铅、镉混合暴露检测在无精子症辅助诊断中的应用的制作方法

本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及一种与无精子症相关的暴露生物标志物及其检测方法和应用，该暴露生物标志物为铅镉混合暴露，其检测方法为基于icp-ms的检测方法。

背景技术：

全球范围内，遭受不孕不育的困扰的育龄夫妇占比约为8％～15％。目前我国不孕不育症的发生率已高达15％～20％，其中男性因素占30％。who不育症防治专题组的研究表明：生殖内分泌功能紊乱，特别是精液质量低下是男性不育的重要病因。在男性不育患者中，由于基因突变引起的无精子症占30％以上。精子生成是一个复杂的生理过程，其特点是细胞类型的有序增生和分化，即从二倍体的精原细胞到单倍体的精细胞，再经精细胞形成精子。在过去50年中，男性精液质量，尤其是精子生成数量有了相当程度的下降，我国的研究也呈现出相类似的情况。由于短期内遗传变异相对有限，因此我们有理由相信，无精子症更可能是受到了某些环境危险因素的影响。环境毒物由于患者认识不足和检测技术的限制，是较容易被临床所忽略的重要病因。

铅(pb)和镉(cd)都是人们日常生活中接触较多的重金属。铅因其用途广泛，已成为人类接触最为密切的重金属之一。大量研究发现，铅对雄性生殖系统的毒性作用机理十分复杂。涉及精子发生过程、类同醇生成及氧化还原系统等。有实验发现，铅能引起睾丸的退行性变化，铅中毒的动物睾丸和附睾的平均重量减轻。同时，铅能直接损伤睾丸的生精系统，使之产生代谢障碍，造成精子生成数量减少，形态发生改变，由于铅使精子轴丝浓缩、变性，故能导致其活力降低。人群可通过工业污染、饮水、食物和吸烟等途径暴露于镉。雄性生殖系统是镉毒性重要靶点，其可通过引起睾丸细胞和生殖细胞发生氧化应激导致男性发生不育。雄性生殖系统对镉毒性高度敏感。镉暴露导致血清中促黄体生成素(lh)的分泌规律被打破，引起卵泡刺激素(fsh)的分泌水平下降，进一步导致睾酮水平出现明显下降，且其下降的水平与镉的暴露水平具有一定的相关性。镉暴露的条件下，发育成熟的精子会出现头部畸形(无头，双头，小头，巨头，香蕉头)、尾部畸形(无尾，双尾，尾折叠)和运动能力的下降。通常情况下，环境毒物均呈混合暴露的状态，而铅或镉的混合暴露被证明可以破坏睾丸性激素代谢，增加氧化应激水平并造成睾丸和附睾中的精子数量减少等。因此，铅、镉混合暴露可能是无精子症的重要病因，应当在临床上引起更多的关注和重视。不同化学物质间的相互作用一般可分为以下几种：协同作用、相加作用及拮抗作用。有研究发现，铅和镉的毒性具有协同效应，铅和镉的混合暴露比铅、镉的单独暴露的危害要大，但是，单独暴露均处于安全浓度的铅、镉，是否在混合暴露时能够导致无精子症尚有待进一步研究。

常用的重金属分析方法主要有：紫外-可见分光光度法(uv)、原子荧光光谱法(afs)、原子吸收光谱法(aas)、x射线荧光光谱法(xrf)、电感耦合等离子体法光谱法(icp-aes)、和电感耦合等离子质谱法(icp‐ms)。目前为止最先进的分析方法是电感耦合等离子质谱法(icp‐ms)，在美国、欧盟等国大量使用此方法进行重金属的检测，国内应用尚不广泛。在国内，特别是在无精子症辅助诊断领域，还未开发使用icp-ms分析男性全血中铅、镉混合暴露水平的技术。如果能发现无精子症与铅、镉混合暴露作为辅助诊断标志物之间的关联，并开发出无精子症的icp-ms辅助检测方法，不仅将具有很大的商业价值，对男性生殖健康水平也会有进一步的促进和提升。

技术实现要素：

本发明的目的是：

1.将铅、镉混合暴露作为无精子症辅助诊断标志物；

2.建立基于icp-ms的男性全血中铅、镉混合暴露的检测方法；

3.开发用于无精子症辅助诊断的铅、镉混合暴露检测和辅助诊断试剂盒。

本发明的目的通过下列技术措施实现的：

与无精子症相关的暴露生物标志物，该暴露生物标志物为铅和镉的混合暴露。

用于检测所述暴露生物标志物的方法，该方法为采用icp-ms检测男性全血中铅和镉的浓度，特别是采用内标与标准曲线混合的icp-ms检测男性全血中铅和镉的浓度。

所述的检测方法，该检测方法的具体步骤及参数为：

a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba²⁺)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba²⁺/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；

表1.1icp-ms优化的操作参数

b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体；使用清洗液冲洗系统。

表1.2icp-ms采集参数

其他步骤详见厂商说明书。

所述的暴露生物标志物在制备检测无精子症的辅助诊断试剂盒中的应用。

一种用于检测无精子症的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有采用icp-ms检测男性全血中的铅和镉的浓度的试剂。

所述的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：

试剂a：稀释剂(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/l铑+10μg/l铋，其余为去离子水)；

试剂b：铅标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50μg/l；

试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；

试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。

(注：标准曲线采用稀释剂配置，标准曲线0浓度就是稀释剂。内标元素含量通过该元素的标准液稀释而来。)

本发明详细描述如下：

本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的男性全血样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于icp-ms检测方法进行分析。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

一、研究对象选择和分组依据

纳入病例男性120人，根据年龄、bmi、禁欲时间匹配对照120人，共240人。

a组：健康对照组(120人，精液检查和生育力正常)：

1.年龄在22到37岁间；

2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.无泌尿生殖道炎症、附睾炎、睾丸损伤、隐睾等疾病史；

5.无性功能异常或排精异常；

6.无其他与男性生殖障碍有关的疾病史。

b组：病例组(120人，精液检查无精子)：

1.年龄在25到38岁间；

2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.无泌尿生殖道炎症、附睾炎、睾丸损伤、隐睾等疾病史；

5.无性功能异常或排精异常；

6.无其他与男性生殖障碍有关的疾病史。

二、icp-ms检测铅、镉混合暴露与无精子症发生的分析

1.样本前处理

取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。

2.仪器检测

分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)

a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba²⁺)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba²⁺/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；

表1.1icp-ms优化的操作参数

b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体；使用清洗液冲洗系统。

表1.2icp-ms采集参数

其他步骤详见厂商说明书。

进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。

3.数据处理：

使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑(rh)、铋(bi)分别用于校正镉和铅的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。

4.数据分析：

暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。

5.健康对照组、病例组全血样本中铅、镉混合暴露的差异和诊断意义。

经welch'st-test发现病例组铅和镉暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，铅、镉高暴露显著增加了无精子症的发病率。

三、诊断试剂盒制备方法

根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于无精子症的辅助诊断试剂盒，所述辅助诊断试剂盒包含一套全血铅、镉检测的试剂及耗材。

本发明的有益效果：

本发明人通过采用icp-ms比较正常对照和无精子症病例全血中的铅、镉混合暴露水平，发现了男性全血中具有无精子症辅助诊断价值的标志物组合，以及该标志物检测的icp-ms的应用，研制出可便于临床应用的和无精子症辅助诊断试剂盒。

本发明采用男性全血中铅、镉混合暴露水平作为无精子症评价的标志物的优越性在于：

(1)铅、镉混合暴露是一组新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高无精子症辅助诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为男性不育的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)本发明提供的铅、镉混合暴露检测可用于无精子症的辅助诊断，可在早期通过微创方式早期诊断无精子症，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

(3)本发明采用无精子症病例和健康对照人群的全血样本进行验证，证明了无精子症病例具有较高的铅、镉暴露水平，可作为标志物使用。

(4)icp-ms技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，取样后，30分钟内可出具结果，具有较高的临床诊断实用价值。

(5)本发明样本操作步骤简单，且能防止样品污染，提高灵敏度，100ul全血样本加入配备好的稀释剂中即可上机进行分析，对环境及操作人员的要求降低。

(6)本发明采用icp-ms技术对铅、镉联合暴露进行检测的前处理步骤进行了优化，能够更好地减少检测的成本和时间。

附图说明

图1健康对照组和病例组的铅暴露水平。

箱式图的顶部和底部分别代表第七十五和第二十五百分位，箱式图的上端到下端代表第九十和第十百分位。

图2健康对照组和病例组的镉暴露水平，图注参考图1。

图3卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，铅、镉高暴露显著增加了无精子症发病率。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1研究对象选择和分组依据

本发明人从南京医科大学附属南京妇幼保健院采集符合要求的无精子症病例及正常对照男性的全血样本。精液检查和生育力正常的为对照，精液检查无精子的为病例。随机纳入120例病例，根据年龄、bmi、禁欲时间匹配对照男性120人，共240人作为无精子症铅、镉混合暴露评估的实验对象。具体的样本归类标准如下：

第一阶段关联探索阶段

纳入病例男性120人，根据年龄、bmi、禁欲时间匹配对照120人，共240人。

a组：健康对照组(120人，精液检查和生育力正常)：

1.年龄在22到37岁间；

2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.无泌尿生殖道炎症、附睾炎、睾丸损伤、隐睾等疾病史；

5.无性功能异常或排精异常；

6.无其他与男性生殖障碍有关的疾病史。

b组：病例组(120人，精液检查无精子)：

1.年龄在25到38岁间；

2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.无泌尿生殖道炎症、附睾炎、睾丸损伤、隐睾等疾病史；

5.无性功能异常或排精异常；

6.无其他与男性生殖障碍有关的疾病史。

实施例2icp-ms检测铅、镉混合暴露与无精子症发生的分析

1.样本前处理

取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。

2.仪器检测

分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)

a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba²⁺)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba²⁺/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；

表1.1icp-ms优化的操作参数

b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体；使用清洗液冲洗系统。

表1.2icp-ms采集参数

其他步骤详见厂商说明书。

进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。

3.数据处理：

使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑、铋分别用于校正镉和铅的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。

4.数据分析：

暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。

5.健康对照组、病例组全血样本中铅、镉混合暴露的差异和诊断意义。

经welch'st-test发现病例组铅和镉暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异(结果见图1、图2、图3)，病例组的高暴露人数多于对照组，显著增加了无精子症发病率。

实施例3用于检测男性全血铅、镉混合暴露辅助诊断无精子症的试剂盒制作

首先通过icp-ms的方法确定病例组全血中具有较高水平的铅、镉浓度，然后通过卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，铅、镉高暴露显著增加了无精子症的发病率。检测铅、镉混合暴露可以用于无精子症的辅助诊断。此试剂盒包括一批全血中铅、镉检测用试剂和耗材，其中稀释剂用于样品稀释，其中含有稳定且可检测的内标用于实验质量控制，铅和镉标准曲线浓度梯度各一条用于绘制标准曲线进行定量分析，清洗液用于容器清洗和空白对照。此试剂盒的价值在于只需要100μl男性全血，即可同时检测全血中的铅、镉含量，再通过分析结果与参考值的比较辅助诊断无精子症，并易于进行动态监测和观察治疗效果。

具体试剂盒组成如下：

试剂a：稀释剂(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/l铑+10μg/l铋，其余为去离子水)；

试剂b：铅标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50μg/l；

试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；

试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。

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