab1和gabab2受体亚基转染的hek293细胞的间接免疫荧光在储存的血清或csf样品中分析gababr-ab。

70个le患者中的10个(14％)中检测到gababr-ab。8个患有sclc而两个为原发性的。8个患有sclc的le患者中的1个具有另外的癌神经抗体(hu)并且2个具有gad-ab。10个患有不具有癌神经抗体的le和sclc的患者中的7个(70％)中鉴定到了gababr-ab。在具有gad-ab并患有sps、小脑共济失调或癫痫的患者中没有发现gababr-ab抗体。然而，1个具有gad-ab并患有小脑共济失调的患者在间变性胸腺类癌环境下还表现出gababr-ab。

我们的结果显示在与sclc相关的le(之前认为是“血清阴性”)中gababr-ab是所发现的最常见的抗体。在具有gad-ab的患者中，gababr-ab为低频率的并仅在癌症的情形下观察到。

方法

患者。为了分析抗神经元抗体，我们评估了所有最终诊断为le，或其它与gad-ab相关的神经系统综合征的患者，将其血清或csf送至我们的实验室(barcelona，spain)。通过亚急性短期记忆丧失、行为改变、癫痫发作和涉及到颞叶(通过eeg、图像研究或尸体解剖检查)的发病来定义le。如果诊断了肿瘤或血清表现出良好表征的癌神经抗体(hu、yo、ri、cv2、ma2、神经元突触前膜蛋白抗体(amphiphysin))，即认为le是明确的副肿瘤性的。明确的原发性le的诊断要求不存在癌症及良好表征的癌神经抗体，并且至少随访3年。具有较短随访的le患者分类为疑似原发性le。如之前所报告的，将具有gad-ab的患者分类入下述组中的一个：僵人综合征(sps)、小脑共济失调、单发型癫痫和副肿瘤神经系统综合征。从咨询神经学家所填的表格、电话访问和评估临床记录获得信息。本研究已获医院临床伦理委员会批准。

免疫学研究。使用抗生物素蛋白-生物素免疫过氧化物酶技术对多聚甲醛灌注的大鼠小脑的冷冻切片进行免疫组织化学来筛选癌神经抗体、sox1-ab和gad-ab，并且当有暗示时通过免疫印迹确认。通过放射免疫分析确认gad-ab。通过在4％多聚甲醛固定后的大鼠脑冷冻切片上的免疫组织化学筛选神经毡抗体。通过对用含有适当抗原的质粒转染的hek293细胞的免疫荧光确认ampa谷氨酸受体抗体的存在，并且用放射免疫分析确认电压门控钾离子通道(vgkc)抗体。

在用含等摩尔比的啮齿动物gabab1和gabab2的质粒转染的hek293细胞中筛选gababr-ab。还通过大鼠海马神经元培养物的免疫组织化学分析阳性样品。之前已描述了这两种技术。简而言之，将转染的hek293细胞与患者的血清(1∶20稀释)或csf(1∶2)于37℃孵育1小时，洗涤，用4％多聚甲醛固定，与兔多克隆gabab1抗体(1∶1000)(santacruzbiotechnology，sc-14006；santacruz，california)孵育，跟着适当的alexafluor二抗(molecularprobes，eugene，or)。对大鼠海马神经元培养物的免疫组织化学，将生长于细胞培养玻片上的活的神经元与患者的血清(1∶100)或csf(1∶2)于37℃孵育1小时，洗涤，用4％多聚甲醛固定，并与抗人iggalexafluor二抗免疫反应。在荧光显微镜下使用zeissaxiovision软件(zeiss，thornwood，ny)拍摄结果。为确认神经元反应的特异性，用非神经元细胞系hek293预吸附所有阳性样品以去除可与非神经元特异性表面抗原反应的抗体。

结果

用gababr的b1和b2亚基转染的hek293细胞筛选出11个gababr-ab测试为阳性的患者(图7)。所有阳性样品与海马神经元的原始培养物可体内免疫反应(图8)。在5个可得到成对样品的患者中血清和csf中gababr-ab均为阳性。gababr-ab的平均滴度为血清中1/120(范围40-2000)和csf中1/60(范围20-640)。

我们在10个患有le的患者中发现了gababr-ab。在不具有癌神经抗体(之前认为是“血清阴性”)的副肿瘤性le组中更频繁地鉴定到gababr-ab阳性(表3)。18个患者中的7个(39％)为gababr-ab阳性并且全部患有sclc。总共在10个患有不具有癌神经抗体的le和sclc的患者中的7个(70％)中鉴定到gababr-ab阳性。另外3个患者为ampar-ab阳性。gababr-ab和gad-ab在2个患有sclc的患者中发生并存，而另外3个患有le和gad-ab的患者与其它肿瘤(2个胸腺瘤，1个淋巴瘤)相关并且为gababr-ab阴性。

在本研究中，我们分析了患有le并具有癌神经抗体的33个患者，仅有一个测试为gababr-ab阳性，其具有hu-ab并患有sclc。然而，7个具有gababr-ab并不具有癌神经抗体的le患者中的4个表现出针对胞内抗原的抗体(表4)。2个患者具有gad-ab(一个还有sox1-ab)，1个具有hu-ab，并且在两个之前报告的病例中，1个具有脑丝氨酸/苏氨酸激酶(brsk)2-ab而另1个具sox1和vgkv-ab。

在剩下的2个gababr-ab阳性的患者中没有鉴定到肿瘤，但其随访过短以至于不能将他们分类为明确的原发性le。5个患有原发性le并具有gad-ab的患者中没有一个为gababr-ab阳性(表3)。

gababr-ab阳性患者的临床特征的概况示于表4。10个具有gababr-ab的患者中的9个为男性。平均年龄为60岁(范围47-70岁)。在8个患者中癫痫发作为主要的和代表性的症状并且2个需要入住重症监护病房以控制癫痫发作。所有患者还表现出精神错乱、神志不清、记忆丧失或与主要涉及边缘系统的脑炎相一致的行为改变。在4个患者中csf显示了轻度的淋巴球增多。7个患者海马和杏仁核中的一个或两者的脑mri显示了液体衰减反转恢复信号增加。在他们的4个中初始脑mri报告为正常。仅1个患者患有低钠血症。用类固醇、静脉注射免疫球蛋白或此两种药物的组合治疗7个患者。8个患有sclc的患者中的3个还接受化疗治疗。仅2个患者完全恢复(一个无癌症)并且它们中没有一个具抗神经元抗体。在4个患者(其中一个复发)中实现了对所指出的治疗的部分响应。

在71个具有gad-ab并患有sps、小脑共济失调或癫痫的患者中没有检测到gababr-ab。相反的，患有副肿瘤神经系统综合征并具有gad-ab的6个患者中的一个为gababr-ab阳性(表3)。她为患有已知的退行性胸腺和骨转移性类癌的57岁的女性。她发展出恶心、呕吐、步态不稳和复视。神经系统检查显示正常精神状态、双侧性水平眼球震颤和小脑性步态共济失调。患者接受口服类固醇治疗并在随后的3个月症状缓慢解决。

表3.在147个患有边缘叶脑炎或gad-ab相关神经系统综合征的患者中的gababr-ab频率

1.hu-ab(26个)，ma2-ab(4个)，神经元突触前膜蛋白抗体(amphiphysin-ab)(3个)。18个患者患肺癌

2.5个患者具gad-ab。11个患者患肺癌(sclc：10个；nsclc：1个)

3.5个患者具gad-ab。明确的原发性le：7个患者

sclc：小细胞肺癌；le：边缘叶脑炎

为观察gababr-ab是否与其它副肿瘤性小脑退化(pcd)相关，我们分析了一系列的45个患有pcd和肺癌(35个患有sclc)的患者的血清和csf。大部分(73％)包含于之前的研究中。这些患者具有hu-ab(15％)或电压门控钙离子通道(50％)抗体。然而，全部都为gababr-ab阴性。

我们发现在患有sclc和le(之前认为是“血清阴性”)的患者中gababr-ab为鉴定的最常见的抗体。尽管在15个患者的初始系列中观察到gababr-ab和gad-ab的出现，当我们测试更大系列的患有若干类型与gad-ab相关的神经系统综合征的患者时，仅在那些具有副肿瘤症状的患者中鉴定到gababr-ab。

在开始将hu-ab描述为与sclc相关的神经系统综合征的标记物的时候，我们观察到多至50％的患有le的患者为“血清阴性”。这些患者的症状为边缘系统高限制性的并且在治疗癌症后相比具有hu-ab的患者似乎更经常改善。在目前的研究中，10个患有le和sclc的患者中的7个(70％)具有gababr-ab。另外3个患者为ampar-ab阳性。一并考虑，所有被认为是经典副肿瘤(癌神经)抗体血清阴性的患有le和sclc的患者都具有针对突触受体的抗体。

在目前的研究中我们表明hu-ab和gababr-ab仅发生于33个患者中的1个，表明了此特定的相关性是不常见的。相反的，我们确认了这些患者的40％具有sclc潜在标记物(sox1，brsk2)的或直接针对vgkc或gad的抗体。

在本研究中，所有同时具有gababr-ab和gad-ab的患者都患有副肿瘤性疾病。在初始系列中，8个患有原发性le脑炎的患者中的2个另外具有gad-ab。除了在这两个患有sclc的患者中之外，我们没有在患有具gad-ab的le或单发性癫痫的患者中发现gababr-ab。我们的5个患有原发性le并具有gad-ab的患者为平均年龄29岁的女性，并且4个表现出癫痫发作。为确定两种抗体在患有原发性le的患者中有多经常并存，我们建议在所有患有怀疑涉及gad-ab的le的患者中例行寻找gababr-ab。

在参考附图描述了本发明优选的实施方案后，应理解本发明不限于严格的实施方案，本领域技术人员可实施不背离所附权利要求所定义的本发明的精神或范围的各种改变和修改为。

序列表

<110>j·达尔莫

<120>和脑炎、记忆障碍和癫痫发作相关的gaba(b)受体抗体

<130>p-73365-usp

<140>us09/999,999

<141>2009-09-11

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>961

<212>prt

<213>人

<400>1

metleuleuleuleuleuleualaproleupheleuargproprogly

151015

alaglyglyalaglnthrproasnalathrsergluglycysglnile

202530

ilehisproprotrpgluglyglyileargtyrargglyleuthrarg

354045

aspglnvallysalaileasnpheleuprovalasptyrgluileglu

505560

tyrvalcysargglygluarggluvalvalglyprolysvalarglys

65707580

cysleualaasnglysertrpthraspmetaspthrproserargcys

859095

valargilecysserlyssertyrleuthrleugluasnglylysval

100105110

pheleuthrglyglyaspleuproalaleuaspglyalaargvalasp

115120125

pheargcysaspproaspphehisleuvalglyserserargserile

130135140

cysserglnglyglntrpserthrprolysprohiscysglnvalasn

145150155160

argthrprohissergluargargalavaltyrileglyalaleuphe

165170175

prometserglyglytrpproglyglyglnalacysglnproalaval

180185190

glumetalaleugluaspvalasnserargargaspileleuproasp

195200205

tyrgluleulysleuilehishisaspserlyscysaspproglygln

210215220

alathrlystyrleutyrgluleuleutyrasnaspproilelysile

225230235240

ileleumetproglycysserservalserthrleuvalalagluala

245250255

alaargmettrpasnleuilevalleusertyrglyserserserpro

260265270

alaleuserasnargglnargpheprothrphepheargthrhispro

275280285

seralathrleuhisasnprothrargvallysleupheglulystrp

290295300

glytrplyslysilealathrileglnglnthrthrgluvalphethr

305310315320

serthrleuaspaspleuglugluargvallysglualaglyileglu

325330335

ilethrpheargglnserphepheseraspproalavalprovallys

340345350

asnleulysargglnaspalaargileilevalglyleuphetyrglu

355360365

thrglualaarglysvalphecysgluvaltyrlysgluargleuphe

370375380

glylyslystyrvaltrppheleuileglytrptyralaaspasntrp

385390395400

phelysiletyraspproserileasncysthrvalaspglumetthr

405410415

glualavalgluglyhisilethrthrgluilevalmetleuasnpro

420425430

alaasnthrargserileserasnmetthrserglngluphevalglu

435440445

lysleuthrlysargleulysarghisproglugluthrglyglyphe

450455460

glnglualaproleualatyraspalailetrpalaleualaleuala

465470475480

leuasnlysthrserglyglyglyglyargserglyvalargleuglu

485490495

asppheasntyrasnasnglnthrilethraspglniletyrargala

500505510

metasnserserserphegluglyvalserglyhisvalvalpheasp

515520525

alaserglyserargmetalatrpthrleuilegluglnleuglngly

530535540

glysertyrlyslysileglytyrtyraspserthrlysaspaspleu

545550555560

sertrpserlysthrasplystrpileglyglyserproproalaasp

565570575

glnthrleuvalilelysthrpheargpheleuserglnlysleuphe

580585590

ileservalservalleuserserleuglyilevalleualavalval

595600605

cysleuserpheasniletyrasnserhisvalargtyrileglnasn

610615620

serglnproasnleuasnasnleuthralavalglycysserleuala

625630635640

leualaalavalpheproleuglyleuaspglytyrhisileglyarg

645650655

asnglnpheprophevalcysglnalaargleutrpleuleuglyleu

660665670

glypheserleuglytyrglysermetphethrlysiletrptrpval

675680685

histhrvalphethrlyslysgluglulyslysglutrparglysthr

690695700

leugluprotrplysleutyralathrvalglyleuleuvalglymet

705710715720

aspvalleuthrleualailetrpglnilevalaspproleuhisarg

725730735

thrilegluthrphealalysglugluprolysgluaspileaspval

740745750

serileleuproglnleugluhiscysserserarglysmetasnthr

755760765

trpleuglyilephetyrglytyrlysglyleuleuleuleuleugly

770775780

ilepheleualatyrgluthrlysservalserthrglulysileasn

785790795800

asphisargalavalglymetalailetyrasnvalalavalleucys

805810815

leuilethralaprovalthrmetileleuserserglnglnaspala

820825830

alaphealaphealaserleualailevalphesersertyrilethr

835840845

leuvalvalleuphevalprolysmetargargleuilethrarggly

850855860

glutrpglnserglualaglnaspthrmetlysthrglyserserthr

865870875880

asnasnasnglugluglulysserargleuleuglulysgluasnarg

885890895

gluleuglulysileilealaglulysglugluargvalsergluleu

900905910

arghisglnleuglnserargglnglnleuargserargarghispro

915920925

prothrproprogluproserglyglyleuproargglyproproglu

930935940

proproaspargleusercysaspglyserargvalhisleuleutyr

945950955960

lys

<210>2

<211>844

<212>prt

<213>人

<400>2

metglyproglyalaprophealaargvalglytrpproleuproleu

151015

leuvalvalmetalaalaglyvalalaprovaltrpalaserhisser

202530

prohisleuproargprohisserargvalproprohisproserser

354045

gluargargalavaltyrileglyalaleupheprometserglygly

505560

trpproglyglyglnalacysglnproalavalglumetalaleuglu

65707580

aspvalasnserargargaspileleuproasptyrgluleulysleu

859095

ilehishisaspserlyscysaspproglyglnalathrlystyrleu

100105110

tyrgluleuleutyrasnaspproilelysileileleumetprogly

115120125

cysserservalserthrleuvalalaglualaalaargmettrpasn

130135140

leuilevalleusertyrglyserserserproalaleuserasnarg

145150155160

glnargpheprothrphepheargthrhisproseralathrleuhis

165170175

asnprothrargvallysleupheglulystrpglytrplyslysile

180185190

alathrileglnglnthrthrgluvalphethrserthrleuaspasp

195200205

leuglugluargvallysglualaglyilegluilethrphearggln

210215220

serphepheseraspproalavalprovallysasnleulysarggln

225230235240

aspalaargileilevalglyleuphetyrgluthrglualaarglys

245250255

valphecysgluvaltyrlysgluargleupheglylyslystyrval

260265270

trppheleuileglytrptyralaaspasntrpphelysiletyrasp

275280285

proserileasncysthrvalaspglumetthrglualavalglugly

290295300

hisilethrthrgluilevalmetleuasnproalaasnthrargser

305310315320

ileserasnmetthrserglngluphevalglulysleuthrlysarg

325330335

leulysarghisproglugluthrglyglypheglnglualaproleu

340345350

alatyraspalailetrpalaleualaleualaleuasnlysthrser

355360365

glyglyglyglyargserglyvalargleugluasppheasntyrasn

370375380

asnglnthrilethraspglniletyrargalametasnserserser

385390395400

phegluglyvalserglyhisvalvalpheaspalaserglyserarg

405410415

metalatrpthrleuilegluglnleuglnglyglysertyrlyslys

420425430

ileglytyrtyraspserthrlysaspaspleusertrpserlysthr

435440445

asplystrpileglyglyserproproalaaspglnthrleuvalile

450455460

lysthrpheargpheleuserglnlysleupheileservalserval

465470475480

leuserserleuglyilevalleualavalvalcysleuserpheasn

485490495

iletyrasnserhisvalargtyrileglnasnserglnproasnleu

500505510

asnasnleuthralavalglycysserleualaleualaalavalphe

515520525

proleuglyleuaspglytyrhisileglyargasnglnpheprophe

530535540

valcysglnalaargleutrpleuleuglyleuglypheserleugly

545550555560

tyrglysermetphethrlysiletrptrpvalhisthrvalphethr

565570575

lyslysgluglulyslysglutrparglysthrleugluprotrplys

580585590

leutyralathrvalglyleuleuvalglymetaspvalleuthrleu

595600605

alailetrpglnilevalaspproleuhisargthrilegluthrphe

610615620

alalysglugluprolysgluaspileaspvalserileleuprogln

625630635640

leugluhiscysserserarglysmetasnthrtrpleuglyilephe

645650655

tyrglytyrlysglyleuleuleuleuleuglyilepheleualatyr

660665670

gluthrlysservalserthrglulysileasnasphisargalaval

675680685

glymetalailetyrasnvalalavalleucysleuilethralapro

690695700

valthrmetileleuserserglnglnaspalaalaphealapheala

705710715720

serleualailevalphesersertyrilethrleuvalvalleuphe

725730735

valprolysmetargargleuilethrargglyglutrpglnserglu

740745750

alaglnaspthrmetlysthrglyserserthrasnasnasngluglu

755760765

glulysserargleuleuglulysgluasnarggluleuglulysile

770775780

ilealaglulysglugluargvalsergluleuarghisglnleugln

785790795800

serargglnglnleuargserargarghisproprothrproproglu

805810815

proserglyglyleuproargglyproprogluproproaspargleu

820825830

sercysaspglyserargvalhisleuleutyrlys

835840

<210>3

<211>899

<212>prt

<213>人

<400>3

metleuleuleuleuleuleualaproleupheleuargproprogly

151015

alaglyglyalaglnthrproasnalathrsergluglycysglnile

202530

ilehisproprotrpgluglyglyileargtyrargglyleuthrarg

354045

aspglnvallysalaileasnpheleuprovalasptyrgluileglu

505560

tyrvalcysargglygluarggluvalvalglyprolysvalarglys

65707580

cysleualaasnglysertrpthraspmetaspthrproserargcys

859095

valasnargthrprohissergluargargalavaltyrileglyala

100105110

leupheprometserglyglytrpproglyglyglnalacysglnpro

115120125

alavalglumetalaleugluaspvalasnserargargaspileleu

130135140

proasptyrgluleulysleuilehishisaspserlyscysasppro

145150155160

glyglnalathrlystyrleutyrgluleuleutyrasnaspproile

165170175

lysileileleumetproglycysserservalserthrleuvalala

180185190

glualaalaargmettrpasnleuilevalleusertyrglyserser

195200205

serproalaleuserasnargglnargpheprothrphepheargthr

210215220

hisproseralathrleuhisasnprothrargvallysleupheglu

225230235240

lystrpglytrplyslysilealathrileglnglnthrthrgluval

245250255

phethrserthrleuaspaspleuglugluargvallysglualagly

260265270

ilegluilethrpheargglnserphepheseraspproalavalpro

275280285

vallysasnleulysargglnaspalaargileilevalglyleuphe

290295300

tyrgluthrglualaarglysvalphecysgluvaltyrlysgluarg

305310315320

leupheglylyslystyrvaltrppheleuileglytrptyralaasp

325330335

asntrpphelysiletyraspproserileasncysthrvalaspglu

340345350

metthrglualavalgluglyhisilethrthrgluilevalmetleu

355360365

asnproalaasnthrargserileserasnmetthrserglngluphe

370375380

valglulysleuthrlysargleulysarghisproglugluthrgly

385390395400

glypheglnglualaproleualatyraspalailetrpalaleuala

405410415

leualaleuasnlysthrserglyglyglyglyargserglyvalarg

420425430

leugluasppheasntyrasnasnglnthrilethraspglniletyr

435440445

argalametasnserserserphegluglyvalserglyhisvalval

450455460

pheaspalaserglyserargmetalatrpthrleuilegluglnleu

465470475480

glnglyglysertyrlyslysileglytyrtyraspserthrlysasp

485490495

aspleusertrpserlysthrasplystrpileglyglyserpropro

500505510

alaaspglnthrleuvalilelysthrpheargpheleuserglnlys

515520525

leupheileservalservalleuserserleuglyilevalleuala

530535540

valvalcysleuserpheasniletyrasnserhisvalargtyrile

545550555560

glnasnserglnproasnleuasnasnleuthralavalglycysser

565570575

leualaleualaalavalpheproleuglyleuaspglytyrhisile

580585590

glyargasnglnpheprophevalcysglnalaargleutrpleuleu

595600605

glyleuglypheserleuglytyrglysermetphethrlysiletrp

610615620

trpvalhisthrvalphethrlyslysgluglulyslysglutrparg

625630635640

lysthrleugluprotrplysleutyralathrvalglyleuleuval

645650655

glymetaspvalleuthrleualailetrpglnilevalaspproleu

660665670

hisargthrilegluthrphealalysglugluprolysgluaspile

675680685

aspvalserileleuproglnleugluhiscysserserarglysmet

690695700

asnthrtrpleuglyilephetyrglytyrlysglyleuleuleuleu

705710715720

leuglyilepheleualatyrgluthrlysservalserthrglulys

725730735

ileasnasphisargalavalglymetalailetyrasnvalalaval

740745750

leucysleuilethralaprovalthrmetileleuserserglngln

755760765

aspalaalaphealaphealaserleualailevalphesersertyr

770775780

ilethrleuvalvalleuphevalprolysmetargargleuilethr

785790795800

argglyglutrpglnserglualaglnaspthrmetlysthrglyser

805810815

serthrasnasnasnglugluglulysserargleuleuglulysglu

820825830

asnarggluleuglulysileilealaglulysglugluargvalser

835840845

gluleuarghisglnleuglnserargglnglnleuargserargarg

850855860

hisproprothrproprogluproserglyglyleuproargglypro

865870875880

progluproproaspargleusercysaspglyserargvalhisleu

885890895

leutyrlys

<210>4

<211>4547

<212>dna

<213>人

<400>4

ccctctcttccccccgccctgccttcccttgcaccctccttcttccctccgcccgggagc60

tctccctggtccccggcgccgcctccttccctcccggctccccgctccccgctcccgtgg120

ctgccgccgccccggggaagaagagacaggggtggggtttgggggaagcgagagaggagg180

ggagagaccctggccaggctggagcctggattcgaggggaggagggacgggaggaggaga240

aaggtggaggagaagggaggggggagcggggaggagcggccgggcctggggccttgaggc300

ccggggagagccggggagccgggcccgcgcgccgagatgttgctgctgctgctactggcg360

ccactcttcctccgccccccgggcgcgggcggggcgcagacccccaacgccacctcagaa420

ggttgccagatcatacacccgccctgggaagggggcatcaggtaccggggcctgactcgg480

gaccaggtgaaggctatcaacttcctgccagtggactatgagattgagtatgtgtgccgg540

ggggagcgcgaggtggtggggcccaaggtccgcaagtgcctggccaacggctcctggaca600

gatatggacacacccagccgctgtgtccgaatctgctccaagtcttatttgaccctggaa660

aatgggaaggttttcctgacgggtggggacctcccagctctggacggagcccgggtggat720

ttccggtgtgaccccgacttccatctggtgggcagctcccggagcatctgtagtcagggc780

cagtggagcacccccaagccccactgccaggtgaatcgaacgccacactcagaacggcgc840

gcagtgtacatcggggcactgtttcccatgagcgggggctggccagggggccaggcctgc900

cagcccgcggtggagatggcgctggaggacgtgaatagccgcagggacatcctgccggac960

tatgagctcaagctcatccaccacgacagcaagtgtgatccaggccaagccaccaagtac1020

ctatatgagctgctctacaacgaccctatcaagatcatccttatgcctggctgcagctct1080

gtctccacgctggtggctgaggctgctaggatgtggaacctcattgtgctttcctatggc1140

tccagctcaccagccctgtcaaaccggcagcgtttccccactttcttccgaacgcaccca1200

tcagccacactccacaaccctacccgcgtgaaactctttgaaaagtggggctggaagaag1260

attgctaccatccagcagaccactgaggtcttcacttcgactctggacgacctggaggaa1320

cgagtgaaggaggctggaattgagattactttccgccagagtttcttctcagatccagct1380

gtgcccgtcaaaaacctgaagcgccaggatgcccgaatcatcgtgggacttttctatgag1440

actgaagcccggaaagttttttgtgaggtgtacaaggagcgtctctttgggaagaagtac1500

gtctggttcctcattgggtggtatgctgacaattggttcaagatctacgacccttctatc1560

aactgcacagtggatgagatgactgaggcggtggagggccacatcacaactgagattgtc1620

atgctgaatcctgccaatacccgcagcatttccaacatgacatcccaggaatttgtggag1680

aaactaaccaagcgactgaaaagacaccctgaggagacaggaggcttccaggaggcaccg1740

ctggcctatgatgccatctgggccttggcactggccctgaacaagacatctggaggaggc1800

ggccgttctggtgtgcgcctggaggacttcaactacaacaaccagaccattaccgaccaa1860

atctaccgggcaatgaactcttcgtcctttgagggtgtctctggccatgtggtgtttgat1920

gccagcggctctcggatggcatggacgcttatcgagcagcttcagggtggcagctacaag1980

aagattggctactatgacagcaccaaggatgatctttcctggtccaaaacagataaatgg2040

attggagggtcccccccagctgaccagaccctggtcatcaagacattccgcttcctgtca2100

cagaaactctttatctccgtctcagttctctccagcctgggcattgtcctagctgttgtc2160

tgtctgtcctttaacatctacaactcacatgtccgttatatccagaactcacagcccaac2220

ctgaacaacctgactgctgtgggctgctcactggctttagctgctgtcttccccctgggg2280

ctcgatggttaccacattgggaggaaccagtttcctttcgtctgccaggcccgcctctgg2340

ctcctgggcctgggctttagtctgggctacggttccatgttcaccaagatttggtgggtc2400

cacacggtcttcacaaagaaggaagaaaagaaggagtggaggaagactctggaaccctgg2460

aagctgtatgccacagtgggcctgctggtgggcatggatgtcctcactctcgccatctgg2520

cagatcgtggaccctctgcaccggaccattgagacatttgccaaggaggaacctaaggaa2580

gatattgacgtctctattctgccccagctggagcattgcagctccaggaagatgaataca2640

tggcttggcattttctatggttacaaggggctgctgctgctgctgggaatcttccttgct2700

tatgagaccaagagtgtgtccactgagaagatcaatgatcaccgggctgtgggcatggct2760

atctacaatgtggcagtcctgtgcctcatcactgctcctgtcaccatgattctgtccagc2820

cagcaggatgcagcctttgcctttgcctctcttgccatagttttctcctcctatatcact2880

cttgttgtgctctttgtgcccaagatgcgcaggctgatcacccgaggggaatggcagtcg2940

gaggcgcaggacaccatgaagacagggtcatcgaccaacaacaacgaggaggagaagtcc3000

cggctgttggagaaggagaaccgtgaactggaaaagatcattgctgagaaagaggagcgt3060

gtctctgaactgcgccatcaactccagtctcggcagcagctccgctcccggcgccaccca3120

ccgacacccccagaaccctctgggggcctgcccaggggaccccctgagccccccgaccgg3180

cttagctgtgatgggagtcgagtgcatttgctttataagtgagggtagggtgagggagga3240

caggccagtagggggagggaaagggagaggggaagggcaggggactcaggaagcaggggg3300

tccccatccccagctgggaagaacatgctatccaatctcatctcttgtaaatacatgtcc3360

ccctgtgagttctgggctgatttgggtctctcatacctctgggaaacagacctttttctc3420

tcttactgcttcatgtaattttgtatcacctcttcacaatttagttcgtacctggcttga3480

agctgctcactgctcacacgctgcctcctcagcagcctcactgcatctttctcttcccat3540

gcaacaccctcttctagttaccacggcaacccctgcagctcctctgcctttgtgctctgt3600

tcctgtccagcaggggtctcccaacaagtgctctttccaccccaaaggggcctctccttt3660

tctccactgtcataatctctttccatcttacttgcccttctatactttctcacatgtggc3720

tccccctgaattttgcttcctttgggagctcattcttttcgccaaggctcacatgctcct3780

tgcctctgctctgtgcactcacgctcagcacacatgcatcctcccctctcctgcgtgtgc3840

ccactgaacatgctcatgtgtacacacgcttttcccgtatgctttcttcatgttcagtca3900

catgtgctctcgggtgccctgcattcacagctacgtgtgcccctctcatggtcatgggtc3960

tgcccttgagcgtgtttgggtaggcatgtgcaatttgtctagcatgctgagtcatgtctt4020

tcctatttgcacacgtccatgtttatccatgtactttccctgtgtaccctccatgtacct4080

tgtgtactttcttcccttaaatcatggtattcttctgacagagccatatgtaccctaccc4140

tgcacattgttatgcacttttccccaattcatgtttggtggggccatccacaccctctcc4200

ttgtcacagaatctccatttctgctcagattccccccatctccattgcattcatgtacta4260

ccctcagtctacactcacaatcatcttctcccaagactgctcccttttgttttgtgtttt4320

tttgaggggaattaaggaaaaataagtgggggcaggtttggagagctgcttccagtggat4380

agttgatgagaatcctgaccaaaggaaggcacccttgactgttgggatagacagatggac4440

ctatggggtgggaggtggtgtccctttcacactgtggtgtctcttggggaaggatctccc4500

cgaatctcaataaaccagtgaacagtgtgactcggcaaaaaaaaaaa4547

<210>5

<211>4297

<212>dna

<213>人

<400>5

cgttcctttcctcctcgaggttgcatcccccctcccctccccgcccctccgactgtcgct60

cccacctcggcgctcgcttccctccccgcccccttcctgcctccccagctcccgcccgcc120

cccccaccccccgctgccgcgcgccgcccgtgacgtcagagccccctcccagccccacat180

ctccctcctgctcctcctcctcccctccgtcggtcagtcagtccgcgaggagagtccgcg240

gtggcggcgacggtggcgagagccgcgggggccgtaggaagccaaccttccctgcttctc300

cggggccctcgccccctcctccccacaaaatcagggatggaggcgcctccccggcaccct360

cttagcagccctccccaggaaaagtgtcccccctgagctcctaacgctccccaacagcta420

cccctgccccccacgccatggggcccggggccccttttgcccgggtggggtggccactgc480

cgcttctggttgtgatggcggcaggggtggctccggtgtgggcctcccactccccccatc540

tcccgcggcctcactcgcgggtccccccgcacccctcctcagaacggcgcgcagtgtaca600

tcggggcactgtttcccatgagcgggggctggccagggggccaggcctgccagcccgcgg660

tggagatggcgctggaggacgtgaatagccgcagggacatcctgccggactatgagctca720

agctcatccaccacgacagcaagtgtgatccaggccaagccaccaagtacctatatgagc780

tgctctacaacgaccctatcaagatcatccttatgcctggctgcagctctgtctccacgc840

tggtggctgaggctgctaggatgtggaacctcattgtgctttcctatggctccagctcac900

cagccctgtcaaaccggcagcgtttccccactttcttccgaacgcacccatcagccacac960

tccacaaccctacccgcgtgaaactctttgaaaagtggggctggaagaagattgctacca1020

tccagcagaccactgaggtcttcacttcgactctggacgacctggaggaacgagtgaagg1080

aggctggaattgagattactttccgccagagtttcttctcagatccagctgtgcccgtca1140

aaaacctgaagcgccaggatgcccgaatcatcgtgggacttttctatgagactgaagccc1200

ggaaagttttttgtgaggtgtacaaggagcgtctctttgggaagaagtacgtctggttcc1260

tcattgggtggtatgctgacaattggttcaagatctacgacccttctatcaactgcacag1320

tggatgagatgactgaggcggtggagggccacatcacaactgagattgtcatgctgaatc1380

ctgccaatacccgcagcatttccaacatgacatcccaggaatttgtggagaaactaacca1440

agcgactgaaaagacaccctgaggagacaggaggcttccaggaggcaccgctggcctatg1500

atgccatctgggccttggcactggccctgaacaagacatctggaggaggcggccgttctg1560

gtgtgcgcctggaggacttcaactacaacaaccagaccattaccgaccaaatctaccggg1620

caatgaactcttcgtcctttgagggtgtctctggccatgtggtgtttgatgccagcggct1680

ctcggatggcatggacgcttatcgagcagcttcagggtggcagctacaagaagattggct1740

actatgacagcaccaaggatgatctttcctggtccaaaacagataaatggattggagggt1800

cccccccagctgaccagaccctggtcatcaagacattccgcttcctgtcacagaaactct1860

ttatctccgtctcagttctctccagcctgggcattgtcctagctgttgtctgtctgtcct1920

ttaacatctacaactcacatgtccgttatatccagaactcacagcccaacctgaacaacc1980

tgactgctgtgggctgctcactggctttagctgctgtcttccccctggggctcgatggtt2040

accacattgggaggaaccagtttcctttcgtctgccaggcccgcctctggctcctgggcc2100

tgggctttagtctgggctacggttccatgttcaccaagatttggtgggtccacacggtct2160

tcacaaagaaggaagaaaagaaggagtggaggaagactctggaaccctggaagctgtatg2220

ccacagtgggcctgctggtgggcatggatgtcctcactctcgccatctggcagatcgtgg2280

accctctgcaccggaccattgagacatttgccaaggaggaacctaaggaagatattgacg2340

tctctattctgccccagctggagcattgcagctccaggaagatgaatacatggcttggca2400

ttttctatggttacaaggggctgctgctgctgctgggaatcttccttgcttatgagacca2460

agagtgtgtccactgagaagatcaatgatcaccgggctgtgggcatggctatctacaatg2520

tggcagtcctgtgcctcatcactgctcctgtcaccatgattctgtccagccagcaggatg2580

cagcctttgcctttgcctctcttgccatagttttctcctcctatatcactcttgttgtgc2640

tctttgtgcccaagatgcgcaggctgatcacccgaggggaatggcagtcggaggcgcagg2700

acaccatgaagacagggtcatcgaccaacaacaacgaggaggagaagtcccggctgttgg2760

agaaggagaaccgtgaactggaaaagatcattgctgagaaagaggagcgtgtctctgaac2820

tgcgccatcaactccagtctcggcagcagctccgctcccggcgccacccaccgacacccc2880

cagaaccctctgggggcctgcccaggggaccccctgagccccccgaccggcttagctgtg2940

atgggagtcgagtgcatttgctttataagtgagggtagggtgagggaggacaggccagta3000

gggggagggaaagggagaggggaagggcaggggactcaggaagcagggggtccccatccc3060

cagctgggaagaacatgctatccaatctcatctcttgtaaatacatgtccccctgtgagt3120

tctgggctgatttgggtctctcatacctctgggaaacagacctttttctctcttactgct3180

tcatgtaattttgtatcacctcttcacaatttagttcgtacctggcttgaagctgctcac3240

tgctcacacgctgcctcctcagcagcctcactgcatctttctcttcccatgcaacaccct3300

cttctagttaccacggcaacccctgcagctcctctgcctttgtgctctgttcctgtccag3360

caggggtctcccaacaagtgctctttccaccccaaaggggcctctccttttctccactgt3420

cataatctctttccatcttacttgcccttctatactttctcacatgtggctccccctgaa3480

ttttgcttcctttgggagctcattcttttcgccaaggctcacatgctccttgcctctgct3540

ctgtgcactcacgctcagcacacatgcatcctcccctctcctgcgtgtgcccactgaaca3600

tgctcatgtgtacacacgcttttcccgtatgctttcttcatgttcagtcacatgtgctct3660

cgggtgccctgcattcacagctacgtgtgcccctctcatggtcatgggtctgcccttgag3720

cgtgtttgggtaggcatgtgcaatttgtctagcatgctgagtcatgtctttcctatttgc3780

acacgtccatgtttatccatgtactttccctgtgtaccctccatgtaccttgtgtacttt3840

cttcccttaaatcatggtattcttctgacagagccatatgtaccctaccctgcacattgt3900

tatgcacttttccccaattcatgtttggtggggccatccacaccctctccttgtcacaga3960

atctccatttctgctcagattccccccatctccattgcattcatgtactaccctcagtct4020

acactcacaatcatcttctcccaagactgctcccttttgttttgtgtttttttgagggga4080

attaaggaaaaataagtgggggcaggtttggagagctgcttccagtggatagttgatgag4140

aatcctgaccaaaggaaggcacccttgactgttgggatagacagatggacctatggggtg4200

ggaggtggtgtccctttcacactgtggtgtctcttggggaaggatctccccgaatctcaa4260

taaaccagtgaacagtgtgactcggcaaaaaaaaaaa4297

<210>6

<211>4361

<212>dna

<213>人

<400>6