一种抗干扰能力强的同型半胱氨酸诊断检测试剂盒的制作方法

本发明试剂盒涉及临床医学检测领域，特别涉及一种抗干扰能力强的同型半胱氨酸检测试剂盒。

背景技术：

同型半胱氨酸是一种含硫的氨基酸，为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中产生的重要中间产物。研究表明，同型半胱氨酸通过产生氧化物引起血管内皮细胞的损伤，达到改变凝血因子的功能。因此，当凝血因子功能改变后，会增加血栓形成的可能性，促进动脉粥样硬化，提高血管疾病的的发病率。因此，同型半胱氨酸的临床诊断和检测对于血管疾病的预防和诊断具有重要意义。

同型半胱氨酸的常用测定方法有酶法、高效液相色谱法、酶联免疫法和氨基酸分析仪测定法等。酶法检测主要利用同型半胱氨酸转甲基酶及腺苷同型半胱氨酸的循环扩增作用，在结合腺苷脱氨酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶和过氧化物酶等进行显色反应来测定同型半胱氨酸含量，本方法使用的工具酶较多，稳定性不强，反应步骤复杂，不适于在全自动生化分析仪上进行操作应用，再加上不同的酶最适酶活力要求条件不同，造成试剂很难配置；高效液相色谱法是较为经典的检测方法，但是由于操作复杂、历时长、成本高，不适用于临床检测，目前已被其他方法取代；酶联免疫法是临床检测常用的检测同型半胱氨酸的方法，操作简单、迅速，重复性好稳定性高，但是本方法不适用于自动化操作，且造价较高。

以上所述方法几乎都存在抗干扰能力差的问题，人体血清中成分复杂，不排除多种干扰物质共存的状态，导致临床检测容易出现一定的结果偏差。鉴于以上情况，本发明提供一种抗干扰能力强的同型半胱氨酸诊断检测试剂盒，本试剂盒抗干扰能力强，稳定性能好，成本造价低，十分具有推广意义。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种抗干扰能力强的同型半胱氨酸诊断检测试剂盒，本发明试剂盒重点解决检测过程中干扰物质引起的结果偏差问题。

检验原理

本发明一种抗干扰能力强的同型半胱氨酸诊断检测试剂盒，其作用机理如下：氧化型的同型半胱氨酸游离后在cbs催化下和丝氨酸发生反应，生成l-胱硫醚，l-胱硫醚在cbl作用下又生成同型半胱氨酸、丙酮酸和氨，反应中生成的丙酮酸可以利用乳酸脱氢酶和nadh检测到，nadh转变成nad⁺速率于检测样品中的同型半胱氨酸含量成正比关系。通过检测340nm处吸光度变化，进而检测出nadh的变化速率，因此通过计算nadh变化速率可以间接的计算出同型半胱氨酸的含量。

应用本发明试剂盒测定血清中同型半胱氨酸含量，其检测方法如下：检测方法为速率法；检测所用全自动生化分析仪bs--800，波长为主波长340nm，辅波长为700nm；样本：试剂r1：试剂r2为10:260:65；反应温度为37℃；读点设置为21点-27点。

本发明是一种抗干扰能力强的同型半胱氨诊断检测试剂盒，是由试剂r1和试剂r2组成的双试剂液体型检测诊断试剂盒，其中试剂r1组成为：试剂r1组成为：

试剂r2的组成:

本发明一种抗干扰能力强的同型半胱氨酸诊断检测试剂盒，所述试剂r1和试剂r2中物质的选择依据为：

goods缓冲液和三乙醇胺缓冲液主要是能够提供一种稳定反应环境，保证反应不容易受到外界环境变化而引起检测结果偏差。

nadh作为反应底物，用来生成nad⁺,nadh的变化速率能够引起340nm处的吸光度变化。

丝氨酸作为反应底物，和游离的同型半胱氨酸在酶催化下生成l-胱硫醚。

乳酸脱氢酶(ldh)，主要起催化作用。

巯基乙醇和谷胱甘肽作为保护剂，主要保护还原性物质。

trionx-405作为表面活性剂，主要作用是加速反应的进行。

牛血清蛋白(bsa)，主要是模仿血清中一种蛋白环境。

葡聚糖2000，甘露醇和山梨酸钾作为稳定剂，主要起稳定作用。

氯仿，主要是去除血清中的胆红素引起的干扰。

维生素c氧化酶，主要是去除血清中vc的干扰。

edta-na2作用是螯和血清中的金属离子。

胱硫醚β-合成酶和胱硫醚β-分解酶催化作用。

谷胱甘肽，作为还原物质，主要是用于保护试剂中易被氧化的物质不受外界氧化剂的氧化。

本发明试剂盒可以应用到迪瑞、迈瑞、日立、东芝等系列的全自动化分析仪中进行自动化检测。

附图说明

图1实施例3试剂与对照试剂盒相关性。

具体实施方式：

以下结合实施例对本发明进行具体说明。

实施例1

实施例1试剂包括试剂r1和r2，具体组成成分如下：

试剂r1组成为：

试剂r2的组成:

实施例2

实施例2试剂包括试剂r1和r2，具体组成成分如下：试剂r1组成为：

试剂r2的组成:

实施例3

实施例3试剂包括试剂r1和r2，具体组成成分如下：

试剂r1组成为：

试剂r2的组成:

本发明试剂盒性能检测试验：

稳定性试验检测：

运用本发明试剂盒和目前市场上流通的试剂盒进行对比，本发明试剂盒按照实施例1试剂配方配置，校准液和质控品分别是对照试剂自带的，使用仪器为全自动生化分析仪bs-800，实施例1试剂参数设置如下，波长为340nm，反应方向为反方向，读数点设置为21-27点，样本量：试剂r1：试剂r2＝10ul：260ul：65ul；对照试剂盒严格按照试剂盒操作说明书进行，检测仪器为bs-800，以对照试剂盒自带校准品进行校准检测，后进行结果检测。检测结果如表1所示：

表1对照试剂与实施例1试剂稳定性检测结果

注：对照试剂自带质控品靶值为20μmol/l。

通过本实验，我们发现在4℃条件下历时120天后，实施例1试剂和对照试剂盒检测结果偏差不大，均在10％之内，与对照试剂盒相比，实施例1试剂检测结果更佳；37℃条件下，实施例1试剂历时120天检测结果刚刚超出了10％，但是对照试剂盒在37℃处理第7天时检测结果已经偏离靶值10％，15天后检测结果偏离靶值40％；45℃条件下，实施例1试剂与对照试剂盒，经热处理后均有不同程度的降低，本发明试剂盒历经15天，检测结果尚未偏离靶值10％，对照试剂盒第三天已经偏离检测结果靶值10％，15天偏离检测结果50％。通过上述数据分析，实施例1试剂在稳定性方面远优于对照试剂盒。

抗干扰实验

运用常规市售试剂盒作为对照试剂，其校准品和质控品做为校准品和质控品，本发明试剂盒实验组，按照实施例2试剂配方配置(实验组试剂使用对照试剂盒校准品和质控品)。购买胆红素，维生素c和人工血清，分别配制成200umol/l的胆红素血清溶液和50mg/l的维生素c血清溶液，称作a液和b液。然后通过倍比稀释配制成不同梯度的血清混合液，即a原液、稀释2倍、稀释4倍稀释8倍，b原液、稀释2倍、稀释4倍、稀释8倍。运用bs-800全自动生化分析仪进行测试，测试结果如表2所示：

表2实施例2试剂与对照试剂盒抗干扰能力检测结果

说明：人工血清中同型半胱氨酸含量为4.7umol/l，对照试剂盒检测20次求出的平均值

通过表2得出，在胆红素含量为200umol/l时，实施例2试剂检测结果偏出靶值10％以内，但是对照试剂盒在胆红素含量为50umol/l时检测结果已经偏出靶值15％以上。对于干扰物质维生素c来说，实施例2试剂在维生素c含量为50mg/l时，检测结果与靶值偏差仍然在10％以内，但是对照试剂盒在维生素c含量为25mg/l时，检测结果已经偏出靶值30％左右。因此，实施例2试剂在抵抗胆红素和维生素c两种干扰物质时，抗干扰能力远远优于对照试剂盒。

临床样本检测实验

本发明试剂盒同对比试剂盒对随机n＝40个样本进行测试，测试结果以表格的形式在下表进行体现，通过表3记录的数值，进而计算出本发明试剂盒与市场流通的试剂盒的相关性。本发明试剂盒采用实施例3配方进行检测。检测结果详见表3、图1。

表3实施例3试剂与对照试剂盒临床检测结果

通过表3和图1得出，实施例3试剂与对照试剂盒相关系数r≥0.999，因此我们断定，本发明一种抗干扰能力强的同型半胱氨酸诊断检测试剂盒，完全能够胜任临床检测。

在每组实施例中，三组配方都进行了检测，每组均选择了最佳的一组，另外两组数据没有全部呈现，但是经过我们分析。实施例2配方是最佳配方。本发明配置的试剂配方具有抗干扰能力强、稳定性高、成本低、易于购买等优点，成功解决了同型半胱氨酸检测试剂存在的抗干扰、稳定性及成本等问题。