一种肺癌标志物抗-HMGB3自身抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种肺癌标志物抗-hmgb3自身抗体及其应用。

背景技术：

肺癌是目前全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。据2017年全国肿瘤登记中心收集的全国恶性肿瘤登记资料显示，我国肺癌的发病率及死亡率位于恶性肿瘤第一位，且发病率和死亡率连年上升。肺癌的高发病率和肺癌患者的预后与其病程有着密切的联系，随着病程的发展，患者的生存率显著下降。以非小细胞肺癌为例，经过手术治疗的ⅰ期患者5年生存率为70–90%，而ⅳ期患者大多仅能通过姑息治疗来缓解临床症状，5年生存率极低。因此，早发现、早诊断是降低肺癌死亡率、改善患者生存状况的关键所在，所以，寻找有效的早期诊断技术和方法至关重要。目前，临床上多采用影像学检查检测肺癌，如胸部x线片、多排ct、低剂量螺旋ct等，但这些影像学检查方法通常具有较高的假阳性率，需长期随访复查，对于可疑患者，常导致过多的辐射暴露，同时不同程度地增加了患者的心理和经济负担。目前临床工作中，较常用于肺癌诊断的肿瘤标志物有cyfra21-1，cea，nse，scc等，但是对肺癌早期诊断敏感性较低，特异性亦不足，故对于发现与诊断早期肺癌价值有限。所以目前为止，尚没有理想的可供临床使用的肺癌早期筛查和诊断标志物。

免疫系统在肿瘤的发生、发展中发挥着不可或缺的作用。恶性肿瘤发生后，肿瘤细胞抗原能够激活人体的细胞和体液免疫系统，产生抗肿瘤细胞抗原的自身抗体。这些激活人体免疫系统的抗原称为肿瘤相关抗原（tumorassociatedantigen，taa），它们的本质是肿瘤发生、发展过程中细胞坏死或者凋亡后释放、脱落或者外分泌的特异蛋白产物。既往的研究显示，在肿瘤发生的早期，基于免疫系统的信号放大功能，即使只有低水平的肿瘤抗原被释放入血清，机体的免疫系统就可识别这些肿瘤特异性抗原而产生相应的自身抗体，这些抗体称为抗taas自身抗体。因具有早期可被检测出、样本稳定、较高特异度与灵敏度、检测方法简单等特征，抗taas自身抗体被认为有望成为新一代血清肿瘤标志物。各国学者已开展相关多项研究，其中earlycdt-lungtest是首个通过检测血清中自身抗体以检测肺癌的工具。新一版的earlycdt-lungtest中taas自身抗体共7种（p53,ny-eso-1,cage,gbu4-5,sox2,hud和magea4），其灵敏度和特异度分别为47%和90%。有研究显示，这些自身抗体结果阳性的非小细胞肺癌患者中超过一半为早期肺癌，提示earlycdt-lungtest可作为辅助ct早期检测肺癌的生物学标志物检查工具。有研究发现，在放射自显影技术检出非小细胞肺癌之前5年就可在患者体内检测到肿瘤相关抗原抗体。这些研究成果提示肿瘤相关抗原抗体的检测将有望成为肺癌早期检测的重要血清学生物标志物。但earlycdt-lungtest同样存在缺陷，其灵敏度仍然不够理想（不到50%），漏诊的病例较多，导致大量患者未能被及时发现，而错失手术治疗的良机。鉴于目前自身抗体检测在肺癌诊断的临床应用中仍有不足，不断地发现和鉴定新的肺癌相关taas仍是一项重要的工作。

综上所述，为了最终实现降低肺癌的死亡率，提高生存率，本领域迫切需要筛选和鉴定更加敏感、特异血清学自身抗体标志物，并开发操作简单、成本低、适用范围广泛的检测肺癌自身抗体的试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服肺癌现有肿瘤标志物不理想的问题，旨在提高肺癌早期诊断的灵敏度、特异度和准确性。利用一种特异性高、敏感度强的诊断标志物制备稳定性好、检测方便的用于肺癌早期检测的试剂盒。本发明具体提供一种肺癌早期检测标志物，具体涉及一种能区分肺癌和正常人的抗-hmgb3(high-mobilitygroupproteinb3)自身抗体。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种肺癌标志物，所述肺癌标志物为抗-hmgb3自身抗体。

第二方面，本发明提供了第一方面所述的抗-hmgb3自身抗体在制备用于肺癌血清学检测的试剂盒中的应用。

优选的，所述试剂盒是基于酶联免疫吸附试验（elisa）的检测体系。

优选的，所述试剂盒含有检测抗-hmgb3自身抗体的hmgb3重组纯化蛋白。

优选的，所述试剂盒还含有elisa包被缓冲液（20×）、hrp-rec-a二抗、封闭缓冲液（bsa）、elisa通用抗体稀释液及elisa-abts显色试剂、pbst（吐温20-磷酸盐缓冲液）。

第三方面，本发明提供了第一方面所述的肺癌标志物与传统肿瘤标志物cea、ca125或cyfra21-1联合使用在制备用于肺癌评价试剂盒中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明旨在提供一种操作简单、成本低、准确性高、无创伤的应用于临床的肺癌标志物及该标志物在制备用于肺癌检测的试剂盒。本发明研究发现应用elisa方法进行血清抗-hmgb3自身抗体的检测，可以较准确地将肺癌患者和正常人，以及良性肺病组（copd和慢性支气管炎）患者鉴别开来，并可以用于肺癌的早期检测。在此背景下提供此方便、快捷、有效的检测肺癌患者的标志物及该标志物在制备用于肺癌检测的试剂盒，可用于临床的肺癌早期诊断。

附图说明

图1为筛选、鉴定和评价肺癌抗-hmgb3自身抗体的技术路线图；

图2为测试阶段肺癌组和正常对照组抗-hmgb3自身抗体的滴度水平；

图3为roc曲线分析测试阶段抗-hmgb3自身抗体对肺癌的诊断效能；

图4为验证阶段肺癌组、良性肺病组和正常对照组抗-hmgb3自身抗体的滴度水平；

图5为roc曲线分析验证阶段抗-hmgb3自身抗体对肺癌的诊断效能(lc：肺癌组；n：正常对照组；b：良性肺病组)；

图6为roc曲线分析抗-hmgb3自身抗体对早期肺癌和晚期肺癌的诊断效能（early：早期肺癌患者；late：晚期肺癌患者；n：正常人）。

具体实施方式

本发明采用oncomine数据库（如图1）筛选肺癌相关肿瘤抗原，并应用elisa方法检测肺癌患者血清中抗-hmgb3自身抗体水平。

1）对oncomine中肺癌基因相关信息进行挖掘并筛选出与正常肺组织相比，在非小细胞肺癌组织中明显高表达的基因。具体筛选条件如下：（1）analysistype:cancervs.normalanalysis；（2）cancertype:lungcancer--non-smallcelllungcarcinoma;（3）datetype:mrna；（４）样本量均大于100。根据以上条件挑选出三个数据集，分别为houlung，landilung和okayamalung。对p值中位秩次位于前40的基因进行整理分析，抗-hmgb3自身抗体在三个数据集中的p值均小于校正后的检验水准（0.05/芯片检测基因数目）且表达差异倍数均大于3，故对抗-hmgb3自身抗体进行进一步分析。

2）为了探究抗-hmgb3自身抗体能否作为肺癌诊断的标志物，在测试阶段本发明应用elisa检测方法，对184例肺癌患者血清，184例正常对照血清进行抗-hmgb3自身抗体水平的检测，其步骤包括：用抗原包被液将商品化的重组hmgb3蛋白稀释至0.5ug/ml，包被96孔板，通用抗体稀释液将血清样本1:100稀释，与抗原反应后，与辣根过氧化物酶标记的hrp-rec-a二抗反应，最终利用abts显色系统进行显色。在酶标仪（405nm吸光度）下读取od值，以反应血清中抗-hmgb3自身抗体的水平。结果显示，抗-hmgb3自身抗体在肺癌患者血清中的表达水平明显高于正常人血清，差异具有统计学意义（p<0.001，如图2所示）。我们选取特异度高于90%，同时具有最高灵敏度的od值作为截断值（cut-off值），计算抗-hmgb3自身抗体在肺癌组和正常对照组中的阳性率，通过卡方检验分析，抗-hmgb3自身抗体在肺癌中的阳性率为57.06%，明显高于正常对照组（9.80%）（p<0.001）。为初步判断抗-hmgb3自身抗体对于肺癌患者的鉴别能力，本发明通过对肺癌患者组与正常对照组进行roc曲线分析，结果显示，肺癌对正常人的曲线下面积为0.851（95%ci：0.812-0.890，p<0.001）（图3）。

3）为进一步验证抗-hmgb3自身抗体能否作为肺癌诊断标志物，在验证阶段同样应用elisa检测方法，对446例肺癌患者血清，119例良性肺病患者（copd和慢性支气管炎）血清，以及446例正常人血清进行抗-hmgb3自身抗体水平的检测。结果显示，抗-hmgb3自身抗体在肺癌患者血清中的表达水平明显高于良性肺病患者和正常人血清，差异具有统计学意义（p<0.001，如图4所示）。同样选取特异度高于90%，同时具有最高灵敏度的od值作为截断值（cut-off值），通过卡方检验分析抗-hmgb3自身抗体在肺癌组和正常对照组中的阳性率，结果显示，抗-hmgb3自身抗体在肺癌中的阳性率为34.08%，明显高于正常对照组（9.86%）（p<0.001）。为进一步检测抗-hmgb3自身抗体对于肺癌患者的鉴别能力，本发明通过对验证阶段肺癌患者组与良性肺病组、肺癌组与正常对照组以及肺癌组与非肺癌组（正常对照组+良性肺病组）进行roc曲线分析，结果显示，肺癌对正常人的曲线下面积为0.72（95%ci：0.690-0.755，p<0.001），肺癌对良性肺病的曲线下面积为0.59（95%ci：0.539-0.630，p<0.001），肺癌对非肺癌的曲线下面积为0.69（95%ci：661-0.726，p<0.001）（如图5所示）。

5）为进一步评价抗-hmgb3自身抗体在肺癌早期诊断中的应用价值，本发明对早期(i/ⅱ期)肺癌患者和晚期（ⅲ/ⅳ期）肺癌患者血清中的抗-hmgb3自身抗体阳性率进行计算和分析，结果显示抗-hmgb3自身抗体在早期肺癌患者中的阳性率为50.0%，明显高于晚期肺癌患者中的阳性率（25.4%）（p<0.05）。为了比较抗-hmgb3自身抗体区分早期肺癌和晚期肺癌的能力，本发明对早期肺癌患者与正常对照组，以及晚期肺癌患者与正常对照组进行roc曲线分析，结果显示，早期肺癌对正常人曲线下面积为0.777（95%ci：0.671-0.882，p<0.001），晚期肺癌对正常人的曲线下面积为0.658（95%ci：0.619-0.718,p<0.001）（图6），对两个曲线下面积进行比较，差异具有统计学意义（p<0.05）。

6）为评价抗-hmgb3自身抗体与传统肿瘤标志物联合检测对早期肺癌的检测价值，根据传统肿瘤标志物的参考范围（cfyra21-1：0-3.3ng/ml，cea：0-3.0ng/ml，ca125：0.1-35u/ml），将三种标志物的检测结果分为阴性和阳性。本发明收集的早期肺癌血清中分别有17、21和20例具有cyfra21-1、cea和ca125的检测结果，将抗-hmgb3自身抗体分别与cyfra21-1、cea和ca125联合，认为任一指标阳性即为组合阳性。对早期肺癌患者血清中cyfra21-1、cea和ca125的阳性率及分别与抗-hmgb3自身抗体联合检测的阳性率进行计算与分析，结果表明，cyfra21-1在早期肺癌中的阳性率为35.3%，与抗-hmgb3自身抗体联合后阳性率明显提高至70.6%，差异有统计学意义（p<0.05）；cea在早期肺癌中的阳性率为28.6%，与抗-hmgb3自身抗体联合后阳性率提高至61.9%，差异有统计学意义（p<0.05）；ca125在早期肺癌中的阳性率为20.0%，与抗-hmgb3自身抗体联合后阳性率提高至60.0%，差异有统计学意义（p<0.05）。

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1.血清标本收集

本发明的测试阶段共使用184例肺癌患者和184例正常人血清，进行抗-hmgb3自身抗体在肺癌诊断中的初步评价；验证阶段共使用446例肺癌患者、446例正常人以及119例良性肺病患者血清，进行抗-hmgb3自身抗体在肺癌检测中的进一步评价。所有肺癌患者均经病理学确诊为肺癌，正常人来自常规体检人群，所有非癌症对象均经证实未患肿瘤相关疾病和自身免疫性疾病。血液标本于3500转/分，离心5分钟，将血清分装标记，于-80℃冰箱保存备用。

．oncomine数据库的筛选

本发明对oncomine中肺癌基因相关信息进行挖掘和筛选，主要利用特定的几项筛选条件筛选出在非小细胞肺癌组织中明显高表达的基因。具体筛选条件如下：（1）analysistype:cancervs.normalanalysis；（2）cancertype:lungcancer--non-smallcelllungcarcinoma;（3）datetype:mrna；（４）样本量均大于100。根据以上条件挑选出三个数据集，分别为houlung，landilung和okayamalung。三个数据集纳入的标本量分别为156、107和246，使用的芯片类型均为humangenomeu133array或humangenomeu133arrayplus2.0array。为寻找出在非小细胞肺癌组织中高表达且差异具有统计学意义的基因，我们对这三个数据集进行综合分析，并筛选出p值的中位秩次位于前40位的基因。对这40个基因在三个数据集中的p值和差异表达倍数（foldchange）进行整理。根据以下两个标准对表达异常的基因进行筛选：1.p<校正后的检验水准（0.05/芯片检测基因数目）（houlung：2.55e-06，landilung：3.96e-06，okayamalung：2.55e-06）；2.每个基因在三个数据集中差异表达倍数的平均值大于3。经过筛选，hmgb3满足筛选条件，其在houlung，landilung和okayamalung这三个数据集中的p值分别为3.38e-15，2.08e-25和4.59e-21，差异表达倍数分别为5.974，4.651和4.543，表明hmgb3mrna表达水平在非小细胞肺癌组织中明显高于正常肺部组织。

法检测抗-hmgb3自身抗体的血清表达水平

3.1所需试剂：

1）elisa包被缓冲液（20×）、封闭缓冲液（bsa）、elisa通用抗体稀释液及elisa-abts显色试剂盒，购于上海生工生物工程有限公司。

2）1×包被缓冲液：2.5mlelisa包被缓冲液（20×），加去离子水定容至50ml，置于4℃保存。

3）10×pbst缓冲液：氯化钠81.8g，nah2po4-2h2o3.1g，na2hpo4-12h2o28.8g，硫柳汞钠0.1g，tween205ml，加去离子水定容至1l，室温保存。

4）1×pbst缓冲液：10×pbst缓冲液100ml，加去离子水定容至1l，室温保存。

抗-hmgb3自身抗体检测方法

用1×包被缓冲液将购买的商品化的hmgb3蛋白进行溶解，浓度为0.5µg/µl，-20℃保存;从-80℃冰箱中取出血清，用elisa通用抗体稀释液在96孔深孔板中按1:100对血清进行稀释，4℃保存。

1）抗原包被：用通用抗体稀释液将hmgb3蛋白稀释至0.5ug/ml，在每个96孔板加50ul，4℃过夜。

2）封闭：弃尽未吸附的蛋白包被液，每孔加入100ul封闭缓冲液（bsa），37℃孵育2h，pbst洗三次，拍干。

3）与一抗孵育：每孔加入稀释后的血清100ul，室温孵育2h，pbst洗涤三次，拍干。

4）与二抗孵育：用通用抗体稀释液将hrp-rec-a二抗按1:3000进行稀释，每孔加入50ul，室温孵育2h，pbst洗涤三次，拍干。

5）显色：每个反应孔加入abts底物工作液50ul，置于37℃水浴锅避光显色30min至绿色产物出现。

6）结果判定：终止液每孔25ul，然后使用酶标仪测定其吸光度值od405nm处，以空白对照孔调零后测各孔od值。

统计分析方法

本发明采用两独立样本t检验和mann-whitenyu检验比较测试阶段肺癌组和正常对照组中自身抗体的均数和中位数是否有差异；分别采用单因素方差分析和kruskal-wallis检验比较验证阶段肺癌组、良性肺病组和正常对照组中自身抗体的均数和中位数是否有差异。取抗-hmgb3自身抗体特异度90%以上，有最高灵敏度的od值为截断值，计算不同组别中抗-hmgb3自身抗体的阳性率，采用2×2列联表资料的卡方检验比较自身抗体阳性率有无差异。根据曲线下面积（auc）判断自身抗体对肺癌的鉴别能力。所有统计分析使用spss21.0软件进行，p<0.05为统计判断标准。

临床上检测抗-hmgb3自身抗体在肺癌检测中的应用

1）抗-hmgb3自身抗体对肺癌组与非肺癌组（正常对照组+良性肺病组）的鉴别能力

本发明在验证阶段用elisa检测方法对446例肺癌患者血清，446例正常人血清和119例良性肺病患者血清进行抗-hmgb3自身抗体水平的检测，结果显示，肺癌组中hmgb3自身抗体的od值均数为0.430，显著高于正常对照组（0.263）与良性肺病组（0.337），p值均小于0.001（见图4）。抗-hmgb3自身抗体诊断肺癌的灵敏度和特异度分别34.08%和90.13%。肺癌组对于正常对照组的曲线下面积及95%可信区间为0.72（0.690-0.755）；肺癌组对于良性肺病组的曲线下面积及95%可信区间为0.59（0.539-0.630）；肺癌组对于非肺癌组（正常对照组+良性肺病组）的曲线下面积及95%可信区间为0.69（0.661-0.726）（见图5）。本发明提示，抗-hmgb3自身抗体可以很好地将肺癌与非肺癌（正常对照组+良性肺病组）患者区别开来。

2）抗-hmgb3自身抗体检测对早期肺癌检测价值

本发明对22例早期（ⅰ/ⅱ期）肺癌患者和128例晚期（ⅲ/ⅳ期）肺癌患者血清中抗-hmgb3自身抗体阳性率进行分析比较，结果显示，早期肺癌患者抗-hmgb3自身抗体阳性率为50.0%，显著高于晚期肺癌患者血清（25.4%），差异有统计学意义（p<0.05）。roc分析结果显示，早期肺癌对正常人曲线下面积及95%可信区间为0.777（0.671-0.882），晚期肺癌对正常人的曲线下面积及95%可信区间为0.658（0.619-0.718）（图6），对两个曲线下面积进行比较，差异具有统计学意义（p<0.05）。本发明结果提示，抗-hmgb3自身抗体可以作为早期肺癌检测的生物标志物。

3）抗-hmgb3自身抗体联合传统肿瘤标志物对早期肺癌的检测价值

本发明对早期肺癌患者血清中cyfra21-1、cea和ca125的阳性率及三种标志物分别与抗-hmgb3自身抗体联合检测的阳性率进行计算与分析，结果表明，cyfra21-1在早期肺癌中的阳性率为35.3%，与抗-hmgb3自身抗体联合后阳性率明显提高至70.6%，差异有统计学意义（p<0.05）；cea在早期肺癌中的阳性率为28.6%，与抗-hmgb3自身抗体联合后阳性率提高至61.9%，差异有统计学意义（p<0.05）；ca125在早期肺癌中的阳性率为20.0%，与抗-hmgb3自身抗体联合后阳性率提高至60.0%，差异有统计学意义（p<0.05）。本发明结果提示，抗-hmgb3自身抗体自身抗体与传统肿瘤标志物联合检测可以明显提高早期肺癌肺检出率。