一种联合检测Aβ-40和Aβ-42的检测试剂条及其应用的制作方法

本发明属于蛋白检测领域，涉及一种联合检测aβ-40和aβ-42的检测试剂条及其应用，尤其涉及一种基于磁微粒和化学发光技术的联合检测aβ-40和aβ-42的检测试剂条及其应用。
背景技术：
：据统计，全球有近3000万阿尔兹海默症(alzheimerdisease，ad)患者。阿尔兹海默症对老年人的危害及其严重，确诊后平均生存期仅10年，目前仍属于医学界无法治愈的恶性老年精神疾病。对于60岁以上的人群，随着年龄的增长，阿尔兹海默症的发病率急剧升高。在中国，65岁以上人群的阿尔兹海默症发病率为7％，85岁以上人群的发病率为25％，而95岁以上人群的发病率则高达60％。早期阿尔兹海默症无明显症状，难以诊断，极易被误诊。阿尔兹海默症研究协会认为，阿尔兹海默症的病变进展缓慢，早期诊断、早期干预能够显著延缓病变的发生，对于降低发病率至关重要，有利于维持患者的正常生活。同时，早期诊断有助于区分阿尔兹海默症患者和阿尔兹海默症疑似病患者，提高诊断准确性。β淀粉样蛋白(aβ)是淀粉样蛋白前体(app)经蛋白水解酶作用后的底物，由第21号染色体编码，是阿尔茨默海症的主要病理蛋白之一。app被至少3种酶加工，其切割途径包括分泌酶途径和分泌酶途径ii。在分泌酶途径中，app首先被β-分泌酶裂解，随后在γ-分泌酶作用下，被切割形成含有39-43个氨基酸的多肽。其中，aβ-42和aβ-40是最常见的亚型，aβ-42是由42-43个氨基酸组成的蛋白质片断，主要位于阿尔茨默海症患者的脑内；在脑脊液和血液中，aβ-40的含量远高于aβ-42，但aβ-42更具毒性，更易聚集。cn1928564a公开了一种检测aβ1-42抗体的方法及其试剂盒，该方法包括利用aβ1-42蛋白片段溶液包被固相支持物；将待检测的生物学样本加入固相支持物并孵育；清洗去除未结合的蛋白等杂物；再加入aβ1-42单克隆抗体溶液并孵育；清洗去除未结合的aβ1-42单克隆抗体加入经标记的第二抗体并孵育；清洗去除任何未结合的第二抗体；检测孵育混合物中抗原抗体免疫结合复合物的存在量。所述检测方法具有较高的准确性，方法简便、实用，其采用竞争酶联免疫检测法，对抗体可以作定量检测，方法简便，适合临床普遍采用。然而尚未有现有技术用于aβ-40的检测，且酶联免疫检测无法避免外界激发光源背景信号的干扰，信噪比低、灵敏度差，不适用于阿尔兹海默症的早期诊断。因此，提供一种灵敏度高、特异性强、与自动化检测设备兼容性强的aβ-40检测试剂条，在阿尔兹海默症研究领域具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种联合检测aβ-40和aβ-42的检测试剂条及其应用，所述试剂条基于微流控技术和磁微粒化学发光技术，特异性强、灵敏度高、准确性好，aβ-40和aβ-42检测试剂均装载于试剂条上，实现了试剂条的集成一体化，与检测分析设备相配合，实现了aβ-40和aβ-42的自动化、高灵敏、快速联合检测，在于阿尔兹海默症的早期诊断领域具有重要意义。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种试剂条，所述试剂条1包括从上到下依次设置的储液腔层、流道层和反应腔层；所述储液腔层设置有至少一个储液腔4；所述反应腔层设置有至少一个反应腔2；所述流道层设置有微流通道8，用于连通储液腔4和反应腔2；所述储液腔4中装有检测试剂；所述检测试剂包括aβ-40捕获抗体偶联磁微粒、aβ-42捕获抗体偶联磁微粒、清洗液、aβ-40检测抗体、aβ-42检测抗体或反应液中的任意一种或至少两种的组合。本发明的试剂条采用微流通道连通储液腔和反应腔，不仅提高了检测效率，而且减少了样品和试剂的消耗量，有利于装载于自动化检测装置上实现分子的自动化可控检测。优选地，所述试剂条1还包括至少一个封口塞3，装载于储液腔4内。本发明中，将封口塞置于储液腔中，不仅保证了储液腔的密封性，避免了检测试剂在存储和运输过程中被污染，而且通过封口塞与动力挤压装置相互配合，将储液腔中的检测试剂压入微流通道进入反应腔，实现了试剂条的检测功能。优选地，所述封口塞3的外表面上设置有至少一个卡扣6，所述储液腔4的内表面上设置有至少两个卡槽7，通过与卡扣6连接限定封口塞3的位置。本发明中，通过卡扣与卡槽的连接，限定了封口塞在储液腔内的位置，当封口塞上的卡扣与储液腔内的第一卡槽相连接，封口塞处于储液位，检测试剂未流出，当封口塞上的卡扣与储液腔内的第二卡槽相连接，封口塞处于液体释放位，封口塞挤压储液袋使储液袋破裂，检测试剂流出。优选地，所述反应腔层的长度不小于所述储液腔层的长度。本发明中，反应腔层相对于储液腔层凸出的部分作为加样孔加入待测样本。优选地，所述反应腔层设置有隔板9，所述隔板9的高度小于所述反应腔层的高度。本发明通过在反应腔层中设置隔板，将反应腔层间隔为不同的反应腔，防止了相邻试剂发生交叉污染，增加了试剂条的准确性；此外，隔板的高度小于反应腔层的高度，使得在隔板上部留有适当空间，供磁微粒在不同反应腔间移动。优选地，所述隔板9的上表面包括平面、斜面或曲面中的任意一种，优选为斜面。优选地，所述试剂条1的底面设置有定位槽5，用于将所述试剂条1固定于检测仪器上。优选地，所述储液腔4的体积为10-500μl，例如可以是10μl、50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl、350μl、400μl、450μl或500μl。优选地，所述反应腔2的体积为10-500μl，例如可以是10μl、50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl、350μl、400μl、450μl或500μl。优选地，所述试剂条1采用高分子材料注塑形成。优选地，所述高分子材料包括丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯或聚乙烯中的任意一种或至少两种的组合，优选为聚甲基丙烯酸甲酯。优选地，所述储液腔4中装有检测试剂，所述检测试剂装于密封储液袋中。优选地，所述密封储液袋采用塑料薄膜、铝箔或铝塑复合材料中的任意一种或至少两种的组合制备得到，优选为采用铝塑复合材料制备得到。本发明的密封储液袋采用容易撕裂的密封方式密封，在封口塞的压力作用下，储液袋破裂，实现检测试剂的释放。优选地，所述检测试剂包括aβ-40捕获抗体偶联磁微粒、aβ-42捕获抗体偶联磁微粒、清洗液、aβ-40检测抗体、aβ-42检测抗体或反应液中的任意一种或至少两种的组合，优选为aβ-40捕获抗体偶联磁微粒、aβ-42捕获抗体偶联磁微粒、清洗液、aβ-40检测抗体、aβ-42检测抗体和反应液的组合。优选地，所述磁微粒的粒径为0.1-10μm，例如可以是0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm。优选地，所述检测仪器包括动力挤压装置、磁微粒移动控制装置或信号检测装置中的任意一种或至少两种的组合，优选为动力挤压装置、磁微粒移动控制装置和信号检测装置的组合。本发明中，以aβ-40的检测过程为例，所述试剂条的工作过程如下：(1)将aβ-40捕获抗体偶联磁微粒溶液、清洗液、aβ-40检测抗体溶液和反应液分别装入储液袋密封，分别放置于相应的储液腔4中；(2)在试剂条1储存和运输时，将封口塞3插入储液腔4，使封口塞3上的卡扣6与储液腔4内的第一卡槽连接，封口塞3处于储液位；(3)在实验中，首先将试剂条1放入检测分析仪器中，仪器的动力挤压装置挤压封口塞3，使封口塞3上的卡扣6与储液腔内的第二卡槽连接，储液袋破裂，检测试剂通过微流通道8流入反应腔2；(4)随后向试剂条1的第一反应腔中加入待测样本，与aβ-40捕获抗体偶联磁微粒孵育；(5)仪器的磁微粒移动控制装置将第一反应腔内的磁微粒富集后，通过反应腔之间的隔板9上部的空间，将磁微粒转移至第二反应腔，进行磁微粒清洗；(6)采用相同步骤，将磁微粒分别转移至相邻反应腔，最后分析仪器的信号检测装置采集信号，软件处理后输出分析结果。第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的试剂条在检测aβ-40、经过1-20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的具有aβ-40活性的氨基酸序列、aβ-42或经过1-20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的具有aβ-42活性的氨基酸序列中的应用。第三方面，本发明提供了一种联合检测aβ-40和aβ-42的方法，所述方法包括以下步骤：(1)采用如第一方面所述的试剂条检测aβ-40和aβ-42的化学发光值；(2)将aβ-40的化学发光值除以aβ-42的化学发光值，进行aβ-40和aβ-42的联合检测。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的试剂条利用微流控技术，采用微流通道连通储液腔和反应腔，不仅提高了检测效率，而且减少了样品和试剂的消耗量，有利于装载于自动化检测装置上实现aβ-40和/或aβ-42的自动化可控检测；(2)本发明的试剂条中的检测试剂集成于所述试剂条中，利用封口塞对储液袋的挤压作用将密封于储液袋中的检测试剂释放到反应腔中，避免了试剂污染，降低了运输成本；(3)本发明的试剂条装载于检测仪器上，除了加入待测样品以外，所有实验操作，包括检测试剂的释放、磁微粒的转移和信号的检测，均由分析仪器自动完成，操作简便易行，消除了开放体系可能存在的污染和人为操作引起的实验误差，在aβ-40和/或aβ-42早期检测中具有重要应用。附图说明图1为本发明试剂条的东南等轴示意图，其中，1-试剂条，2-反应腔，3-封口塞，4-储液腔，5-定位槽；图2为本发明试剂条的右视示意图，其中，3-封口塞，5-定位槽；图3为本发明试剂条的局部东南等轴剖视示意图，其中，6-卡扣，7-卡槽，8-微流通道，9-隔板；图4为本发明试剂条的整体东南等轴剖视示意图，其中，10-磁微粒储液腔，11-第一清洗液储液腔，12-第二清洗液储液腔，13-检测抗体储液腔，14-第三清洗液储液腔，15-第四清洗液储液腔，16-化学发光反应液储液腔，17-样本孵育腔，18-第一清洗腔，19-第二清洗腔，20-检测抗体孵育腔，21-第三清洗腔，22-第四清洗腔，23-化学发光检测腔；图5为采用本发明试剂条检测aβ-40浓度的标准曲线；图6为采用本发明试剂条检测aβ-42浓度的标准曲线；图7为采用本发明试剂条检测样本的aβ-40/aβ-42的化学发光结果。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1试剂条的组装本实施例的试剂条的东南等轴示意图如图1所示，右视示意图如图2所示，局部东南等轴剖视示意图如图3所示，整体东南等轴剖视示意图如图4所示。所述试剂条1包括从上到下依次设置的储液腔层、流道层和反应腔层；所述储液腔层设置有七个储液腔4，分别为磁微粒储液腔10、第一清洗液储液腔11、第二清洗液储液腔12、检测抗体储液腔13、第三清洗液储液腔14、第四清洗液储液腔15和化学发光反应液储液腔16；所述反应腔层设置有七个反应腔2，分别为样本孵育腔17、第一清洗腔18、第二清洗腔19、检测抗体孵育腔20、第三清洗腔21、第四清洗腔22和化学发光检测腔23；所述流道层设置有七个微流通道8，用于连通储液腔和对应的反应腔；所述反应腔层的长度大于所述储液腔层的长度；所述试剂条1还包括七个封口塞，装载于对应的储液腔内；所述封口塞3的外表面上设置有一个卡扣6，所述储液腔4的内表面上设置有两个高度不同的卡槽7，通过与卡扣6连接限定封口塞3的位置；所述反应腔层设置有隔板9，将反应腔层间隔为反应腔17、18、19、20、21、22和23，所述隔板9的高度小于所述反应腔层的高度；所述隔板9的上表面为斜面；所述试剂条1的底面设置有定位槽5，用于将所述试剂条1固定于检测仪器上；所述储液腔4的体积为10-500μl；优选地，所述反应腔2的体积为10-500μl。以aβ-40的检测过程为例，本发明的试剂条的工作过程如下：(1)将aβ-40捕获抗体偶联磁微粒溶液、第一清洗液、第二清洗液、aβ-40检测抗体溶液、第三清洗液、第四清洗液和化学发光反应液分别装入储液袋密封，分别放置于磁微粒储液腔10、第一清洗液储液腔11、第二清洗液储液腔12、检测抗体储液腔13、第三清洗液储液腔14、第四清洗液储液腔15和化学发光反应液储液腔16中；(2)在试剂条1储存和运输时，将封口塞插入储液腔，使封口塞上的卡扣6与储液腔内的第一卡槽连接，封口塞处于储液位；(3)在实验中，首先将试剂条1放入检测分析仪器中，仪器的动力挤压装置挤压封口塞，使储液袋破裂，检测试剂通过微流通道流入反应腔；(4)随后向试剂条的样本孵育腔17中加入待测样本，与磁微粒孵育；(5)仪器的磁微粒移动控制装置将样本孵育腔17内的磁微粒富集后，通过样本孵育腔17和第一清洗腔18之间的隔板上部的空间，将aβ-40捕获抗体偶联磁微粒转移至第一清洗腔18，进行磁微粒清洗；(6)采用相同步骤，将aβ-40捕获抗体偶联磁微粒分别转移至第二清洗腔19、检测抗体孵育腔20、第三清洗腔21、第四清洗腔22和化学发光检测腔23，最后分析仪器的信号检测装置采集化学发光检测腔23的化学发光信号，软件处理后输出分析结果。实施例2aβ-40和aβ-42标准品的检测本实施例的试剂条采用聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)注塑形成，储液袋采用铝塑复合材料制备得到。分别将50μl抗aβ-40磁微粒溶液、100μl第一清洗液、100μl第二清洗液、100μl碱性磷酸酶标记抗aβ-40抗体、100μl第三清洗液、100μl第四清洗液和100μl碱性磷酸酶底物amppd反应液注入储液袋后，采用焊接技术封合，分别放置于磁微粒储液腔10、第一清洗液储液腔11、第二清洗液储液腔12、检测抗体储液腔13、第三清洗液储液腔14、第四清洗液储液腔15和化学发光反应液储液腔16中，得到所述试剂条。aβ-40标准品的制备包括将人工合成的aβ-40基因构建重组载体导入宿主菌，筛选后进行蛋白表达和纯化得到，aβ-40标准品采用tbs或pbs缓冲液稀释母液得到，浓度分别为400pg/ml、200pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml和0pg/ml。检测仪器一次可完成8个试剂条的检测，本实施例中，将8个试剂条的封口膜撕去，向磁微粒储液腔10中加入不同浓度的aβ-40标准品100μl，放入检测仪器启动检测，动力挤压装置将储液腔的试剂加入到对应的反应腔中；仪器的温控平台保持试剂条所处的温度为37℃，此时aβ-40标准品与修饰有捕获抗体的0.1μm磁微粒在适宜的温度下反应10-15min；随后，启动磁微粒转移装置，仪器的磁微粒吸附和转移装置将样本由样本孵育腔分别通过第一清洗腔和第二清洗腔，进行磁微粒清洗；将清洗完的磁微粒转移至检测抗体孵育腔，捕获有aβ-40的磁微粒与碱性磷酸酶标记抗aβ-40抗体混合，37℃反应10-15min；启动磁微粒转移装置，仪器的磁微粒吸附和转移装置将样本由检测孵育腔分别通过第三清洗腔和第四清洗腔，进行磁微粒清洗；将清洗完的磁微粒转移至化学发光检测腔，进行化学发光检测。采用同样的试剂条和方法对aβ-42标准品进行检测化学发光检测。aβ-40标准品的化学发光值如表1和图5所示，线性回归方程为y＝1.6882x+240.73，相关性系数为r2＝0.991；aβ-42标准品的化学发光值如表1和图6所示，线性回归方程为y＝1.2913x+265.39，相关性系数为r2＝0.9919；aβ-40浓度和aβ-42浓度与化学发光值之间具有良好的线性关系，说明试剂条和仪器的可靠性和准确性。表1aβ-40浓度(pg/ml)发光值aβ-42浓度(pg/ml)发光值400931.42400799.31200539.86200499.86100419.13100371.5250319.8150323.7425307.4925304.1212.5277.3112.5293.96.25257.726.25287.640213.090268实施例3aβ-40/aβ-42临床样品的检测本实施例的试剂条采用丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(abs)注塑形成，储液袋采用铝塑复合材料制备得到。分别将50μl抗aβ-40磁微粒溶液、100μl第一清洗液、100μl第二清洗液、100μl碱性磷酸酶标记抗aβ-40抗体、100μl第三清洗液、100μl第四清洗液和100μl碱性磷酸酶底物amppd反应液注入储液袋后，采用焊接技术封合，分别放置于磁微粒储液腔10、第一清洗液储液腔11、第二清洗液储液腔12、检测抗体储液腔13、第三清洗液储液腔14、第四清洗液储液腔15和化学发光反应液储液腔16中，得到aβ-40检测试剂条；分别将50μl抗aβ-42磁微粒溶液、100μl第一清洗液、100μl第二清洗液、100μl碱性磷酸酶标记抗aβ-42抗体、100μl第三清洗液、100μl第四清洗液和100μl碱性磷酸酶底物amppd反应液注入储液袋后，采用焊接技术封合，分别放置于磁微粒储液腔10、第一清洗液储液腔11、第二清洗液储液腔12、检测抗体储液腔13、第三清洗液储液腔14、第四清洗液储液腔15和化学发光反应液储液腔16中，得到aβ-42检测试剂条。选取阿尔兹海默症患者和正常人的全血样本各16例，4℃下3000rpm/min离心10min，收集血浆或血清，-80℃保存；将样本采用pbs或tbs缓冲液稀释5倍，吸取50μl加入试剂条，放入仪器中进行检测，结果如表2(a)、表2(b)、表2(c)和图7所示，可以看出，相较于正常人血浆aβ-40/aβ-42的比值，阿尔兹海默症患者血浆aβ-40/aβ-42的比值显著提高，这与文献报道的阿尔兹海默症患者体内aβ-42聚集、沉积、aβ-42含量降低，aβ-40/aβ-42的浓度比值升高的结果相同，说明本实施例试剂条的检测结果具有参考性。表2(a)表2(b)表2(c)综上所述，本发明的试剂条利用微流控技术，采用微流通道连通储液腔和反应腔，不仅提高了检测效率，而且减少了样品和试剂的消耗量，有利于装载于自动化检测装置上实现分子的自动化可控检测；检测试剂集成于试剂条中，利用封口塞对储液袋的挤压作用将密封于储液袋中的检测试剂释放到反应腔中，避免了试剂污染，降低了运输成本；试剂条装载于检测仪器上，除了加入待测样品以外，所有实验操作，包括检测试剂的释放、磁微粒的转移和信号的检测，均由分析仪器自动完成，操作简便易行，消除了开放体系可能存在的污染和人为操作引起的实验误差；采用本发明的试剂条进行aβ-40/aβ-42的检测，患者的aβ-40/aβ-42比值显著高于正常人，与文献报道的aβ-42聚集、沉积、aβ-42含量降低，aβ-40/aβ-42的浓度比值升高的结果相同，说明本实施例试剂条的检测结果具有参考性。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12