本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及一种与非梗阻性无精子症相关的暴露生物标志物及其检测方法和应用，该暴露生物标志物为汞镉混合暴露，其检测方法为基于icp-ms的检测方法。
背景技术：
：：大约30％-55％的人类不孕不育与男性因素有关[1]，男性不育症最常见的原因是精子发生障碍，临床上称为弱精子症或无精子症[2]。其中10-15％归因于无精子症[1]。近年来，随着人们生殖健康需求的不断提高，男性不育越来越成为社会关注的焦点。who不育症防治专题组的研究表明生殖内分泌功能紊乱，特别是精液质量低下是男性不育的重要病因。在过去50年中，男性精液质量，尤其是精子生成数量有了相当程度的下降[3]，我国的研究也呈现出相类似的情况[4]。男性不育受到多方面因素的影响，包括环境因素，遗传因素以及表观遗传因素。由于短期内遗传变异相对有限，因此我们有理由相信，非梗阻性无精子症更可能是受到了某些环境危险因素的影响。基因组学进行了大量广泛的研究，相对于投入的大量资金及人员，其研究结果对健康的影响并不明显。暴露组学作为基因组学的补充是指从妊娠开始贯穿整个人生的环境暴露(包括生活方式因素).暴露源包括外源(污染、辐射、饮食等)和内源(炎症、感染、微生物等)，继全基因组关联研究(gwas)之后发展的全暴露组关联研究(ewas)的目的是对在未知方式下暴露的评估，ewas方法通过比较患者和健康受试者暴露组的分析结果,确定有效的生物标志物，进而利用这些生物标志物来阐明暴露-效应关系(生化流行病学)、暴露和人体动力学来源(暴露生物学)、以及作用机制(系统生物学)。环境暴露与健康之间的关系研究可从测定病例组和对照组外环境中的空气、水、食物内的污染物入手，检验两组间是否存在差异，进而通过对主要物质的摄入量、代谢等进行考量，估计暴露剂量，这称之为自下而上的方法(bottom-up)；另一种方法是从测量病例组和对照组血液或其他体液内的物质入手，检验各类物质与疾病之间的统计学联系，最终确定导致疾病的物质及其暴露来源，称之自上而下的方法(top-town)。“自下而上”和“自上而下”的方法在识别个体暴露上都具有科学价值，“自上而下”法用于揭示人类疾病的未知暴露源，而“自下而上”法是用于分析外暴露以及建立干预与预防的方法。生物标志物不仅可以用于研究外暴露，也可以用于研究内暴露。内暴露组学采用组学的方法进行研究，如基因组学、蛋白质组学、表观基因组学、代谢组学、转录组学、加合物组学等。暴露组学涉及多学科交叉(流行病学、生物统计学、生物信息学、分析化学等)，目前研究方向如发展更先进的分析技术(提高通量、降低样本量及费用等)、高效寻找合适的暴露标志物、混合暴露与疾病的关系、在群体水平找到与疾病相关的暴露因素、暴露组关联研究，等等。环境暴露与健康关系研究中存在一些问题，比如，针对单一环境暴露因素研究(忽略混合暴露的存在及各个暴露间的联合作用)，环境暴露因素种类局限(集中在已知的和法规重点控制的暴露)，环境暴露采样时机与疾病的自然发生进程分离(较少考虑慢性病存在潜伏期)、环境暴露采样与检测不准确，等等。对暴露内部标志物的测定要与疾病发生的“时间窗”相对应，否则，研究结果将可能因为暴露和疾病发生时间上的先后关系不清而无法得出可靠结论。汞(hg)和镉(cd)是重要的有毒金属，广泛存在于自然和人为来源的环境中[5]。因其广泛暴露，大多数人群的生物样本中都能检测到重金属，包括血液、精浆和尿液[6-8]。以往的研究表明男性的汞或镉暴露均会造成精子生成障碍[9-12]。有研究表明汞暴露后可导致17β-雌二醇的水平降低，可使睾丸组织更容易受到氧化损伤，从而导致功能失活，导致精子发生障碍[13]。镉的暴露可以靶向破坏血睾屏障，从而导致精子生成障碍[14]。因此，汞、镉暴露可能是非梗阻性无精子症的重要病因，应当在临床上引起更多的关注和重视。通常情况下，男性会接触多种重金属和其他化学物，它们会共同作用导致健康效应或增加毒作用的敏感性[15]。金属之间因存在相加作用，协同作用，拮抗作用，从而影响彼此的吸收，分配和排泄[15]。因环境毒物均呈混合暴露的状态，应该同时考虑多种重金属对精子质量的影响[16]。所以汞、镉混合暴露可能是精子生成障碍的重要病因，应当在临床上引起更多的关注和重视。因此单独暴露均处于安全浓度的汞、镉，是否在混合暴露时能够导致非梗阻性无精子症尚有待进一步研究。石墨炉原子吸收光谱法(gfaas)是目前全血中铅和镉常用的检测方法，可以做到较快速的准确定量分析[17]。然而这一方法标准工作曲线的线性范围窄，样品前处理较复杂，特别是其无法进行多元素同时分析，因此局限了其在混合暴露评估中的应用。其他常用方法诸如原子荧光光谱(afs)、电化学分析法等也具有特定的不足。电感耦合等离子体质谱(icp-ms)是用于痕量及超痕量多元素分析的质谱仪，具有灵敏度高、检出限低、选择性好、分析速度快、动态范围宽等优点，由于其多元素高通量检测的特点，因而被广泛应用于混合暴露特别是多种重金属混合暴露的检测当中[18-20]。在既往的实践中，icp-ms最初被用于环境样本如水样、土壤的重金属污染水平分析。此后又被用于具有职业暴露风险的工人体液样本中铅、镉、汞等重金属水平检测。近年来，越来越多的研究和实践中使用icp-ms作为人类各类疾病的早期标志物的识别和检测应用，如糖尿病，儿童神经发育障碍，心血管疾病，不良出生结局等，相关论文发表在学术期刊《environhealthperspect》、《epidemiology》、《environpollut》、《occupenvironmed》，体现出其在人类疾病诊断中的巨大潜力与价值。然而目前采用icp-ms分析男性全血中汞、镉混合暴露水平在非梗阻性无精子症辅助诊断中的应用还未得到相应的关注。若能发现汞、镉混合暴露作为辅助诊断标志物与非梗阻性无精子症的明确关联，并研发相应疾病的icp-ms检测方法，提高检测结果的准确性与灵敏度，不仅可以在该领域获得国际领先的研究成果，还能创造可观的经济价值，并且为促进和提高我国男性生殖健康水平做出贡献。技术实现要素：本发明的目的是：1.将汞、镉混合暴露作为非梗阻性无精子症辅助诊断标志物；2.建立基于icp-ms的男性全血中汞、镉混合暴露的检测方法；3.开发用于非梗阻性无精子症辅助诊断的汞、镉混合暴露检测和辅助诊断试剂盒。本发明的目的通过下列技术措施实现的：与非梗阻性无精子症相关的暴露生物标志物，该暴露生物标志物为汞和镉的混合暴露。用于检测所述暴露生物标志物的方法，该方法为采用icp-ms检测男性全血中的汞和镉的浓度，特别是采用内标与标准曲线混合的icp-ms检测男性全血中的汞和镉的浓度。所述的检测方法，该检测方法的具体步骤及参数为：a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba2+/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；表1.1icp-ms优化的操作参数b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体，使用清洗液冲洗系统。表1.2icp-ms采集参数其他步骤详见厂商说明书。所述的暴露生物标志物在制备检测非梗阻性无精子症的辅助诊断试剂盒中的应用。一种用于检测非梗阻性无精子症的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有采用icp-ms检测男性全血中的汞和镉的浓度的试剂。所述的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：试剂a：稀释剂(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/l铑+10μg/l铋，其余为去离子水)；试剂b：汞标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50μg/l；试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。(注：标准曲线采用稀释剂配置，标准曲线0浓度就是稀释剂。内标元素含量通过该元素的标准液稀释而来。)本发明详细描述如下：本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的男性全血样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于icp-ms检测方法进行分析。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：一、研究对象选择和分组依据纳入病例男性100人，根据年龄、bmi、禁欲时间匹配对照100人，共200人。a组：健康对照组(100人，精液检查和生育力正常)：1.年龄在22到37岁间；2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；3.无吸烟、饮酒史；4.无泌尿生殖道炎症、附睾炎、睾丸损伤、隐睾等疾病史；5.无性功能异常或排精异常；6.无其他与男性生殖障碍有关的疾病史。b组：病例组(100人，精液检查无精子，睾丸穿刺确诊非梗阻性无精子症)：1.年龄在25到38岁间；2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；3.无吸烟、饮酒史；4.无泌尿生殖道炎症、附睾炎、睾丸损伤、隐睾等疾病史；5.无性功能异常或排精异常；6.无其他与男性生殖障碍有关的疾病史。二、icp-ms检测汞、镉混合暴露与非梗阻性无精子症发生的分析1.样本前处理取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。2.仪器检测分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba2+/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；表1.1icp-ms优化的操作参数b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体，使用清洗液冲洗系统。表1.2icp-ms采集参数其他步骤详见厂商说明书。进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。3.数据处理：使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑(rh)、铋(bi)分别用于校正镉和汞的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。4.数据分析：暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。5.健康对照组、病例组全血样本中汞、镉混合暴露的差异和诊断意义。经welch'st-test发现病例组汞和镉暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，汞、镉高暴露显著增加了非梗阻性无精子症发病率。三、诊断试剂盒制备方法根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于非梗阻性无精子症的辅助诊断试剂盒，所述辅助诊断试剂盒包含一套全血汞、镉检测的试剂及耗材。本发明的有益效果：本发明人通过采用icp-ms比较正常对照和非梗阻性无精子症病例全血中的汞、镉混合暴露水平，发现了男性全血中存在具有非梗阻性无精子症辅助诊断价值的标志物组合，以及该标志物检测的icp-ms的应用，研制出可便于临床应用非梗阻性无精子症的辅助诊断试剂盒。本发明采用男性全血中汞、镉混合暴露水平作为非梗阻性无精子症评价的标志物的优越性在于：(1)汞、镉混合暴露是一组新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高非梗阻性无精子症辅助诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为男性不育的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。(2)本发明提供的汞、镉混合暴露检测可用于非梗阻性无精子症的辅助诊断，可在早期通过微创方式早期诊断非梗阻性无精子症，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。(3)本发明采用非梗阻性无精子症病例和健康对照人群的全血样本进行验证，证明了非梗阻性无精子症病例具有较高的汞、镉暴露水平，可作为标志物使用。(4)icp-ms技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，取样后，30分钟内可出具结果，具有较高的临床诊断实用价值。(5)本发明样本操作步骤简单，且能防止样品污染，提高灵敏度，100μl全血样本加入配备好的稀释剂中即可上机进行分析，对环境及操作人员的要求降低。(6)本发明采用icp-ms技术对汞、镉联合暴露进行检测的前处理步骤进行了优化，能够更好地减少检测的成本和时间。附图说明图1健康对照组和病例组的汞暴露水平。箱式图的顶部和底部分别代表第七十五和第二十五百分位，箱式图的上端到下端代表第九十和第十百分位。图2健康对照组和病例组的镉暴露水平，图注参考图1。图3卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，汞、镉高暴露显著增加了非梗阻性无精子症发病率。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1研究对象选择和分组依据本发明人从南京医科大学附属南京妇幼保健院采集符合要求的非梗阻性无精子症病例及正常对照男性的全血样本。精液检查和生育力正常的为对照，非梗阻性无精子症者为病例。随机纳入100例病例，根据年龄、bmi、禁欲时间匹配对照男性100人，共200人作为非梗阻性无精子症汞、镉混合暴露评估的实验对象。具体的样本归类标准如下：第一阶段关联探索阶段纳入病例男性100人，根据年龄、bmi、禁欲时间匹配对照100人，共200人。a组：健康对照组(100人，精液检查和生育力正常)：1.年龄在22到37岁间；2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；3.无吸烟、饮酒史；4.无泌尿生殖道炎症、附睾炎、睾丸损伤、隐睾等疾病史；5.无性功能异常或排精异常；6.无其他与男性生殖障碍有关的疾病史。b组：病例组(100人，非梗阻性无精子症者)：1.年龄在25到38岁间；2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；3.无吸烟、饮酒史；4.无泌尿生殖道炎症、附睾炎、睾丸损伤、隐睾等疾病史；5.无性功能异常或排精异常；6.无其他与男性生殖障碍有关的疾病史。实施例2icp-ms检测汞、镉混合暴露与非梗阻性无精子症发生的分析1.样本前处理取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。2.仪器检测分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba2+/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；表1.1icp-ms优化的操作参数b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体，使用清洗液冲洗系统。表1.2icp-ms采集参数其他步骤详见厂商说明书。进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。3.数据处理：使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑、铋分别用于校正镉和汞的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。4.数据分析：暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。5.健康对照组、病例组全血样本中汞、镉混合暴露的差异和诊断意义。经welch'st-test发现病例组汞和镉暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异(结果见图1、图2、图3)，病例组高暴露人数与对照组高暴露人数具体比例为汞高暴露2.55:1，镉高暴露：2.00:1，汞、镉均高暴露2.00:1，病例组的高暴露人数多于对照组，显著增加了非梗阻性无精子症发病率。实施例3用于检测男性全血汞、镉混合暴露辅助诊断非梗阻性无精子症的试剂盒制作首先通过icp-ms的方法确定病例组全血中具有较高水平的汞、镉浓度，然后通过卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，汞、镉高暴露显著增加了非梗阻性无精子症发病率。检测汞、镉混合暴露可以用于非梗阻性无精子症的辅助诊断。此试剂盒包括一批全血中汞、镉检测用试剂和耗材，其中稀释剂用于样品稀释，其中含有稳定且可检测的内标用于实验质量控制，汞和镉标准曲线浓度梯度各一条用于绘制标准曲线进行定量分析，清洗液用于容器清洗和空白对照。此试剂盒的价值在于只需要100μl男性全血，即可同时检测全血中的汞、镉含量，再通过分析结果与参考值的比较用于辅助诊断非梗阻性无精子症，并易于进行动态监测和观察治疗效果。具体试剂盒组成如下：试剂a：稀释剂(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/l铑+10μg/l铋，其余为去离子水)；试剂b：汞标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50μg/l；试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。参考文献[1]wuh,sunl,weny,etal.majorspliceosomedefectscausemaleinfertilityandareassociatedwithnonobstructiveazoospermiainhumans[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2016,113(15):4134-9.[2]ropkea,tuttelmannf.mechanismsinendocrinology:aberrationsofthexchromosomeascauseofmaleinfertility[j].europeanjournalofendocrinology,2017,177(5):r249-r59.[3]swansh,elkinep,fensterl.thequestionofdecliningspermdensityrevisited:ananalysisof101studiespublished1934-1996[j].environmentalhealthperspectives,2000,108(10):961-6.[4]黄莉萍,李亚斐,熊鸿燕,etal.近25年中国正常男性精液质量的变化趋势分析[j].生殖与避孕,2011,2):122-8,39.[5]taylorcm,emondam,lingamr,etal.prenatallead,cadmiumandmercuryexposureandassociationswithmotorskillsatage7yearsinaukobservationalbirthcohort[j].environmentinternational,2018,117(40-7.[6]choycm,yeungqs,briton-jonescm,etal.relationshipbetweensemenparametersandmercuryconcentrationsinbloodandinseminalfluidfromsubfertilemalesinhongkong[j].fertilityandsterility,2002,78(2):426-8.[7]lip,zhongy,jiangx,etal.seminalplasmametalsconcentrationwithrespecttosemenquality[j].biologicaltraceelementresearch,2012,148(1):1-6.[8]paschaldc,tingbg,morrowjc,etal.tracemetalsinurineofunitedstatesresidents:referencerangeconcentrations[j].environmentalresearch,1998,76(1):53-9.[9]homma-takedas,kugenumay,iwamurot,etal.impairmentofspermatogenesisinratsbymethylmercury:involvementofstage-andcell-specificgermcellapoptosis[j].toxicology,2001,169(1):25-35.[10]orisakweoe,afonneoj,nwobodoe,etal.low-dosemercuryinducestesticulardamageprotectedbyzincinmice[j].europeanjournalofobstetrics,gynecology,andreproductivebiology,2001,95(1):92-6.[11]xuyr,yangwx.rolesofthreees-caspasesduringspermatogenesisandcadmium-inducedapoptosisineriocheirsinensis[j].aging,2018,10(5):1146-65.[12]chemekm,vendittim,boughamouras,etal.involvementoftesticulardaam1expressioninzincprotectionagainstcadmium-inducedmaleratreproductivetoxicity[j].journalofcellularphysiology,2018,233(1):630-40.[13]boujbihama,hamdenk,guermazif,etal.impairmentofspermatogenesisinratsbymercuricchloride:involvementoflow17beta-estradiollevelininductionofacuteoxidativestress[j].biologicaltraceelementresearch,2011,142(3):598-610.[14]jenardhananp,panneerselvamm,mathurpp.effectofenvironmentalcontaminantsonspermatogenesis[j].seminarsincell&developmentalbiology,2016,59(126-40.[15]pizenta,taribab,zivkovict.r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