基于EBFC的自供能细菌生物传感器及其应用的制作方法

本发明构建了一种通过整合普鲁士蓝(prussianblue,pb)电致变色和适配体与抗原的特异性结合的基于可视化可重复酶生物燃料电池(ebfcs)的自供电生物传感平台用于检测副溶血弧菌，属于生物传感技术领域。

背景技术：

酶生物燃料电池(ebfcs)是一种新型的绿色能源转化技术，由于其操作条件温和，应用前景良好，可从生化反应中提取生物能源。基于ebfc的自供能生物传感器，是一种以电池性能输出作为分析检测信号的一类传感器，该传感器信号与被检测分析物浓度成比例关系。其具体优点主要表现在：(1)设备简单。检测过程仅需两根电极，即ebfc的阴阳两极，便可实现检测；(2)抗干扰能力强。测试体系未施加额外电源，能有效避免易发生氧化还原的电活性物质在电极表面反应，从而提高了传感器的抗干扰能力；(3)能实现简单、快速、实时检测。检测过程中无需电化学工作站等供电设备，仅需简易电压表和适宜的光源便可实现检测，故检测设备易携带，能实现实时监测。基于ebfc的自供电生物传感器已成功应用于确定有毒污染物，免疫测定，癌症标记，药物释放和食品安全，已成为新型生物传感平台，实现不同目标的检测。

食品中的致病菌对人类生命的一大威胁，如伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。目前已经有多种检测食物中的致病菌的方法，包括聚合酶链反应(pcr)、生化免疫检测、下一代测序(ngs)、dna探针、表面增强拉曼散射(sers)光谱，但其昂贵且复杂，检测难度大。为了解决这些问题，开发高灵敏度和选择性的生物传感器来潜在地检测食品病原体是非常紧迫的。此外，具有显著的化学稳定性、易于化学修饰、体积小、合成简单、特异度高等优点的适配体已成为理想的病原菌检测分子受体。因此，设计制备基于生物燃料电池的自供能生物传感器，实现对副溶血弧菌等食用致病菌简单、方便、高灵敏、高特异性检测非常必要。

技术实现要素：

本发明构建了一种新型可视化和可重复的基于ebfcs的自供电生物传感平台，用于超灵敏检测食物中的致病菌(foodpathogens)。pb电致变色和氧化还原状态的变化以及适配体对致病菌的特异性识别在生物传感器中发挥了重要作用。本发明将葡萄糖脱氢酶(gdh)和适配体固定在pth/cnts/aunp上作为生物阳极，介导的pb电极和将胆红素氧化酶(bod)固定在cnt上的生物阴极构建燃料电池。一方面，当生物阳极与pb电极连接时，gdh氧化葡萄糖产生电子通过外部电路流向pb以将pb转换为普鲁士白(pw)，而pb的蓝色也是改为透明。另一方面，将生物阴极电极与pw电极连接，生物阴极从pw电极接收电子使其氧化成原始的pb状态。在这种情况下，ebfc产生了两个高的开路电压(e^ocv)。当存在致病菌时，它们被适配体特异性识别并结合，由于空间位阻效应使燃料葡萄糖远离gdh表面上的活性位点，使ebfc产生低的e^ocv。同时，当pw电极与生物阴极连接时，由于pb较难转换成pw，所以接收到另一个低e^ocv。因此，通过比较电致变色显示的颜色变化程度和生物阳极与pb和pw与生物阴极产生的两个e^ocv的比较，成功地实现了超灵敏检测食物中的致病菌。这种有效而简单的策略不仅表现出高灵敏度和高选择性，而且还实现了可视化检测和可重复使用。

本发明是采用以下的技术方案实现的：

一种基于ebfc的自供能生物传感器，包括阳极、pb电极、阴极和电解液；所述阳极为mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极，所述阴极为bod/cnts/cp生物阴极，所述电解液为含1～3mmnad⁺/nadh、3～6mm葡萄糖ph6.0的0.1mpb缓冲体系。

mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极的制备方法包括如下步骤：

对修饰有cnt/aunps的cp电极表面进行循环伏安扫描聚合上硫堇，电极用含有gdh溶液和适配体(sh-dna)的混合物涂覆，一次孵育，获得aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp；二次水冲洗电极表面，向电极表面滴加mch溶液，二次孵育，进行封板，二次水冲洗电极表面，得到mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极。

所述mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极的制备方法如图1所示，包括如下步骤：

步骤a：将1～6ml的haucl4加至90～100ml的二次水搅拌加热至沸腾后，快速加入7～15ml、37～40mm的柠檬酸钠溶液煮沸15min,冷却获得的酒红色透明液体即为aunps；

步骤b：称取6～10mg的碳纳米管(cnt)溶解于2～6ml、0.5～2％的聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)超声处理30min，将得到的溶液11000～15000rpm多次离心洗涤15min，取上清液得到黑色固体用0.5-2ml二次水定容，加入步骤a得到的溶液至8～12ml吸附一夜，4000～6000rpm、4～7min超声洗涤，得到的沉淀分散于0.5～2.5ml的二次水中，得到cnt/aunps混合物；

步骤c：将20～60μl步骤b中制得的cnt/aunps滴涂在cp电极表面，置于37℃下干燥后，放入一个三电极电池中。以50mvs^-1的扫描速率在1～3mm硫堇溶液(2.2mm乙酸)中进行循环伏安扫描。扫速可为30-70mvs^-1，硫堇溶液浓度为1～3mm(溶于2.2mm乙酸)。扫描范围从-0.3v至1.2vvsag/agcl再扫回-0.3v，共10圈。电极用含有1～4mgml^-1gdh溶液和400～700nm的适配体(sh-dna)的25～60μl混合物涂覆，在为3～7℃孵育8～16h，通过aunps和sh-dna之间的au-s键获得aptamer/gdh/pth/cnt/aunps修饰的电极。二次水冲洗电极表面，向电极表面滴加20～50μl、1～3mm的mch溶液，室温孵育0.5～2h，进行封板，二次水冲洗电极表面，置于4℃下备用。

所述bod/cnt/cp生物阴极的制备方法，包括如下步骤：

步骤ⅰ：取一定量的cnt分散在1～3ml二次水中,将20～50μlcnt溶液滴涂在ito电极表面，37℃下干燥2～4h；

步骤ⅱ：向上述电极滴涂10～25μl、0.5～2mg/ml的bod溶液，4℃下干燥12～24h，得到bod/cnt/cp生物阴极，二次水冲洗后，置于4℃下备用。

所述pb电极的制备方法，包括如下步骤：

步骤：通过在ito电极上电沉积普鲁士蓝薄膜制备电致变色显示器。在改性之前，在超声浴中用乙醇和水洗涤ito电极。然后将ito电极浸入1:1乙醇：naoh(1～3m)的溶液中30分钟以活化表面。用二次水冲洗后，通过施加0.4v的恒定电位，用含有0.1～0.3mkcl，0.05～0.2mhcl，2～3mmk3[fe(cn)6]和1.5～4mmfecl3·6h2o的新制备的溶液中对ito电极进行120～360s电聚合。通过其明显的颜色和吸光度变化证实了pb膜的成功制备。然后用二次水冲洗ito电极并在空气中干燥。

一种基于ebfc的自供能细菌生物传感器，包括阳极、pb电极、阴极和电解液；所述阳极为mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极，所述阴极为bod/cnt/cp生物阴极，所述电解液为含1～3mmnad⁺/nadh、3～6mm葡萄糖ph6.0的0.1mpb缓冲体系。

一种如上述所述的基于ebfc的自供能细菌生物传感器的应用，将其用于检测foodpathogens。

所述检测方法包括如下步骤：

步骤(1)：将mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极、pb电极、含1～3mmnad⁺/nadh、3～6mm葡萄糖ph6.0的0.1mpb缓冲体系组装为电池，测量电池的e1^ocv，记为e10^ocv；将bod/cnt/cp生物阴极、pw电极、含1～3mmnad⁺/nadh、3～6mm葡萄糖ph6.0的0.1mpb缓冲体系组装为电池，测量电池的e2^ocv，记为e20^ocv；

步骤(2)：将mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极置于0.5～2ml不同浓度的致病菌在37℃孵育60～120分钟，得到pathogens/mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极，二次水冲洗电极表面；

步骤(3)：pathogens/mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极、pb电极、含1～3mmnad⁺/nadh、3～6mm葡萄糖ph6.0的0.1mpb缓冲体系组装为电池，测量电池的e1^ocv，记为e1n^ocv；将bod/cnt/cp生物阴极、pw电极、含ph6.0的0.1mpb缓冲体系组装为电池，测量电池的e2^ocv，记为e2n^ocv，观察pb电极的颜色变化。

基于ebfc的自供能细菌生物传感器超灵敏检测foodpathogens的原理如图1所示：

当无目标pathogens时，葡萄糖接近电极上gdh表面的活性位点被氧化成葡萄糖酸内酯产生电流较大，流向pb电极的电子较多，通过外部电路流向pb以将pb转换为普鲁士白(pw)，而pb的蓝色也是变为透明，此时，ebfc的开路电压较大。将生物阴极电极与pw电极连接，生物阴极从pw电极接收电子使其氧化成原始的pb状态，同时产生了高的开路电压(e^ocv)。当引入目标物致病菌时，它们被适配体特异性识别并结合，由于空间位阻效应使葡萄糖无法接近gdh表面上的活性位点，使ebfc产生低的e^ocv，pb无法完全转化为pw，不同浓度致病菌所产生的pw电极的颜色不同。因此，通过比较电致变色显示的颜色变化程度和生物阳极与pb和pw与生物阴极产生的两个e^ocv的比较，成功地实现了超灵敏检测食物中的致病菌的数量。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种基于ebfc的自供能细菌生物传感器，实现对foodpathogens简单、方便、快速、灵敏、高效检测，相对现有的foodpathogens检测方法，具有以下特点：

(1)本发明所述的基于ebfc的自供能细菌生物传感器，检测过程中无需外加电源，整个检测设备简单，便于实现现场实时监测；

(2)本发明所述的pb的电致变色性能好，颜色变化度高，稳定性高，可重复性好；

(3)本发明所述的基于ebfc的自供能细菌生物传感器采用适配体进行目标物识别，不仅具有极高选择性，还具有成本低、操作简单等优点；

(4)本发明所述的基于ebfc的自供能细菌生物传感器中，致病菌具有对生物阳极的氧化葡萄糖有很好的空间位阻效应，同时生物阴极对氧气具有良好的电催化活性，pb电极有很好的得失电子变色的能力，实现对目标物foodpathogens的超灵敏检测，提高了检测灵敏度；

(5)通过构建无额外供电设备的自供能生物传感器，不需要昂贵的仪器设备，可实现foodpathogens检测的微型化、便携化和集成化。

附图说明

图1为基于ebfc的自供能细菌生物传感器超灵敏检测foodpathogens的原理图；

图2(a)为不同浓度foodpathogens的mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极和pb电极联合的e1^ocv值，图2(c)为bod/cnt/cp生物阴极和pw电极联合的e2^ocv值；

图2(b)、(d)为将foodpathogens的不同浓度作为横坐标、foodpathogens的不同浓度下测得的en^ocv值作为纵坐标的对数线性关系图。

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面通过实施例，对本发明作进一步详细说明。

实施例一：

基于ebfc的自供能细菌生物传感器用于v.parahaemolyticus的检测。

(1)aunps的制备：

将4ml的haucl4加至96ml的二次水搅拌加热至沸腾后，快速加入10ml、38.8mm的柠檬酸钠溶液煮沸15min,冷却获得的酒红色透明液体即为aunps；

(2)cnt/aunps的制备：

称取8mg的碳纳米管(cnt)溶解于4ml、1％的聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)超声处理30min，将得到的溶液15000rpm多次离心洗涤15min，取上清液得到黑色固体用1ml二次水定容，加入步骤a得到的溶液至10ml吸附一夜，5000rpm、6min超声洗涤，得到的沉淀分散于1ml的二次水中，得到cnt/aunps混合物；

(3)mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极的制备：

将50μl步骤(2)中制得的cnt/aunps滴涂在cp电极表面，置于37℃下干燥后，放入一个三电极电池中。以50mvs^-1的扫描速率在2mm硫堇溶液(2.2mm乙酸)中进行循环伏安扫描。扫描范围从-0.3v至1.2vvsag/agcl再扫回-0.3v，共10圈。修饰后的电极用含有2mgml^-1gdh溶液和500nm的适配体(sh-dna)的40μl混合物涂覆，在3～7℃孵育8～16h，通过aunps和sh-dna之间的au-s键获得aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp。二次水冲洗电极表面，向电极表面滴加30μl、1mm的mch溶液，室温孵育0.5h，进行封板，二次水冲洗电极表面，得到mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp，置于4℃下备用。

(4)bod/cnt/cp生物阴极的制备：

取1mg的cnt分散在1ml二次水中,将50μlcnt溶液滴涂在ito电极表面，37℃下干燥2h。向电极表面滴涂15μl、1mg/ml的bod溶液，4℃下干燥12h，得到bod/cnt/cp生物阴极，二次水冲洗后，置于4℃下备用。

(5)pb电极的制备：

通过在ito电极上电沉积普鲁士蓝薄膜制备电致变色显示器。在超声浴中用乙醇和水洗涤ito电极。然后将ito电极浸入1:1乙醇：naoh(2m)的溶液中30分钟以活化表面。用二次水冲洗后，通过施加0.4v的恒定电位，用含有0.1mkcl，0.1mhcl，2.5mmk3[fe(cn)6]和2.5mmfecl3·6h2o的新制备的溶液中对ito电极进行240s电聚合。通过其明显的颜色和吸光度变化证实了pb膜的成功制备。然后用二次水冲洗ito电极并在空气中干燥。

(6)基于ebfc的自供能细菌生物传感器的搭建和测量：

如图1a所示，将mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极、作为阴极的pb、转移到盛有含2mmnad⁺/nadh、5mm葡萄糖ph6.0的0.1mpb缓冲溶液的小池子中，利用两电极体系，工作电极夹生物阴极，参比电极和对电极接在一起夹光阳极，进行信号测试，测量电池的e1^ocv，记为e10^ocv；将bod/cnt/cp生物阴极、作为阳极pw(由pb转化)电极、含ph6.0的0.1mpb缓冲溶液的小池子中，利用两电极体系，工作电极夹生物阴极，参比电极和对电极接在一起夹光阳极，进行信号测试，测量电池的e2^ocv，记为e20^ocv；

将mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极置于1ml不同浓度的v.parahaemolyticus在37℃孵育90分钟，得到v.p/mch/aptamer/gdh/pth/cnt/aunps/cp生物阳极，二次水冲洗电极表面；将该生物阳极和pb电极组装成电池，测量电池的e1^ocv，记为e1n^ocv；将bod/cnt/cp生物阴极、pw电极、含ph6.0的0.1mpb缓冲体系组装为电池，测量电池的e2^ocv，记为e2n^ocv，观察pb电极的颜色变化。

更换目标v.parahaemolyticus的浓度，得到一系列e1n^ocv和e2n^ocv值，将v.parahaemolyticus的不同浓度设为横坐标，将一系列v.parahaemolyticus的不同浓度下测得的e1n^ocv和e2n^ocv值设为纵坐标，得到v.parahaemolyticus浓度与e1n^ocv和e2n^ocv值之间的线性关系，以便于通过测定的e1n^ocv和e2n^ocv值，根据线性关系得知具体的v.parahaemolyticus浓度，达到检测v.parahaemolyticus的目的。

本实施例中，适配体的dna序列为：5′-sh-(ch2)6-tctaaaaatgggcaaagaaacagtgactcgttgagatact-3′。

以上实施例仅为v.parahaemolyticus的检测方法，基于ebfc的自供能细胞传感器这一通用平台，通过改变适配体的种类，可以检测对应的foodpathogens，实用性强。

图4(a)、(c)为修饰有不同浓度v.parahaemolyticus的e1n^ocv和e2n^ocv值，从左至右浓度分别为5、10、50、100、200、500、1000、5000、10000cfuml^-1；图4(b)、(d)为将v.parahaemolyticus的不同浓度作为横坐标，v.parahaemolyticus的不同浓度下测得的e1n^ocv和e2n^ocv值作为纵坐标，得到的对数线性关系图。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而己，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的均等修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的专利涵盖范围内。