一种荧光免疫层析卡的制备方法及荧光免疫层析卡与流程

本发明涉及免疫检测领域，特别是指一种荧光免疫层析卡的制备方法及荧光免疫层析卡。

背景技术：

血管内皮生长因子(vegf)是促进肿瘤血管新生的关键性蛋白。对人体血清中vegf含量的测定，在血管新生类疾病如肿瘤的疗效评估监测、肿瘤复发监测、肿瘤病人预后、肿瘤辅助诊断和肿瘤广谱筛查中具有重要意义。

1971年folkman指出在没有血管生成的情况下，实体肿瘤单纯依靠弥散获取氧气及营养物质，生长范围只能维持在1－2mm³，肿瘤组织生长范围超过2－3mm³时，必须依靠血管生成来提供足够的氧气和营养物质维持肿瘤组织的快速生长；

后来，这folkman的说法得到证实，并由folkman本人作了总结，提出了folkman理论。folkman理论揭示了肿瘤的生长和转移依赖于血管生成的原理。一方面，肿瘤在原位生长时必须依赖血管生成；另一方面，肿瘤的转移同样需要血管生成来提供足够的氧气和营养成分；

依照folkman理论，血管生成是恶性肿瘤生长和转移的基础，而vegf则是肿瘤血管生成最重要的生长因子之一。folkman理论指明了癌症病人血管生成的两个主要研究方向：①抑制血管生成阻抑癌症生长。②检测vegf作为癌症高危人群的筛查、辅助诊断、预后，以及治疗疗效的评估和监测等。另外，也有利用鼠抗血管内皮生长因子多克隆抗体、抗血管内皮生长因子单克隆抗体建立的elisa检测方法应用于血管内皮生长因子的免疫学检测。

虽然elisa检测也能在几小时内诊断出血管内皮生长因子，具有较高的特异性和灵敏度，但存在操作技术要求高、设备比较昂贵等缺点，不便于基层生产应用。开发研究便捷快速、灵敏特异的检测技术已成为一种迫切的需要。

技术实现要素：

本发明提出一种荧光免疫层析卡的制备方法及荧光免疫层析卡，通过该方法制备的荧光免疫层析卡具有便捷快速、灵敏特异等特点，使得血管内皮生长因子成本降低的同时更加便捷。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种荧光免疫层析卡的制备方法，包括：

s1、zns量子点标记抗体的制备，并将制备的zns量子点标记抗体冷藏；

s2、通过s1步骤制备的zns量子点标记抗体进行zns量子点标记抗体检测液的制备，并将制备的zns量子点标记抗体检测液冷藏；

s3、制备包被有检测抗体的反应膜；

s4、通过s3步骤制备的反应膜制备试纸板，并就将制备完成的试纸板与试纸卡组合。

作为进一步的技术方案，s1步骤包括：

s11、取浓度为5μm的1nmol羧基水溶性zns量子点，用超声波分散处理；

s12、将zns量子点、碳二亚胺盐酸盐和抗体均用100mm、ph6.0-7.4的绷酸盐溶液溶解；

s13、按照2.5μmol碳二亚胺盐酸盐/2nmolzns量子点的比例加入碳二亚胺盐酸盐，振荡混匀；

s14、再按50nmol抗体/lnmolzns量子点的比例加入浓度为5mg/ml的抗体混匀，室温搅拌反应1小时；

s15、当s14步骤反应结束后，用截留分子量为40kda-80kda的离心超滤管超滤浓缩至约60μl，然后采用凝胶色谱法进行纯化，收集有荧光的部分，再用离心超滤管浓缩至zns量子点浓度为1.1μmol/l，保存于55mm、ph为7.4-9.0的、含有质量百分比浓度为0.05％的nan3的绷酸盐缓冲液中，冷藏备用。

作为进一步的技术方案，s11步骤为：取浓度为5μm的1nmol羧基水溶性zns量子点平衡至室温，用超声波分散处理。

作为进一步的技术方案，s15步骤为：当s14步骤反应结束后，用截留分子量为40kda-80kda的离心超滤管超滤浓缩至约60μl，然后采用凝胶色谱法进行纯化，收集有荧光的部分，再用离心超滤管浓缩至zns量子点浓度为1.1μmol/l，保存于55mm、ph为7.4-9.0的、含有质量百分比浓度为0.05％的nan3的绷酸盐缓冲液中，2-8℃冷藏备用。

作为进一步的技术方案，s2步骤包括：

将zns量子点标记抗体液取出放置至室温，用pbs-t稀释550倍成zns量子点标记蛋白检测液，pbs—t为含80mm氯化钠、0.1％吐温、6mg/ml牛血清白蛋白、0.02％叠氮化钠的55mm磷酸盐缓冲液，2-8℃冷藏备用。

作为进一步的技术方案，s3步骤包括：

以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定粘贴在pvc背衬的中部，将抗体用包被缓冲液调节浓度至0.1-5mg/ml，并将二抗igg用包被缓冲液调节浓度至0.1-5mg/ml，按照0.8-1.2ul/cm的膜液量，将zns量子点标记抗体检测液以及二抗lgg喷到反应膜上对应的检测区和控制区上进行包被，进行烘箱处理后置于保藏箱备用。

作为进一步的技术方案，s3步骤包括：

以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定粘贴在pvc背衬的中部，将抗体用包被缓冲液调节浓度至0.1-5mg/ml，并将二抗igg用包被缓冲液调节浓度至0.1-5mg/ml，按照0.8-1.2ul/cm的膜液量，将zns量子点标记抗体检测液以及二抗lgg喷到反应膜上对应的检测区和控制区上进行包被，检测区和控制区之间间隔为5mm，放置25-37℃烘箱处理2小时，置于恒温恒湿保藏箱里备用。

作为进一步的技术方案，包被缓冲液包括：

70mm氯化钠nacl、0.05％—3％聚乙二醇peg20000、0.2％—1％泡藻糖、2mg/ml-lom/ml牛血清白蛋白bsa、0.02％叠氮化钠的55mm磷酸盐缓冲液。

作为进一步的技术方案，还包括：

s5、将zns量子点标记抗体检测液于待检样本混合后形成混合液，并将混合液提取后加入到试纸板上，进行反应后读取结果。

本发明还提出了一种利用荧光免疫层析卡制备方法制备的荧光免疫层析卡，包括：

用于整体支撑的pvc板；

反应膜，设置在pvc板上；

吸水垫，设置在反应膜上；

检测区和控制区，均设置在吸水垫上，并相邻设置。

本发明技术方案通过进行抗体检测液和检测所需的反应膜的制备，并将两者结合进行测试，一方面zns量子点荧光免疫层析检测卡与放射性免疫、酶联免疫吸附法、气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳等方法相比，具有操作安全(无放射污染源)、简便(步少骤，操作简单)和快速(5min即可出结果)等优点；与胶体金免疫层析法卡相比，本发明标记重复性好(生物分子与zns量子点共价结合)、多指标同时检测(不同粒径zns量子点其荧光发射波长不同，可实现多指标同时检测)、灵敏度高(zns量子点的荧光强度高)等优点。

本发明的zns量子点荧光免疫层析卡检测法，具体可以用双抗体或抗原夹心法(待检分子为大分子物质，免疫结合位点多)、免疫竞争法(待检分子为小分子，免疫结合位点少)等检测分析方法，应用领域广，可用于单项指标或多指标的高灵敏度快速检测，能够检测全血、血清、血浆、腹水、细胞液等样本；能用于临床诊断、病原微生物检出、环境污染物检测、食品农残物检测等领域。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种荧光免疫层析卡的制备方法的流程图；

图2为本发明一种荧光免疫层析卡的结构示意图。

图中：

1、pvc板；2、反应膜；3、吸水垫；4、检测区、5、控制区。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明提出的一种荧光免疫层析卡的制备方法，包括：

s1、zns量子点标记抗体的制备，并将制备的zns量子点标记抗体冷藏；其中，zns量子点为羧基水溶性核壳型zns量子点，zns量子点的发射波长范围是500nm—630nm，在激发光源辐射作用下能够发射不同波长的荧光，其荧光量子产率不低于65％；具体在本发明中，s1步骤包括

s11、取浓度为5μm的1nmol羧基水溶性zns量子点，用超声波分散处理；其中，s11步骤为：取浓度为5μm的1nmol羧基水溶性zns量子点平衡至室温，用超声波分散处理；

s12、将zns量子点、碳二亚胺盐酸盐和抗体均用100mm、ph6.0-7.4的绷酸盐溶液溶解；

s13、按照2.5μmol碳二亚胺盐酸盐/2nmolzns量子点的比例加入碳二亚胺盐酸盐，振荡混匀；

s14、再按50nmol抗体/lnmolzns量子点的比例加入浓度为5mg/ml的抗体混匀，室温搅拌反应1小时；

s15、当s14步骤反应结束后，用截留分子量为40kda-80kda的离心超滤管超滤浓缩至约60μl，然后采用凝胶色谱法进行纯化，收集有荧光的部分，再用离心超滤管浓缩至zns量子点浓度为1.1μmol/l，保存于55mm、ph为7.4-9.0的、含有质量百分比浓度为0.05％的nan3的绷酸盐缓冲液中，冷藏备用；具体的，制备完成后是在2-8℃冷藏备用。

s2、通过s1步骤制备的zns量子点标记抗体进行zns量子点标记抗体检测液的制备，并将制备的zns量子点标记抗体检测液冷藏；具体的是将上述zns量子点标记抗体液取出放置至室温，用pbs-t稀释550倍成zns量子点标记蛋白检测液，pbs—t为含80mm氯化钠、0.1％吐温、6mg/ml牛血清白蛋白、0.02％叠氮化钠的55mm磷酸盐缓冲液，2-8℃冷藏备用。

s3、制备包被有检测抗体的反应膜；在本发明中，是以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定粘贴在pvc背衬的中部，将抗体用包被缓冲液调节浓度至0.1-5mg/ml，并将二抗igg用包被缓冲液调节浓度至0.1-5mg/ml，按照0.8-1.2ul/cm的膜液量，将zns量子点标记抗体检测液以及二抗lgg喷到反应膜上对应的检测区和控制区上进行包被，进行烘箱处理后置于保藏箱备用；其中，检测区和控制区之间间隔为5mm，且之本完成后需要放置在25-37℃烘箱处理2小时，并置于恒温恒湿保藏箱里备用；

其中，本发明中所使用的包被缓冲液包括：70mm氯化钠nacl、0.05％—3％聚乙二醇peg20000、0.2％—1％泡藻糖、2mg/ml-lom/ml牛血清白蛋白bsa、0.02％叠氮化钠的55mm磷酸盐缓冲液；

s4、通过s3步骤制备的反应膜制备试纸板，并就将制备完成的试纸板与试纸卡组合；具体的在pvc背衬上顺序粘贴样品垫、反应膜以及吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成卡，将切割后的卡装载于试纸卡内，得zns量子点荧光免疫层析卡；本发明中，优选的样品垫为玻璃纤维垫，吸水垫为吸水纸；

当然，在本发明中还提供了测试的方法，即将zns量子点标记抗体检测液于待检样本混合后形成混合液，并将混合液提取后加入到试纸板上，进行反应后读取结果；

另外，在本发明中还配备一系列不同浓度的待检分子标准溶液，然后利用荧光定量分析仪分别进行免疫层析检测，通过对每个峰面积对应浓度做标准曲线，再将待检未知样品进行同样处理，得到峰面积，根据标准曲线公式得知样品中待测分子含量；

本发明中的检测指标为抗原，则检测液中的标记抗体和反应膜检测区的包被抗体，检测指标对应的单克隆抗体；检测抗体对应的还可以为基因工程重组抗原；

为更好的进行本发明技术方案的理解，特举例说明：

zns量子点标记抗体包被液的制备：采用的水溶性zns量子点为羧基水溶性核壳型量子点，zns量子点的发射波长范围是500nm-630nm，在激发光源辐射作用下能够发射不同波长的荧光，其荧光量子产率不低于65％。取浓度为8μm的羧基水溶性zns量子点250μl(2nmol)平衡至室温，并用超声波220w处理5秒，按照3μmol碳二亚胺盐酸盐/2nmolzns量子点的比例加入lomg/ml碳二亚胺盐酸盐(碳二亚胺盐酸盐)涡旋振荡混匀，再按照40nmol血管内皮生长因子单克隆抗体/2nmolzns量子点的比例加入lomg/ml抗体0.6ml，涡旋混匀；

zns量子点、碳二亚胺盐酸盐、蛋白等均用110mmph6.0-7.4磷酸盐溶液溶解，并在上述溶液体系中加入1.lml磷酸盐溶液；室温搅拌反应2小时；反应结束后用截留分子量为50kda的离心超滤管超滤除去没有反应的杂质并浓缩至20μl，通过装填有superdexg200填料的凝胶分离柱进行纯化，收集有荧光的组分，再用离心超滤管浓缩至zns量子点浓度为1μmol/l。然后用pbs—t(磷酸盐缓冲液pb、含氯化钠nacl、吐温tween—20、牛血清白蛋白bsa、叠氮化钠)稀释550倍，于2-8℃冰箱保存备用；

荧光免疫层析卡的组装：以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定粘贴在pvc背衬的中部，将与标记抗体中所用的血管内皮生长因子单克隆抗体和羊抗鼠igg抗体分别用包被缓冲调节浓度至lmg/ml和0.2mg/ml，用划膜仪包被到反应膜上对应的检测区和控制区，控制膜液量为1.0μl/cm，检测区和控制区之间间隔为3mm，放置25-37℃烘箱处理2小时。

在上述pvc背衬上按照顺序互相搭接粘贴样品垫(可为玻璃纤维垫)、反应膜(已粘贴)以及吸水垫(可为吸水纸)，得到试纸板，按照要求切割成3mm宽的卡，将卡装载于试纸卡内；

取400μlzns量子点标记蛋白检测液与30μl待检测样本充分混匀成zns量子点标记抗体与样品混合，取75μl混合物加入到试纸卡上的加样孔内，反应5min即可读取结果。

经过系列调试，血管内皮生长因子测限最低可达3.25pg/ml。

本实施例采用的双抗体夹心法可以用于血管内皮生长因子的测定，还适用于肿瘤标志物(afp、cea、ca199、psa)等采用双抗体夹心法模式的荧光免疫层析测定技术。

如图2所示，本发明还提出了一种利用荧光免疫层析卡制备方法制备的荧光免疫层析卡，包括：用于整体支撑的pvc板1；反应膜2设置在pvc板1上；吸水垫设置在反应膜2上；检测区4和控制区5，均设置在吸水垫上，并相邻设置，本发明中检测区4与控制区5间隔为3-7mm；优选为5mm。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。