一种检测方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种抗体检测方法。
背景技术：
：快速检测在临床检测领域应用越来越广泛。其中，免疫层析试纸条因其简便快捷而在临床检测中得到广泛应用。在抗体检测领域，免疫层析试纸条多为双抗原夹心法。而间接法则不为接受，原因在于，血清中含有高浓度的抗体，当将血清添加到免疫层析试纸条的样品垫时，血清中的抗体会与结合垫上的信号标记的抗人igg结合，但血清中的抗体含量远大于结合垫上的抗人igg，因而，检测信号会大幅度降低，甚至没有。一个解决方案是采用稀释法将血清进行稀释，但这样同样会降低阳性检出率。所以，普遍认为“间接法免疫层析试纸条大都属于垃圾”。所以，一般情况下，多采用免疫渗滤法进行间接法测抗体。但免疫渗滤法需要多次加液操作，影响了该方法的应用。也有采用在不同层析方向(如idexx公司的snap)和不同泳道(如chembio公司的双通道免疫层析检测卡)的方式来解决这一问题，但是这些免疫层析产品生产工艺复杂，成本高昂，而且容易出现因为搭接不紧密引起的层析失败等问题。技术实现要素：本发明就“间接法免疫层析试纸条大都属于垃圾”这一问题提供一种检测方法。本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：一种检测抗体的免疫层析法，其特征在于，所用免疫层析试纸条的层析膜上有检测线，检测线处包被有检测抗原；检测生物样本时，生物样本先流过层析膜，信号标记的抗抗体随后流过层析膜。如上所述的检测抗体的免疫层析法，其特征在于，所述抗抗体是指能够与样本中的抗体发生特异性结合的生物分子，可以是二抗，还可以是proteing、proteina、proteinl、与目标抗体特异结合的抗原等能够与抗体发生特异性结合的生物分子。如上所述的检测抗体的免疫层析法，其特征在于，生物样本的加样位置位于样品垫的近层析膜端，信号标记的抗抗体的加样位置位于样品垫的远层析膜端。如上所述的检测抗体的免疫层析法，其特征在于，生物样本的加样位置与信号标记的抗抗体的加样位置为同一位置：检测生物样本时，先加生物样本，再加信号标记的抗抗体。如上所述的检测抗体的免疫层析法，其特征在于，所述免疫层析试纸条还可以是包括pvc底板、以及依次搭接粘贴到pvc底板上的样品垫1、样品垫2、层析膜、吸水纸的装置；检测生物样本时，首先将生物样本加到试纸条的样品垫2上，然后再将信号标记的抗抗体加到样品垫1上。如上所述的检测抗体的免疫层析法，其特征在于，所述信号为纳米有色金属颗粒、高聚物颗粒、荧光分子、荧光颗粒等可作为生物标记物的物质。一种检测抗体的装置，其特征在于，包括结合物滴瓶和免疫层析试纸条，结合物滴瓶中含有信号标记的抗抗体。如上所述的检测抗体的装置，其特征在于，免疫层析试纸条包括pvc底板，以及依次搭接粘贴在pvc底板上的样品垫、层析膜、吸水纸。如上所述的检测抗体的装置，其特征在于，层析膜上有检测线和质控线，检测线上包被有抗原。如上所述的检测抗体的装置，其特征在于，检测生物样本时，先滴加生物样本到样品垫上，然后再滴加信号标记的抗抗体到样品垫上。如上所述的检测抗体的装置，其特征在于，样品垫上有加样区1和加样区2两个加样区，加样区1处于远离层析膜端，加样区2处于近层析膜端。如上所述的检测抗体的装置，其特征在于，检测生物样本时，先滴加生物样本到样品垫的加样区2，然后再滴加信号标记的抗抗体到样品垫的加样区1。如上所述的检测抗体的装置，其特征在于，所述免疫层析试纸条还可以是免疫层析检测卡，免疫层析检测卡包括免疫层析试纸条和塑料卡壳。如上所述的检测抗体的装置，其特征在于，免疫层析检测卡上有一个加样孔；检测生物样本时，先将生物样本加到加样孔中，然后再将信号标记的抗抗体加到加样孔中。如上所述的检测抗体的装置，其特征在于，免疫层析检测卡上有加样孔1和加样孔2两个加样孔，加样孔2处于近层析膜的位置；检测生物样本时，先将生物样本加到加样孔2中，然后再将信号标记的抗抗体加到加样孔1中。一种检测抗体的装置，其特征在于，包括检测微孔和免疫层析试纸条，检测微孔中含有信号标记的抗抗体；所述免疫层析试纸条包括pvc底板、以及依次搭接粘贴到pvc底板上的样品垫、层析膜、吸水纸；检测生物样本时，先将生物样本加到样品垫上层析，然后再将试纸条的样品垫一端插入含有信号标记的抗抗体的检测微孔中。本发明具有如下有益效果：本发明就间接法不适用于免疫层析检测这一问题提出了一种简便易行的解决方案。该方法摒弃了免疫渗滤卡繁琐的制卡过程、不易于批量生产的问题，同时兼顾了免疫层析试纸条易于使用、易于批量生产等优势，还保证了检测的灵敏性。附图说明图1为本发明免疫层析试纸条结构图5：检测线；6：质控线；7：样品垫；8：层析膜；9：吸水纸；10：pvc底板。图2为本发明免疫层析试纸条(两个样品垫)结构图5：检测线；6：质控线；8：层析膜；9：吸水纸；10：pvc底板；11：样品垫1；12：样品垫2。图3为本发明免疫层析检测卡结构图17：加样孔；3：观察孔；4：塑料卡壳；5：检测线；6：质控线。图4为本发明免疫层析检测卡(双加样孔)结构图1：加样孔1；2：加样孔2；3：观察孔；4：塑料卡壳。具体实施方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。以下结合实施例对本发明做进一步描述。实施例1检测血清中的布鲁氏菌抗体(1)层析膜的制备：将布鲁氏菌脂多糖(lps)稀释成2mg/ml，按照0.8μl/cm在硝酸纤维素膜(层析膜)上划线，作为检测线。将兔抗羊igg稀释成0.2mg/ml，按照0.8μl/cm在硝酸纤维素膜(层析膜)上划线，作为质控线。(2)试纸条的组装：将划好线的层析膜粘贴到pvc底板的中间位置，使检测线靠近样品垫方向，质控线靠近吸水纸方向。然后，在相应的位置粘贴好样品垫和吸水纸，使样品垫与层析膜、吸水纸与层析膜有约1mm左右的搭接。最后裁成3.5mm的免疫层析试纸条。制备好的免疫层析试纸条包括pvc底板、以及依次搭接粘贴到pvc底板上的样品垫、层析膜、吸水纸。置于干燥环境中，备用。(3)信号标记的抗抗体的制备：取10ml纳米金(30nm)溶液，加入100μl0.2m碳酸钾溶液，然后加入200μg羊抗人igg，混匀，室温静置20min；然后加入1ml10％bsa封闭20min。10000rpm4℃离心10min，弃掉上清。用10ml复溶液(10mmtris-hcl，ph7.5)重悬纳米金颗粒，置于4℃，备用。(4)检测人血清中的布鲁氏菌抗体：将试纸条平放于台面上，添加5μl血清于免疫层析试纸条的样品垫上，然后滴加2滴(约100μl)纳米金颗粒标记羊抗人igg，10min后观察结果。还可以按照如下方法检测：添加5μl血清于免疫层析试纸条的样品垫上，将试纸条的样品垫端插入含有200μl纳米金颗粒标记羊抗人igg的检测微孔中，15min后观察结果。用含有不同浓度抗体的阴性血清将同一份布菌病人血清稀释10倍，分别用本实施例所提供的方案和传统间接法检测试纸条检测稀释后的血清，检测结果如表1所示。可以看出，本实施例抗干扰性明显好于传统间接法检测试纸条。表1血清中不同抗体浓度对于检测结果的影响血清中抗体浓度(g/l)51015202530本实施例+++++++++++++++++传统间接法检测试纸条+++++++++--注：所用传统试纸条为使用相同的原料制备的免疫层析试纸条。包括pvc底板、以及依次搭接粘贴到pvc底板上的样品垫、结合垫、层析膜、吸水纸。结合垫上有信号标记的抗抗体。试纸条检测线处包被的是抗原(lps)。结合垫上包被的纳米金标记的羊抗人igg。+代表阳性，+越多阳性越强；-代表阴性。实施例2检测牛奶中的结核杆菌抗体(1)层析膜的制备：将结核杆菌mpt83蛋白稀释成1mg/ml，按照0.8μl/cm在硝酸纤维素膜(层析膜)上划线，作为检测线。将兔抗牛igg稀释成0.2mg/ml，按照0.8μl/cm在硝酸纤维素膜(层析膜)上划线，作为质控线。(2)试纸条的组装：将划好线的层析膜粘贴到pvc底板的中间位置，使检测线靠近样品垫方向，质控线靠近吸水纸方向。然后，在相应的位置粘贴好样品垫和吸水纸，使样品垫与层析膜、吸水纸与层析膜有约1mm左右的搭接。最后裁成3.5mm的免疫层析试纸条。制备好的免疫层析试纸条包括pvc底板、以及依次搭接粘贴到pvc底板上的样品垫1、样品垫2、层析膜、吸水纸。置于干燥环境中，备用。(3)信号标记的抗抗体的制备：取10ml纳米金(30nm)溶液，加入100μl0.2m碳酸钾溶液，然后加入200μgproteing，混匀，室温静置20min；然后加入1ml10％bsa封闭20min。10000rpm4℃离心10min，弃掉上清。用10ml复溶液(10mmtris-hcl，ph7.5)重悬纳米金颗粒，置于4℃，备用。(4)检测牛奶中的结核杆菌抗体：将试纸条平放于台面上，添加25μl牛奶于免疫层析试纸条的样品垫2上，然后滴加80μl纳米金颗粒标记proteing，10min后观察结果。(5)表2为本实施例检测141份牛奶样本中结核杆菌抗体的检测结果，与elisa方法完全一致。表2分别用本实施例方法和elisa检测牛奶样本实施例3检测水貂血清中的阿留申病毒抗体(1)层析膜的制备：将阿留申病毒vp2蛋白稀释成1mg/ml，按照0.8μl/cm在硝酸纤维素膜(层析膜)上划线，作为检测线。将羊抗水貂igg稀释成0.2mg/ml，按照0.8μl/cm在硝酸纤维素膜(层析膜)上划线，作为质控线。(2)试纸条的组装：将划好线的层析膜粘贴到pvc底板的中间位置，使检测线靠近样品垫方向，质控线靠近吸水纸方向。然后，在相应的位置粘贴好样品垫和吸水纸，使样品垫与层析膜、吸水纸与层析膜有约1mm左右的搭接。最后裁成3.5mm的免疫层析试纸条。制备好的免疫层析试纸条包括pvc底板、以及依次搭接粘贴到pvc底板上的样品垫、层析膜、吸水纸。免疫层析检测卡的组装：将切好的免疫层析试纸条装入塑料卡壳中，塑料卡壳上有观察孔和加样孔。观察孔用于观测检测结果。加样孔用于暴露免疫层析试纸条的样品垫位置，用于添加血清\血浆和信号标记的抗抗体。(3)信号标记的抗抗体的制备：胶体碳颗粒购自北京晶泰美康生物科技有限公司。参照试剂盒说明书标记羊抗水貂igg。(4)检测水貂血清中的阿留申病毒抗体：将免疫层析检测卡平放于台面上，添加5μl水貂血清于加样孔中，然后滴加80μl胶体碳标记的羊抗水貂igg，10min后观察结果。(5)表3为本实施例检测135份水貂血清样本中阿留申病毒抗体的检测结果，与elisa方法完全一致。表3分别用本实施例方法和elisa检测水貂血清样本实施例4检测血清中的口蹄疫病毒抗体(1)层析膜的制备：将口蹄疫3abc蛋白稀释成1mg/ml，按照0.8μl/cm在硝酸纤维素膜(层析膜)上划线，作为检测线。将羊抗猪igg稀释成0.2mg/ml，按照0.8μl/cm在硝酸纤维素膜(层析膜)上划线，作为质控线。(2)试纸条的组装：将划好线的层析膜粘贴到pvc底板的中间位置，使检测线靠近样品垫方向，质控线靠近吸水纸方向。然后，在相应的位置粘贴好样品垫和吸水纸，使样品垫与层析膜、吸水纸与层析膜有约1mm左右的搭接。最后裁成3.5mm的免疫层析试纸条。制备好的免疫层析试纸条包括pvc底板、以及依次搭接粘贴到pvc底板上的样品垫、层析膜、吸水纸。免疫层析检测卡的组装：将切好的免疫层析试纸条装入塑料卡壳中，塑料卡壳上有观察孔、加样孔1和加样孔2。观察孔用于观测检测结果。加样孔2用于暴露免疫层析试纸条的样品垫，用于添加血清\血浆；加样孔1暴露免疫层析试纸条的样品垫，用于添加信号标记的抗抗体。(3)信号标记的抗抗体的制备：取10ml纳米金(40nm)溶液，加入100μl0.2m碳酸钾溶液，然后加入200μgproteina，混匀，室温静置20min；然后加入1ml10％bsa封闭20min。10000rpm4℃离心10min，弃掉上清。用10ml复溶液(10mmtris-hcl，ph7.5)重悬纳米金颗粒，置于4℃，备用。(4)检测猪、羊和牛血清中的口蹄疫病毒抗体：将免疫层析检测卡平放于台面上，添加5μl血清于加样孔2中，然后滴加80μl纳米金颗粒标记的proteina到加样孔1中，10min后观察结果。(5)表4为本实施例检测157份猪、牛、羊血清样本中口蹄疫病毒抗体的检测结果，与elisa方法完全一致。表4分别用本实施例方法和elisa检测口蹄疫样本实施例5复溶液中葡聚糖对于检测结果的影响我们意外地发现，在复溶液中添加葡聚糖可以有效提高信号强度，降低检测背景，提高检测的灵敏性。下面以实施例1为例做进一步说明。往复溶液中添加不同浓度的葡聚糖，重选纳米金颗粒标记的抗抗体，检测10份阴阳性样本(5份阳性、5份阴性)，每个样品的每种情况重复测定3次。检测结果如下表5所示。表5复溶液中葡聚糖对于检测结果的影响注：2/3代表检测3次，2次检测结果为阳性，其他与之相同实施例6检测血清中hcv(丙型肝炎病毒)抗体(1)层析膜的制备：将hcv包被抗原(购自菲鹏生物)稀释成2mg/ml，按照0.8μl/cm在硝酸纤维素膜(层析膜)上划线，作为检测线。将牛血清白蛋白(bsa)多克隆抗体稀释成0.2mg/ml，按照0.8μl/cm在硝酸纤维素膜(层析膜)上划线，作为质控线。(2)试纸条的组装：将划好线的层析膜粘贴到pvc底板的中间位置，使检测线靠近样品垫方向，质控线靠近吸水纸方向。然后，在相应的位置粘贴好样品垫和吸水纸，使样品垫与层析膜、吸水纸与层析膜有约1mm左右的搭接。最后裁成3.5mm的免疫层析试纸条。制备好的免疫层析试纸条包括pvc底板、以及依次搭接粘贴到pvc底板上的样品垫、层析膜、吸水纸。置于干燥环境中，备用。(3)信号标记的抗抗体的制备：取10ml纳米金(30nm)溶液，加入100μl0.2m碳酸钾溶液，然后加入200μghcv检测抗原(购自菲鹏生物)，混匀，室温静置20min；然后加入1ml10％bsa封闭20min。10000rpm4℃离心10min，弃掉上清。用10ml复溶液(10mmtris-hcl，ph7.5)重悬纳米金颗粒，置于4℃，备用。(4)检测人血清中的hcv抗体：将试纸条平放于台面上，添加5μl血清于免疫层析试纸条的样品垫上，然后滴加2滴(约100μl)纳米金颗粒标记检测抗原，10min后观察结果。还可以按照如下方法检测：添加5μl血清于免疫层析试纸条的样品垫上，将试纸条的样品垫端插入含有200μl纳米金颗粒标记的hcv检测抗原的检测微孔中，15min后观察结果。用含有不同浓度抗体的阴性血清将同一份hcv抗体阳性血清稀释10倍，分别用本实施例所提供的方案和传统间接法检测试纸条检测稀释后的血清，检测结果如表1所示。可以看出，本实施例抗干扰性明显好于传统间接法检测试纸条。表1血清中不同抗体浓度对于检测结果的影响血清中抗体浓度(g/l)51015202530本实施例+++++++++++++++++传统间接法检测试纸条+++++++++--注：所用传统试纸条为使用相同的原料制备的免疫层析试纸条。包括pvc底板、以及依次搭接粘贴到pvc底板上的样品垫、结合垫、层析膜、吸水纸。结合垫上有信号标记的羊抗人igg。试纸条检测线处包被的是抗原(hcv包被抗原)。结合垫上包被的纳米金标记的羊抗人igg。+代表阳性，+越多阳性越强；-代表阴性。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。当前第1页12