一种检测干血片中代谢物的方法及试剂盒与流程

本发明属于生化检测
技术领域：
，具体涉及一种检测干血片中丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸等代谢物浓度的方法及试剂盒。
背景技术：
：甲基丙二酸血症是一种常染色体隐性遗传病，1967年oberholzer等最先报道。该病主要是由于甲基丙二酰辅酶a变位酶自身缺陷或其辅酶钴胺素代谢缺陷，造成甲基丙二酸、3-羟基丙酸、丙二酸及甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积，引起相关临床表现。甲基丙二酸血症发病年龄各异，1岁内发病的早发型患儿预后不良，容易漏诊或误诊，死亡率和致残率很高，延误治疗可导致患儿出现不可逆性多脏器损害，因此早诊断早治疗显得尤为重要。根据酶的缺陷类型，将甲基丙二酸血症分为甲基丙二酰辅酶a变位酶缺陷和辅酶钴胺素代谢缺陷两类，前者编码基因为mut，根据酶活性程度分为有残余活性(mut-型)和完全无活性(mut0型)，后者包括cbla、cblb、cblc、cbld、cblf和cblh，cblc对应编码基因为mmachc。mut0、mut-、cbla、cblb、cblh仅表现为甲基丙二酸血症，cblc、cbld、cblf表现为甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症(mma合并hcy)。在中国，80％患者为mmachc基因突变，甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症是我国甲基丙二酸血症患者的主要生化表型，也是遗传代谢病中少数可治疗的疾病。丙酸血症(pa)为一种常染色体隐性遗传的先天性支链氨基酸代谢异常疾病，致死率极高。主要由丙酰辅酶a-羧化酶(pcc)缺陷导致丙酸、3-羟基丙酸(3-hp)、酮体(3hb)、甘氨酸(gly)、甲基枸橼酸(me-citrate)等代谢产物的异常蓄积，引起酮症酸中毒、低血糖、高血氨、高甘氨酸血症等一系列生化异常与神经系统损害。同型半胱氨酸血症(hcy)是胱硫醚β合成酶缺乏引起的一种常染色体隐性遗传病，主要受蛋氨酸代谢的影响。新生儿早期表现健康，基本无症状，或可能会发生轻度延迟发育。未经处理，高同型半胱氨酸尿症可导致眼部问题、智力低下、癫痫发作、血栓栓塞、和骨骼异常等。日趋增加的视觉问题可能促使就医而诊断。检测血和尿液中的同型半胱氨酸有助于早期诊断。尚无特效药治疗同型半胱氨酸尿症。大约一半的患者对维生素b6敏感，需要终身服用维生素b6、维生素b9(叶酸)、和维生素b12等维生素补充剂。若无反应，则考虑限制蛋氨酸摄入。多数需要三甲基甘氨酸(甜菜碱)治疗。低蛋氨酸饮食和药物都不会改善已有的智力残疾，还应该由有经验的医生密切监督。单纯型mma的生化特征表现为患者血液中丙酰肉碱、甲基丙二酸和甲基枸橼酸增高；mma合并hcy血液中除了丙酰肉碱、甲基丙二酸和甲基枸橼酸增高，还表现出同型半胱氨酸的增高；pa患者则显示血液中丙酰肉碱和甲基枸橼酸增高，但甲基丙二酸浓度正常；hcy患者血液中同型半胱氨酸增高。目前对这四种疾病的筛查主要为液相色谱-串联质谱法，现有检测试剂盒中并没有这几个特异性指标，只能显示蛋氨酸met和丙酸代谢依赖的蛋氨酸和丙酰肉碱c3增高，然而，这些分析物对mma和pa的诊断没有特异性，容易产生假阳性结果。同型半胱氨酸、甲基丙二酸和甲基枸橼酸对蛋氨酸和丙酸的先天性代谢缺陷更具特异性，可用于辅助诊断甲基丙二酸血症、甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症、同型半胱氨酸血症和丙酸血症。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测干血片中代谢物的方法及试剂盒。为实现上述技术目的，本发明通过衍生法处理，实现干血片中丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸的检测，具体技术方案如下：一种检测干血片中代谢物的方法，所述代谢物分别为丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸；检测方法步骤如下：(1)向内标品中加入萃取剂，混匀，制成内标品溶液；所述内标品为丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸的同位素内标混合物；(2)将待测滤纸干血片置于内标品溶液中振荡孵育，获取孵育溶液；(3)在孵育溶液中加入衍生化试剂进行衍生化处理后，再次振荡孵育，之后流动氮气吹干；(4)加入含体积分数0.02–0.05％甲酸超纯水复溶，振荡孵育；(5)取步骤(4)获取的孵育溶液，采用液相色谱-串联质谱方法检测丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸浓度。经由液相色谱进样器导入色谱柱分离，分离产物经微型泵进入到质谱仪的离子源，在这里形成带电均匀喷雾，离子被导入质谱第一级质量过滤器中，按质荷比大小而被分离后进入碰撞室，被碰撞激活解离，较小的子代离子随后被导入第二级的质量过滤器，在此按质荷比进行分离，而后送到检测器内通过多反应监控(mrm)模式得到离子信号。表1分析物名称及其特征在与待测组分相同的液相色谱-串联质谱条件下，等体积准确进样，对不同浓度系列的校准品进行准确测量，得到各峰的峰面积和/或峰高数据。采用峰面积或峰高数据对校准品样品浓度绘制得到标准曲线。在测定待测样品中的组分含量时，用该标准曲线完全相同的液相色谱-串联质谱条件做出质谱图，测量质谱峰面积或峰高，然后根据峰面积和峰高标准曲线，分析出待测样品组分的各相应浓度。进一步的，所述步骤(1)中，内标品成分及目标配置浓度为：丙二酸-d41–2μmol/l；甲基丙二酸-d31–2μmol/l；乙基丙二酸-d51–2μmol/l；同型半胱氨酸-d40.5–2μmol/l；甲基枸橼酸-d31–2μmol/l；萃取剂选用体积比80:20甲醇水液，内含体积分数0.02–0.05％甲酸。进一步的，所述步骤(2)中，振荡孵育的条件为：700转/分，20～26℃下振荡孵育60分钟。进一步的，所述步骤(3)中，衍生化试剂选用盐酸正丁醇，浓度3–10mol/l。振荡孵育的条件为：700转/分，65℃下振荡孵育15分钟。进一步的，所述步骤(4)中，振荡孵育的条件为：700转/分，室温下振荡孵育10分钟。进一步的，所述步骤(5)中，液相色谱-串联质谱方法通过多反应监控模式检测；液相色谱分离的流动相为：流动相a：含有0.05％甲酸的水溶液；流动相b：含有0.05％甲酸的甲醇溶液。进一步的，本发明的方法还包括对不同浓度的校准品进行测量，得到各峰的峰面积和/或峰高数据，采用峰面积或峰高数据对校准品样品浓度绘制得到标准曲线；采用标准曲线对所述代谢物进行定量。本发明还提供了一种检测干血片中代谢物的试剂盒，所述代谢物分别为丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸；(1)萃取剂；(2)衍生化试剂：3n盐酸正丁醇；(3)复溶液：含体积分数0.02–0.05％甲酸的超纯水；(4)内标品：丙二酸-d4、甲基丙二酸-d3、乙基丙二酸-d5、甲基枸橼酸-d3和总同型半胱氨酸-d4；(5)质控品，所述质控品为含有已知浓度的丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸的滤纸干血片，包括高水平质控品和低水平质控品；(6)校准品，所述校准品为含有已知梯度浓度的丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸的滤纸干血片。作为本发明一种可选的实施方式，液相色谱采用的流动相也可附加于试剂盒中。本发明可测定滤纸干血片样本中丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸的浓度，用于辅助诊断甲基丙二酸血症、甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症、同型半胱氨酸血症和丙酸血症；诊断效率高，降低假阳性率从4％到1％；同时可降低确诊时间，传统筛查方式初筛-召回复查-召回确诊尿有机酸和基因检测至少需要30天，本发明的检测方法可以在14天内实现干血片样本中丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸的浓度检测。附图说明图1为内标品纯液基质质谱图；图2为全血样本的检测质谱图。具体实施方式下面结合实施例具体说明本发明检测干血片中代谢物的试剂盒和检测方法。使用仪器：超高效液相色谱-串联质谱仪(watersacquityuplci-classivd/watersxevotq-divdsystem，usa)；氮吹ns仪(型号ad8001，质谱生物科技有限公司)；微孔板振荡器(型号ost7701，质谱生物科技有限公司)；v截底型96孔板(货号z011075，质谱生物科技有限公司)；v底型96孔板(货号z011076，质谱生物科技有限公司)；1/8英寸(3.2mm)打孔器；试剂盒组分：(1)萃取剂：甲醇水液(80:20)，含有0.02–0.05％甲酸。(2)衍生化试剂：3n盐酸正丁醇；(3)复溶液：超纯水，含有0.02–0.05％甲酸；(4)内标品：丙二酸-d4、甲基丙二酸-d3、乙基丙二酸-d5、甲基枸橼酸-d3和总同型半胱氨酸-d4；内标品成分及目标配制量如下表2：表2内标品成分及其目标配制量成分名称(缩写)目标配制量丙二酸-d41μmol/l甲基丙二酸-d31μmol/l乙基丙二酸-d51μmol/l同型半胱氨酸-d40.5μmol/l甲基枸橼酸-d31μmol/l(5)干血片质控样品：低水平质控：含有丙二酸5μmol/l，甲基丙二酸5μmol/l，乙基丙二酸5μmol/l，总同型半胱氨酸2.5μmol/l和甲基枸橼酸10μmol/l的干血片样品；高水平质控品：含有丙二酸25μmol/l，甲基丙二酸25μmol/l，乙基丙二酸25μmol/l，总同型半胱氨酸12.5μmol/l和甲基枸橼酸50μmol/l的干血片样品。(6)干血片校准品：含有不同浓度五种化合物的干血片，如下表3所示：表3干血片校准品成分(μmol/l)试剂盒各组分在打开包装之前，应恢复到室温，以防止产生冷凝水。1)准备内标品溶液取1.0ml萃取剂，加入到内标品小瓶中进行复溶，将液体混匀，直到完全溶解，大约需要30分钟。2℃～8℃条件下储存在密封的原装小瓶中，此溶液配制后可稳定保存7天。2)打孔取一块新的v截底型96孔板，使用自动或手动打孔器将质控品(两个空白，两个低控，两个高控)和待测滤纸干血片样本打孔，直径约为3.2mm(1/8英寸)，依次放入到洁净的v截底型96孔板中。所述测滤纸干血片取85微升全血样本制造，打孔1/8英寸血斑(大约相当于3.5微升血液)。3)向以上各孔加入步骤1)中预先配制好的内标品溶液100μl。4)用微孔板粘贴膜覆盖整块v截底型96孔板，确保密封，将挥发量降至最低。5)立即将严密封盖v截底型96孔板置于微孔板振荡器内，在振荡频率为700转/分的条件下，室温(23±3℃)振荡孵育60分钟。6)振荡结束后，取出v截底型96孔板，小心揭去板上覆盖的微孔板粘贴膜，从每个孔位中吸取全部液体(不要吸入纸残片)转移至对应孔位的v型96孔板中。7)将v型96孔板置入40℃下流动氮气吹干，大约需要20分钟。8)向以上各孔加入预先准备好的100μl衍生化试剂含有3n盐酸正丁醇(3–10mol/lhclinn-butanol)。9)用微孔板粘贴膜覆盖整块v型96孔板，确保密封，将挥发量降至最低。10)将v型96孔板置入65℃在振荡频率为700转/分的条件下振荡孵育15分钟。11)振荡结束后，取出v型96孔板，小心揭去板上覆盖的微孔板粘贴膜。12)将v型96孔板置入40℃下流动氮气吹干，大约需要7分钟。13)向以上各孔中加入含有100μl质谱级含有0.02–0.05％甲酸的超纯水复溶液。14)用微孔板粘贴膜覆盖整块v型96孔板，确保密封。15)将v型96孔板在振荡频率为700转/分的条件下室温振荡孵育10分钟。16)振荡孵育结束后，取出v型96孔板，小心揭去板上覆盖的微孔板粘贴膜，从每个孔位中吸取75μl液体(不要吸入残渣)转移至对应孔位的洁净v型96孔板中。17)使用铝箔制微孔板封套紧密覆盖v型96孔板，将溶液挥发量降至最低。18)将带有铝箔制微孔板封套紧密覆盖的v型96孔板放入质谱仪自动进样器中。19)启用应用软件，建立工作列表，选择正确的数据采集方法，参考阅读产品质量分析报告，输入正确的各内标品浓度，启动检测。流动相a为含有0.05％甲酸的超纯水溶液，流动相b为含有0.05％甲酸的甲醇溶液。按照下表4设定液相色谱分析条件。表4丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、2-甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸液相色谱分析条件chaneltime(min)flow(ml/min)％a％bcurve100.3802020.50.380206310.320802430.35951055.50.3595665.510.38020620)按照下表5设定质谱条件。21)完成检测分析。表5丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、2-甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸质谱分析条件内标品纯液基质质谱图如图1所示，纯液质基质条件下，各内标品质谱图提示各物质的响应清晰可辨，达到了可识别的响应要求。mma全血样本的检测质谱图如图2所示。采用本实施例的方法测定1000例滤纸干血片丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸的浓度，推测的参考值范围见下表6，可供临床诊断时参考。各分析物参考值在不同样本采集时间读出的数据有差异，需要在分析时注意。如检测结果高于可报告范围，则需要把样本做稀释处理后，重复检测。如遇检测数据异常，则需要使用剩余滤纸干血片进行重复检测，复测仍然显示阳性预测遗传代谢性疾病的可能，则需遵守当地疾病检测规定或指导方针。表6丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、甲基枸橼酸和总同型半胱氨酸的参考值范围分析物(缩写)参考值范围丙二酸(ma)<15.0nmol/ml甲基丙二酸(mma)<5.0nmol/ml乙基丙二酸(ema)<3.5nmol/ml总同型半胱氨酸(thcy)<15.0nmol/ml甲基枸橼酸(mca)<10.0nmol/ml当前第1页12