本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及一种与早产相关的暴露生物标志物及其检测方法和应用，该暴露生物标志物为铅镉混合暴露，其检测方法为基于icp-ms的检测方法。
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：：2017年美国妇产科医师学会(acog)早产指南定义早产为妊娠不满37周的分娩，但因各国的新生儿治疗水平不同，所以对早产的下限设置各不相同[1]。我国早产的定义为孕28周至不足37周的分娩。2012年5月2日who发布的《全球早产儿行动报告》指出，每年出生的早产儿估计已达1500万，全球早产平均发生率约为10％，高居妊娠并发症榜首[2]。早产是导致新生儿死亡的主要原因之一，也是继肺炎之后导致5岁以下儿童死亡的第2大原因。据资料显示，西方发达国家早产儿死亡率为0.5％～0.9％，发展中国家则更高，为12.7％～20.8％[3]。我国早产儿总数原本就位居全球第2，随着二孩政策的开放，早产儿的数量将进一步升高。出生的早产儿即使有幸存活下来，也将面临多种并发症，如呼吸窘迫综合征、坏死性小肠炎、脑瘫、神经功能障碍和视听障碍等[4-6]，昂贵的治疗费用给家庭和社会造成了巨大的负担。近年来，各国政府及组织已经逐渐意识到早产是21世纪威胁下一代人口素质亟待攻克的妊娠期难题。早产具体发病机制至今不明，但越来越多的证据表明，早产是多种因素共同作用导致的综合征。早产的机制研究始于20世纪50年代，最开始聚焦于感染性因素和胎膜本身结构的改变，近年来转向了诸如蜕膜衰老、蜕膜出血与血管相关疾病、母胎免疫耐受失衡、孕激素撤退、子宫过度膨胀、宫颈疾病、血管疾病、氧化应激等[7]。其中环境毒物由于患者认识不足和检测技术的限制，是较容易被临床所忽略的重要病因。要做到早产的预防，就要进行早产的早期诊断。正是由于早产的机制不明，所以，目前临床使用的早产诊断方法不论是准确度还是特异度都不够理想，尚未找到能够实现精准诊断的单一标志物。基因组学进行了大量广泛的研究，相对于投入的大量资金及人员，其研究结果对健康的影响并不明显。暴露组学作为基因组学的补充是指从妊娠开始贯穿整个人生的环境暴露(包括生活方式因素)，暴露源包括外源(污染、辐射、饮食等)和内源(炎症、感染、微生物等)，继全基因组关联研究(gwas)之后发展的全暴露组关联研究(ewas)的目的是对在未知方式下暴露的评估，ewas方法通过比较患者和健康受试者暴露组的分析结果，确定有效的生物标志物，进而利用这些生物标志物来阐明暴露-效应关系(生化流行病学)、暴露和人体动力学来源(暴露生物学)、以及作用机制(系统生物学)。环境暴露与健康之间的关系研究可从测定病例组和对照组外环境中的空气、水、食物内的污染物入手，检验两组间是否存在差异，进而通过对主要物质的摄入量、代谢等进行考量，估计暴露剂量，这称之为自下而上的方法(bottom-up)；另一种方法是从测量病例组和对照组血液或其他体液内的物质入手，检验各类物质与疾病之间的统计学联系，最终确定导致疾病的物质及其暴露来源，称之自上而下的方法(top-town)。“自下而上”和“自上而下”的方法在识别个体暴露上都具有科学价值，“自上而下”法用于揭示人类疾病的未知暴露源，而“自下而上”法是用于分析外暴露以及建立干预与预防的方法。生物标志物不仅可以用于研究外暴露，也可以用于研究内暴露。内暴露组学采用组学的方法进行研究，如基因组学、蛋白质组学、表观基因组学、代谢组学、转录组学、加合物组学等。暴露组学涉及多学科交叉(流行病学、生物统计学、生物信息学、分析化学等)，目前研究方向如发展更先进的分析技术(提高通量、降低样本量及费用等)、高效寻找合适的暴露标志物、混合暴露与疾病的关系、在群体水平找到与疾病相关的暴露因素、暴露组关联研究，等等。环境暴露与健康关系研究中存在一些问题，比如，针对单一环境暴露因素研究(忽略混合暴露的存在及各个暴露间的联合作用)，环境暴露因素种类局限(集中在已知的和法规重点控制的暴露)，环境暴露采样时机与疾病的自然发生进程分离(较少考虑慢性病存在潜伏期)、环境暴露采样与检测不准确，等等。对暴露内部标志物的测定要与疾病发生的“时间窗”相对应，否则，研究结果将可能因为暴露和疾病发生时间上的先后关系不清而无法得出可靠结论。重金属铅(pb)和镉(cd)是最常见的环境毒物之一，由于环境污染问题的存在，普通人群均可能暴露于铅和镉。以往的研究表明女性孕期的镉暴露会导致早产。据报道孕期暴露于镉会增强或抑制孕激素的生物合成，进而影响正常卵巢周期性、妊娠期的维持。目前可接受水平的孕期铅可以导致早产[8]。有文献报道，母亲妊娠期血清铅水平与中国人群早产发生正相关[9]。通常情况下，环境毒物均呈混合暴露的状态。因此，孕期铅、镉混合暴露可能是早产的重要病因，应当在临床上引起更多的关注和重视。不同化学物质间的相互作用比较复杂，根据化学物质毒性效应模式，一般有协同、相加和及拮抗效应。有文献报导，铅和镉的毒性具有协同效应，铅和镉的混合暴露比铅、镉的单独暴露的危害要大，但是，孕期母体单独暴露均处于安全浓度的铅、镉，是否在混合暴露时能够导致早产尚有待进一步研究。石墨炉原子吸收光谱法(gfaas)是目前全血中铅和镉常用的检测方法，可以做到较快速的准确定量分析[10-11]。然而这一方法标准工作曲线的线性范围窄，样品前处理较复杂，特别是其无法进行多元素同时分析，因此局限了其在混合暴露评估中的应用。其他常用方法诸如原子荧光光谱(afs)、电化学分析法等也具有特定的不足。电感耦合等离子体质谱(icp-ms)是用于痕量及超痕量多元素分析的质谱仪，具有灵敏度高、检出限低、选择性好、分析速度快、动态范围宽等优点，由于其多元素高通量检测的特点，因而被广泛应用于混合暴露特别是多种重金属混合暴露的检测当中[12]。在既往的实践中，icp-ms最初被用于环境样本如水样、土壤的重金属污染水平分析。此后又被用于具有职业暴露风险的工人体液样本中铅、镉、汞等重金属水平检测。近年来，越来越多的研究和实践中使用icp-ms作为人类各类疾病的早期标志物的识别和检测应用，如糖尿病，儿童神经发育障碍，心血管疾病，不良出生结局等，相关论文发表在学术期刊《environhealthperspect》、《epidemiology》、《environpollut》、《occupenvironmed》[13]，体现出其在人类疾病诊断中的巨大潜力与价值。然而目前采用icp-ms分析孕期女性全血中铅、镉混合暴露水平在早产辅助诊断中的应用还未得到相应的关注。若能发现铅、镉混合暴露作为辅助诊断标志物与早产的明确关联，并研发相应疾病的icp-ms检测方法，提高检测结果的准确性与灵敏度，不仅可以在该领域获得国际领先的研究成果，还能创造可观的经济价值，并且为促进和提高我国新生儿健康水平做出贡献。技术实现要素：本发明的目的是：1.将铅、镉混合暴露作为早产辅助诊断标志物；2.建立基于icp-ms的孕期妇女全血中铅、镉混合暴露的检测方法；3.开发用于早产辅助诊断的铅、镉混合暴露检测和辅助诊断试剂盒。本发明的目的通过下列技术措施实现的：与早产辅助诊断相关的暴露生物标志物，该暴露生物标志物为铅和镉的混合暴露。用于检测上述暴露生物标志物的方法，该方法采用icp-ms检测孕妇全血中的铅和镉的浓度，特别是采用内标与标准曲线混合的icp-ms检测孕妇全血中的铅和镉的浓度，使用的是内标与标准曲线混合的检测方法。所述的检测方法，该检测方法的具体步骤及参数为：a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba2+/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；表1.1icp-ms优化的操作参数b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体。使用清洗液冲洗系统。表1.2icp-ms采集参数其他步骤详见厂商说明书。所述的暴露生物标志物在制备检测早产的辅助诊断试剂盒中的应用。一种用于检测早产的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有采用icp-ms检测孕妇全血中的铅和镉的浓度的试剂。所述的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：试剂a：稀释剂(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/l铑+10μg铋，其余为去离子水)；试剂b：铅标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50μg/l；试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。(注：标准曲线采用稀释剂配置，标准曲线0浓度就是稀释剂。内标元素含量通过该元素的标准液稀释而来。)本发明详细描述如下：本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的孕期妇女全血样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于icp-ms检测方法进行分析。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：一、研究对象选择和分组依据纳入病例100人，为早产儿儿的孕母；根据年龄、bmi匹配对照100人，为足月儿的孕母，测量两组孕母孕期全血中砷铬的浓度。a组：健康对照组(100人，育有早产儿)：1.年龄在20-35岁2.单胎3.无高血压、糖尿病等慢性病史4.无吸烟、饮酒史b组：病例组(100人，育有足月儿)：1.年龄在20-35岁2.单胎3.无高血压、糖尿病等慢性病史4.无吸烟、饮酒史二、icp-ms检测铅、镉混合暴露与早产发生的分析1.样本前处理取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。2.仪器检测分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba2+/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；表1.1icp-ms优化的操作参数b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体。使用清洗液冲洗系统。表1.2icp-ms采集参数其他步骤详见厂商说明书。进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。3、数据处理：使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑(rh)、铋(bi)分别用于校正镉和铅的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。4.数据分析：暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。5.健康对照组、病例组全血样本中铅、镉混合暴露的差异和诊断意义。经welch'st-test发现病例组铅和镉暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，孕期铅、镉高暴露显著增加了早产发病率。三、诊断试剂盒制备方法根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于早产的辅助诊断试剂盒，所述辅助诊断试剂盒包含一套全血铅、镉检测的试剂及耗材。本发明的有益效果：本发明人通过采用icp-ms比较正常对照和早产儿母亲孕期全血中的铅、镉混合暴露水平，发现了孕妇全血中存在具有早产辅助诊断价值的标志物组合，以及该标志物检测的icp-ms的应用，研制出可便于临床应用的和早产辅助诊断试剂盒。本发明采用孕妇全血中铅、镉混合暴露水平作为早产评价的标志物的优越性在于：(1)铅、镉混合暴露是一组新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高早产辅助诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为早产的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。(2)本发明提供的铅、镉混合暴露检测可用于早产的辅助诊断，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。(3)本发明采用早产儿病例和健康对照孕母的全血样本进行验证，证明了早产病例具有较高的铅、镉暴露水平，可作为标志物使用。(4)icp-ms技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，取样后，30分钟内可出具结果，具有较高的临床诊断实用价值。(5)本发明样本操作步骤简单，且能防止样品污染，提高灵敏度，100ul全血样本加入配备好的稀释剂中即可上机进行分析，对环境及操作人员的要求降低。(6)本发明采用icp-ms技术对铅、镉联合暴露进行检测的前处理步骤进行了优化，能够更好地减少检测的成本和时间。附图说明图1健康对照组和病例组的铅暴露水平。箱式图的顶部和底部分别代表第七十五和第二十五百分位，箱式图的上端到下端代表第九十和第十百分位。图2健康对照组和病例组的镉暴露水平，图注参考图1。图3卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，铅、镉高暴露显著增加了早产发病率。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1研究对象选择和分组依据本发明人从南京医科大学附属南京妇幼保健院采集符合要求的孕妇的全血样本。进行一阶段随访之后，根据出生结局，将早产儿孕母纳入到病例组(100人)，按年龄、bmi匹配对照100人，共200人作为早产铅、镉混合暴露评估的实验对象。具体的样本归类标准如下：第一阶段关联探索阶段纳入病例100人，为早产儿儿的孕母；根据年龄、bmi匹配对照100人，为足月儿的孕母，测量两组孕母孕期全血中铅、镉的浓度。a组：健康对照组(100人，育有早产儿)：1.年龄在20-35岁2.单胎3.无高血压、糖尿病等慢性病史4.无吸烟、饮酒史b组：病例组(100人，育有足月儿)：1.年龄在20-35岁2.单胎3.无高血压、糖尿病等慢性病史4.无吸烟、饮酒史实施例2icp-ms检测铅、镉混合暴露与早产发生的分析1.样本前处理取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。2.仪器检测分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)仪器条件：a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由icp厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba2+/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；表1.1icp-ms优化的操作参数b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体。使用清洗液冲洗系统。表1.2icp-ms采集参数其他步骤详见厂商说明书。进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。3、数据处理：使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑、铋分别用于校正镉和铅的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。4.数据分析：暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。5.健康对照组、病例组全血样本中铅、镉混合暴露的差异和诊断意义。经welch'st-test发现病例组铅和镉暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异(结果见图1、图2、图3)，病例组高暴露人数与对照组高暴露人数具体比例为铅高暴露1.05:1，镉高暴露：5.63:1，铅、镉均高暴露4.07:1，病例组的高暴露人数多于对照组，铅、镉高暴露显著增加了早产发病率。实施例3用于检测孕期妇女全血铅、镉混合暴露辅助诊断早产的试剂盒制作首先通过icp-ms的方法确定病例组全血中具有较高水平的铅、镉浓度，然后通过卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，铅、镉高暴露显著增加了早产发病率。检测铅、镉混合暴露可以用于早产的辅助诊断。此试剂盒包括一批全血中铅、镉检测用试剂和耗材，其中稀释剂用于样品稀释，其中含有稳定且可检测的内标用于实验质量控制，铅和镉标准曲线浓度梯度各一条用于绘制标准曲线进行定量分析，清洗液用于容器清洗和空白对照。此试剂盒的价值在于只需要100μl女性全血，即可同时检测全血中的铅、镉含量，再通过分析结果与参考值的比较用于辅助诊断早产的发生，并易于进行动态监测和观察治疗效果。具体试剂盒组成如下：试剂a：稀释剂(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/l铑+10μg铋，其余为去离子水)；试剂b：铅标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50μg/l；试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。主要参考文献1.direnzogc，caberorl，facchinettif，etal.pretermlaborandbirthmanagement：recommendationsfromtheeuropeanassoci-ationofperinatalmedicine[j].jmaternfetalneonatalmed，2017，30(17)：2011-2030.2.lancett.theunfinishedagendaofpretermbirths[j].lancet，2016，388(10058)：2323.3.drazancia.antenatalcareindevelopingcountries.whatshouldbedone？[j].jperinatmed，2001，29：188-198.4.mwanikimk，atienom，lawnje，etal.long-termneurodevel-opmentaloutcomesafterintrauterineandneonatalinsults：asys-tematicreview[j].lancet，2012，379(9814)：445.5.杜鹃，黄贞姣.围产期泌尿生殖道感染与早产[j].中国实用妇科与产科杂志，2016，32(6)：522-525.6.陈一虹，刘兴会.胎盘疾病与早产[j].中国实用妇科与产科杂志，2016，32(4)：308-312.7.romeror，deysk，fishersj.pretermlabor：onesyndrome，manycauses[j].science，2014，345(6198)：760-7658.vigehm,yokoyamak,seyedaghamiriz,shinoharaa,matsukawat,chibam,yunesianm:bloodleadatcurrentlyacceptablelevelsmaycausepretermlabour.occupationalandenvironmentalmedicine2011,68(3):231-234.9.lij,wangh,haojh,etal.maternalserumleadlevelduringpregnancyispositivelycorrelatedwithriskofpretermbirthinachinesepopulation.[j].environmentalpollution,2017,227:484-489.10.《血铅临床检验技术规范》11.《血中镉的石墨炉原子吸收光谱测定方法(ws/t34-1996)》12.ettlerv,mihaljevicm,komarekm:icp-msmeasurementsofleadisotopicratiosinsoilsheavilycontaminatedbyleadsmelting:tracingthesourcesofpollution.analyticalandbioanalyticalchemistry2004,378(2):311-317.13.schutza,bergdahlia,ekholma,skerfvings:measurementbyicp-msofleadinplasmaandwholebloodofleadworkersandcontrols.occupationalandenvironmentalmedicine1996,53(11):736-740.当前第1页12当前第1页12