一步法制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法与流程

本发明属于碳纳米材料制备和免疫检测分析技术领域，涉及一步法制备氨基胶体碳，与之对应的抗体标记方法，以及在生物免疫检测领域的潜在应用。

背景技术：

免疫层析分析方法是药残、真菌毒素快检领域常用的方法，具有操作简便、快速定性或半定量、灵敏度较高等特点，对于大量样本的现场初筛具有很大优势，目前市面上主要是胶体金免疫层析产品。相比于胶体金，胶体碳有着独特的优势：原料来源广泛、廉价，容易制备，成本更低，受ph值和盐浓度等因素影响小，更稳定；抗体标记效率高；黑白色差大，信噪比高，灵敏度更高，检测范围更广；生物兼容性好，无污染，更环保。自1993年vanamerongen等人将胶体碳作为一种新的标记物，用于免疫检测以来，胶体碳在生物快检领域得到了长足的发展，使之替代胶体金成为可能。

胶体碳的制备方法主要有水热法、超声法、模板法等，其中水热法具有成本低、产量高，所得产物富含丰富的官能团等特点，微波水热法进一步降低了反应时间，提高了反应时效，通常前驱体有葡萄糖、蔗糖、果糖等，可制得粒径为100-2000nm的胶体碳。胶体碳的蛋白标记通常是靠电荷吸附，也可用胶体碳上的官能团偶联，如一般采用edc/nhs活化羧基再与蛋白的氨基偶联，因此种偶联方法在酸性环境下活化羧基最佳，而在酸性环境下，带羧基的胶体碳容易聚集，所以活化效率不高。胶体碳在碱性条件下溶解性很好，因此，需要开发一种具有氨基官能团的胶体碳，以及在碱性环境下偶联的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供了一种新的胶体碳的制备方法，该胶体碳富含伯氨基，同时也含有大量的羟基、羧基、醛基等其它可修饰基团。

为实现以上目的，本发明的技术方案是这样实现的：

1、一种新的氨基胶体碳的制备方法，包括如下步骤，

1）将糖类和酰氨糖类按比例2-10:1溶于稀碱溶液中，于微波消解仪中反应，反应压力为1.0-1.5mpa，温度为170-210℃，时间10-120min。

2）将步骤1）所得产物离心，洗涤数次得沉淀。

3）将步骤2）所得沉淀冷冻干燥得固体粉末，即为氨基胶体碳。

优选的，步骤1）中糖类选择葡萄糖，酰氨糖类选择n-乙酰-d-氨基葡萄糖，优选比例为4:1。

优选的，步骤1）中稀碱溶液选择5mm的naoh溶液，葡萄糖浓度为10%（w/v），乙酰氨基葡萄糖浓度2.5%（w/v）。

优选的，步骤1）微波消解仪设置为压力主控1.2mpa，温度185℃，时间为20min，功率400w。

优选的，步骤2）离心力8000g15min，洗涤溶液为水和乙醇，各洗涤三次。

优选的，步骤3）冷冻干燥时间为6-10小时。

优选的，步骤1）-3）所得胶体碳粒径为200nm，pdi<0.1。

本发明的另一目的是提出了利用该胶体碳的氨基标记抗体的方法，使标记物具有更高的稳定性，且不会导致胶体碳的聚集，可用于侧向流层析免疫分析，适合药残、真菌毒素残留等领域的检测。

2、一种氨基胶体碳标记抗体的方法，包括如下步骤，

1）称取固体胶体碳溶于稀碱溶液中，冰浴超声5-10min，使之充分分散，得到单分散胶体碳溶液。

2）取二缩水甘油醚加入至步骤1）的胶体碳溶液中，室温反应过夜，二缩水甘油醚的终浓度为0.01%-0.05%。

3）将抗体用抗体稀释液稀释至0.2-1mg/ml，逐滴加入至步骤2）的溶液中，室温反应过夜。

4）用缓冲液配制bsa母液，加入至步骤3）的溶液中，室温反应1-2小时。

5）将步骤4）得到的溶液离心，去掉上清，并用bsa溶液洗涤两次。

6）将步骤5）的沉淀用复溶液复溶至初始体积，即得免疫碳溶液，4℃保存。

优选的，步骤1）胶体碳浓度为0.1%（w/v），稀碱溶液为ph=11的naoh水溶液，冰浴超声5min。

优选的，步骤2）二缩水甘油醚为乙二醇二缩水甘油醚或丙二醇二缩水甘油醚，终浓度为0.02%，室温（25℃）反应16小时。

优选的，步骤3）抗体稀释液为0.05mph8.5的tris缓冲液，抗体终浓度为0.02-0.1mg/ml，室温（25℃）反应14小时。

优选的，步骤4）缓冲液为0.05mph8.5的tris缓冲液，bsa母液浓度为10%（w/v），bsa终浓度为1%（w/v），室温（25℃）2小时。

优选的，步骤5）离心力8000g15min，bsa溶液浓度为1%（w/v），0.05mph8.5的tris缓冲液配制。

优选的，步骤6）复溶液配方为：称取2gbsa、0.878gnacl、243mgtris、10g蔗糖、50mgnan3于100ml烧杯中，加入70ml超纯水溶解，调ph至9.0，后定容至100ml。

本发明提供了一种新的氨基胶体碳的制备方法和蛋白标记技术，主要创新之处在于：

传统的胶体碳虽然具有大量的羟基、羧基等亲水性基团，理论上可以用来标记蛋白质，但在实际操作过程中或多或少会出现各种问题，如活化条件（酸性或中性）易使碳析出而聚集，传统胶体碳及羧基胶体碳均富含大量羧基，在酸性和中性环境中溶解性明显低于在碱性环境中，但在碱性环境中活化剂如edc易失活从而失去作用，因此传统胶体碳和羧基胶体碳主要还是以电荷吸附的形式组成碳-蛋白复合物，该复合物显然没有通过共价键偶联的复合物稳定性好。本发明制备的氨基胶体碳则解决了共价偶联的问题，该胶体碳不仅富含羟基、羧基，也含有大量的氨基，从而提供了一种以氨基作为偶联官能团的可能。本发明的另一创新点在于微波一步法制得含氨基的胶体碳，相比于其它通过后期修饰制得的氨基胶体碳，省去了大量的实验步骤和人工，成本低，绿色环保，具有高时效性，由微波消解仪程序控制反应条件，重复性好，制备的胶体碳形貌均一，可批量制备。本发明的抗体标记方法，采用环氧基分子作为胶体碳氨基与蛋白氨基的反应桥梁，反应环境为微碱性条件，完美地解决了胶体碳在酸性和中性易聚集的问题，从而提高了碳-蛋白复合物的稳定性。

附图说明

图1是实施例1所述的胶体碳的透射电子显微镜扫描图；

图2是实施例1所述的胶体碳的傅里叶红外图谱；

图3是实施例2所述的胶体碳的透射电子显微镜扫描图；

图4是氨基胶体碳标记抗体的反应示意图；

图5是呕吐毒素胶体碳试纸条标准曲线。

具体实施方式

为了方便理解本发明，下面具体列举了部分实施例，配合附图对本发明做进一步阐释，但不限于本文所描述的实施例。

实施例1

平均粒径200nm的氨基胶体碳的制备方法，步骤如下：

称取2.0g葡萄糖和0.5gn-乙酰-d-氨基葡萄糖溶于20ml5mm的naoh溶液中，混匀后转移至聚四氟乙烯消解罐中，插入温度计，安装好消解罐，设置微波消解仪程序：

运行程序开始反应，结束后自然降压降温，完毕后将反应产物转移至50ml离心管中，8000g离心15min，取出去上清，沉淀用水和乙醇各洗涤三次，最后冷冻干燥6小时，得到棕色粉末。通过透射电镜观察，如图1所示，所得胶体碳形貌规则，为圆球形，粒径约在200nm左右；通过动态光散射测得水合粒径为293.9nm，pdi为0.091；傅里叶红外图谱如图2所示，1616.87cm^-1（n-h弯曲振动吸收峰）、1052.33cm^-1（c-n伸缩振动吸收峰）、792.63cm^-1（n-h面外变形振动吸收峰），三个吸收峰说明了氨基的存在，而2926.82cm^-1（o-h伸缩振动吸收峰）、1702.28cm^-1（c=o伸缩振动吸收峰）说明了羧基的存在。

实施例2

平均粒径1μm的氨基胶体碳的制备方法，步骤如下：

称取2.0g蔗糖和0.5gn-乙酰-d-氨基葡萄糖溶于20ml5mm的naoh溶液中，混匀后转移至聚四氟乙烯消解罐中，插入温度计，安装好消解罐，设置微波消解仪程序：

运行程序开始反应，结束后自然降压降温，完毕后将反应产物转移至50ml离心管中，6000g离心15min，取出去上清，沉淀用水和乙醇各洗涤三次，最后冷冻干燥8小时，得到黑色粉末。通过透射电镜观察，如图3所示，所得胶体碳形貌为圆球形，粒径约在1μm左右。通过动态光散射测得水合粒径为1216nm，pdi为0.086。

实施例3

氨基胶体碳标记呕吐毒素抗体的方法，反应流程如图4所示，具体操作步骤如下：

称取1mg胶体碳，加入1mlph11的naoh溶液，冰浴超声5min，得到浓度为0.1%（w/v）的单分散胶体碳溶液。取1μl乙二醇二缩水甘油醚，加9μlph11的naoh溶液混匀，再取2μl该混匀液加入到上述单分散胶体碳溶液中，室温反应16小时，得到胶体碳活化液。取2μg呕吐毒素抗体，用0.05mph8.5的tris缓冲液稀释成0.5mg/ml的抗体溶液，逐滴加入至胶体碳活化液中，室温反应14小时。向反应液中加入110μl10%的bsa溶液（0.05mph8.5的tris缓冲液配制），室温反应2小时，结束后将反应产物转移至离心管，8000g离心15min，去掉上清，用1%bsa溶液（0.05mph8.5的tris缓冲液配制）洗涤两次，沉淀用复溶液复溶至1ml，4℃保存备用。

实验验证：如图5所示，使用该免疫碳制备的试纸条，曲线范围为1-80ppb，配合仪器读数，可以看出各点区分度很好（t/c比值），仪器读数见下表。