一种测量出芽短梗霉发酵液中醇沉物干重的方法与流程

本发明属于微生物技术领域，具体提供一种测量出芽短梗霉发酵液中醇沉物干重的方法。

背景技术：

出芽短梗霉为半知菌类短梗霉属,又名“茁霉”、“芽生侧茁霉”、“出芽短梗霉”及“短梗霉”,是一种和酵母有密切联系的、具有酵母型和菌丝型形态的多形真菌。利用出芽短梗霉进行发酵能够得到聚苹果酸、抗菌素、酶、胞外多聚糖及单细胞蛋白等产物。聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物,特殊的立体结构使其具有生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等优良性质。其次,它作为一种水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、可化学衍生性。聚苹果酸的这些独特的性质,使其在医药、化妆品、环境治理以及香精香料等许多方面有着广阔的应用前景。生物法合成聚苹果酸和化学合成法相比,具有成本低、反应条件温和、分子量相对较高等优点,因此生物法合成聚苹果酸越来越吸引人们的注意，筛选具有聚苹果酸生产价值的出芽短梗霉菌株，在实际生产中具有重要意义。

出芽短梗霉发酵液中，除了聚苹果酸外的其他大分子副产物，对于发酵过程的控制，以及后续的分离纯化步骤也具有重要意义，比如含量最多的大分子副产物，普鲁兰多糖，由于其具有粘度大的特点，因此过多的普鲁兰多糖对于发酵过程中的传氧过程具有不利影响。因此，测量出芽短梗霉发酵液中的总大分子产物，对于菌种选育也具有重要意义。

现有技术中，测量出芽短梗霉大分子产物的常用方法为有机溶剂沉淀法。有机溶剂沉淀法基本原理：一是降低溶液的介电常数，使溶质分子间的静电引力增加从而沉淀；二是破坏溶质分子表面的水化层从而使溶质聚集沉淀。随着有机溶剂添加量的增加，溶质会按分子量由大到小析出。故采用分级醇沉的方法，可以将溶质按分子量的不同分离沉淀。有机溶剂沉淀法，常用的有机溶剂为甲醇，乙醇，丙酮，二甲基亚砜等，都属于易燃易爆品，而且除了乙醇外都多少存在毒性。沉淀所需的有机溶剂加样量通常为1-4倍样品体积，这意味着在样品较多时需要耗费更多的有机溶剂，增加了成本，且具有不小的安全，环保隐患。

红外光谱分析指的是利用红外光谱对物质分子进行的分析和鉴定。红外光谱是分子能选择性吸收某些波长的红外线,而引起分子中振动能级和转动能级的跃迁，检测红外线被吸收的情况可得到物质的红外吸收光谱。基频，指的使红外光谱中某一化学键或官能团的基础吸收频率，按量子的观点即物质中分子振动的能级由基态跃迁至第一激发态所吸收的红外光的频率。相应的，分子振动的能级也可以吸收更多的能量，直接由基态跃迁至第二激发态，第三激发态...第n激发态，其对应的更高频率的红外吸收峰，称之为二倍频，三倍频...n倍频，这些振动频率统称倍频。合频，则是由于两个不同的基频振动同时跃迁而产生的，其吸收频率往往等于单个基频频率之和。绝大多数的物质的基频吸收都在500-4000cm^-1的中红外区域。基频吸收的特点是吸收强度很大，频率较固定，导致了中红外光谱适合定性分析物质结构，以及进行微量物质的分析，但相应的缺点就是中红外光谱受杂质影响非常大，因为即使微量的杂质也会在光谱上产生强烈吸收从而严重影响结果，因此中红外光谱必须要加入溴化钾作为稀释剂减轻杂峰的干扰，而且不能测量含水的物质。因此，如何提高测量出芽短梗霉发酵液中醇沉物干重的方法的安全性和环保性，提高回收率，降低成本及减弱杂质峰的干扰，是本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明旨在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。因此，本发明提供一种测量出芽短梗霉发酵液中醇沉物干重的方法，所述方法为近红外光谱的方法，包括以下步骤：

1.种子培养基接种：pda培养基室温活化2-3h，从pda斜面培养基上划取出芽短梗霉菌体，接种于种子培养基中，置于500ml挡扳瓶中在摇床上200rpm，25℃培养40h。种子培养基成分为：蔗糖50-150g/l，酵母膏1-8g/l，丁二酸1-4g/l，硫酸铵1g/l，碳酸钾0.4g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸锌0.01-0.1g/l，玉米浆1ml/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

2.发酵培养基接种，摇瓶：将种子培养液按体积比10%接种于50ml液体发酵培养基中，放于500ml挡板瓶内，于摇床上200rpm,25℃培养1-6天。取样离心，收集发酵上清液。发酵培养基成分为：蔗糖100-200g/l，蛋白胨20-50g/l，磷酸二氢钾0.01-0.3g/l，硫酸镁0.1-0.5g/l，氯化钾0.2-0.8g/l，硫酸锰0.01-0.1g/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

3.建立校正样品集：将摇瓶1-6天收集的发酵上清液扫描近红外光谱，在扫描波长4000-10000cm^-1的波段中选取波段,每个样品扫描三次求平均值。同时向样品上清液中加入3倍体积的无水乙醇，离心收集沉淀烘干，称量干重，作为发酵液中菌体合成的大分子产物浓度。

4.建立定量模型：基于红外光谱学理论，在扫描波长4000-10000cm^-1

的波段中选取波段，利用偏最小二乘回归算法，联立样品光谱数据和样品发酵液中大分子产物的浓度，建立模型。使用交叉验证法检验模型的质量。

进一步的，所述偏最小二乘回归算法联立光谱信息与大分子浓度的计算步骤如下：

（1）令校正集光谱矩阵为x0,总产物大分子浓度矩阵为y0.其中x0的行数为样品数，列数为光谱的波长点数；y0的行数为样品数，列数为待测浓度组分数，这里列数为1，因为只测量一种浓度，总大分子产物。

（2）分别对样品的红外光谱数据矩阵x0，样品的聚苹果酸的浓度矩阵y0，进行中心化处理，对应得到矩阵x、矩阵y；

（3）计算对称矩阵x^tyy^tx最大的特征值所对应的特征向量，记为w1，计算对称矩阵y^txx^ty最大特征值所对应的特征向量，记为c1；其中，x^t为矩阵x的转置矩阵，y^t为矩阵y的转置矩阵；

计算自变量的主成分：t1=xw1；u1=yc1；且满足

（4）计算自变量回归系数：；

计算因变量回归系数：；

（5）计算残差矩阵e:e=x-t1(p1)^t；

残差矩阵f:f=y-t1(r1)^t；

然后分别将残差矩阵e作为新的x，残差矩阵f作为新的y，重复步骤（2）、（3）求得w2，t2，p2，r2，，…..wn，tn，pn，rn等一系列列向量，直到残差矩阵e，f满足精度要求为止；

（6）最终得到的测定模型如下：

x=t1(p1)^t+t2(p2)^t+t3(p3)^t+t4(p4)^t+…….tn(pn)^t+e；

y=t1(r1)^t+t2(r2)^t+t3(r3)^t+t4(r4)^t+…….tn(rn)^t+f；

写成矩阵的形式为：

x=tp^t+e；

y=tr^t+f=xwr^t+f；

其中的t为t1，t2……tn从左到右按列合并而得到的矩阵，p为p1，p2……pn从左到右按列合并得到的矩阵，r为r1，r2……rn从左到右按列合并得到的矩阵，w为步骤2中向量w1，w2……wn按列从左到右合并得到的矩阵，p^t，r^t分别为矩阵p，r的转置。由此即可得到。

5.验证模型：将步骤1、2所得的上清液选取波段，进行近红外光谱扫描，同时用3倍体积乙醇沉淀24-48小时，离心收集沉淀，烘干后测量发酵液中大分子干重。将光谱数据输入步骤4的定量模型中，将计算出的浓度与按照步骤5乙醇沉淀方法测量的浓度进行比对。

所述出芽短梗霉菌体选自具有保藏序列号cgmccno.3337的菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

所述建立定量模型扫描近红外光谱，选取波长5500-6300cm^-1或7100-7700cm^-1的波段，上述波段包含有醇沉物中的组分，包括胞外多糖，聚苹果酸，胞外蛋白质，以及色素分子中亚甲基和次甲基和羟基中的碳氢键，氧氢键的二倍频吸收峰。所述波段的选取是联合利用间隔法和移动窗口法原理，即适当选取光谱的部分波段带入偏最小二乘回归计算模型，利用交叉验证的方法，计算均方误差值rmsecv（rootmeansquareerrorofcrossvalidation）,其值最小，而且相对于别的波段明显小的波段，为特征波段，波段内包含有检测分子中的特征化学键的红外吸收峰。

本发明的有益效果是：

利用近红外光谱法测量出芽短梗霉发酵液中醇沉物干重，优点在于，由于合频与倍频的吸收强度很弱，因此杂质峰的干扰也大大减弱，这使得近红外测量可以避免对样品进行复杂的预处理，无毒无害，对测量的样品无损，可回收，成本低且可以对含水物质进行测量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：为实施例1-3中的发酵液中大分子物质测量值与模型预测值拟合效果图。

具体实施方式：

实施例1：

种子培养基接种：pda斜面室温活化2h后直接从pda斜面培养基上划取出芽短梗霉菌体，接种于种子培养基中，置于500ml挡扳瓶中在摇床上200rpm，25℃培养40h。种子培养基成分为：蔗糖50g/l，酵母膏1g/l，丁二酸1g/l，硫酸铵1g/l，碳酸钾0.4g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸锌0.01g/l，玉米浆1ml/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

发酵培养基接种，摇瓶：将种子培养液按体积比10%接种于14瓶50ml液体发酵培养基中，放于500ml挡板瓶内，于摇床上200rpm,25℃培养4天。取样离心，收集发酵上清液。发酵培养基成分为：蔗糖100g/l，蛋白胨20g/l，磷酸二氢钾0.01g/l，硫酸镁0.1g/l，氯化钾0.2g/l，硫酸锰0.01g/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

建立校正样品集：将摇瓶4天收集的发酵上清液扫描近红外光谱，扫描波段为波长5500-6300cm^-1或7100-7700cm^-1的波段,每个样品扫描三次求平均值。同时用醇沉法测量发酵液中的总大分子产物浓度。

将样品集近红外光谱数据带入定量模型中，计算得到总大分子预测浓度，与醇沉称重法测得的浓度比较，计算rmsep值和相关系数。经计算rmsep=6.250,r=0.988，其中rmsep=（∑(模型计算值-液相测量值)2）/n，n为验证集样品数；r为验证集模型计算值与液相测量值之间的相关系数。

实施例2

种子培养基接种：pda斜面室温活化3h后直接从pda斜面培养基上划取出芽短梗霉菌体，接种于种子培养基中，置于500ml挡扳瓶中在摇床上200rpm，25℃培养40h。种子培养基成分为：蔗糖150g/l，酵母膏8g/l，丁二酸4g/l，硫酸铵1g/l，碳酸钾0.4g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸锌0.1g/l，玉米浆1ml/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

发酵培养基接种，摇瓶：将种子培养液按体积比10%接种于14瓶50ml液体发酵培养基中，放于500ml挡板瓶内，于摇床上200rpm,25℃培养5天。取样离心，收集发酵上清液。发酵培养基成分为：蔗糖100-200g/l，蛋白胨50g/l，磷酸二氢钾0.3g/l，硫酸镁0.5g/l，氯化钾0.8g/l，硫酸锰0.1g/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

建立校正样品集：将摇瓶5天收集的发酵上清液扫描近红外光谱，扫描波段为波长5500-6300cm^-1或7100-7700cm^-1的波段,每个样品扫描三次求平均值。同时用醇沉法测量发酵液中的总大分子产物浓度。

将样品集近红外光谱数据带入定量模型中，计算得到总大分子预测浓度，与醇沉称重法测得的浓度比较，计算rmsep值和相关系数。经计算rmsep=6.99r=0.956，其中rmsep=（∑(模型计算值-液相测量值)2）/n，n为验证集样品数；r为验证集模型计算值与液相测量值之间的相关系数。

实施例3

种子培养基接种：pda斜面室温活化2.5h后直接从pda斜面培养基上划取出芽短梗霉菌体，接种于种子培养基中，置于500ml挡扳瓶中在摇床上200rpm，25℃培养40h。种子培养基成分为：蔗糖100g/l，酵母膏4g/l，丁二酸2g/l，硫酸铵1g/l，碳酸钾0.4g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸锌0.05g/l，玉米浆1ml/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

发酵培养基接种，摇瓶：将种子培养液按体积比10%接种于14瓶50ml液体发酵培养基中，放于500ml挡板瓶内，于摇床上200rpm,25℃培养6天。取样离心，收集发酵上清液。发酵培养基成分为：蔗糖150g/l，蛋白胨25g/l，磷酸二氢钾0.15g/l，硫酸镁0.25g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸锰0.05g/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

建立校正样品集：将摇瓶6天收集的发酵上清液扫描近红外光谱，扫描波段为波长5500-6300cm^-1或7100-7700cm^-1的波段,每个样品扫描三次求平均值。同时用醇沉法测量发酵液中的总大分子产物浓度。

将样品集近红外光谱数据带入定量模型中，计算得到总大分子预测浓度，与醇沉称重法测得的浓度比较，计算rmsep值和相关系数。经计算rmsep=6.489r=0.971,其中rmsep=（∑(模型计算值-液相测量值)2）/n，n为验证集样品数；r为验证集模型计算值与液相测量值之间的相关系数。

实施例4

将实施例1-3的发酵液中总大分子产物的各测量值和模型预测值进行拟合分析，结果可知，该模型对发酵液拟合效果较好，其测量值和模型预测值呈趋近于线性的关系，且在测量值较大时可以使相对误差控制在小于10%的范围内，见图1。

实施例5

种子培养基接种：pda斜面室温活化2.5h后直接从pda斜面培养基上划取出芽短梗霉菌体，接种于种子培养基中，置于500ml挡扳瓶中在摇床上200rpm，25℃培养40h。种子培养基成分为：蔗糖125g/l，酵母膏6g/l，丁二酸4g/l，硫酸铵1g/l，碳酸钾0.4g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸锌0.07g/l，玉米浆1ml/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

发酵培养基接种，摇瓶：将种子培养液按体积比10%接种于14瓶50ml液体发酵培养基中，放于500ml挡板瓶内，于摇床上200rpm,25℃培养4.5天。取样离心，收集发酵上清液。发酵培养基成分为：蔗糖175g/l，蛋白胨45g/l，磷酸二氢钾0.25g/l，硫酸镁0.45g/l，氯化钾0.6g/l，硫酸锰0.07g/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

建立校正样品集：将摇瓶4.5天收集的发酵上清液扫描近红外光谱，扫描波段为波长5500-6300cm^-1或7100-7700cm^-1的波段,每个样品扫描三次求平均值。同时用醇沉法测量发酵液中的总大分子产物浓度。

将样品集近红外光谱数据带入定量模型中，计算得到总大分子预测浓度，与醇沉称重法测得的浓度比较，计算rmsep值和相关系数。

实施例6

种子培养基接种：pda斜面室温活化3h后直接从pda斜面培养基上划取出芽短梗霉菌体，接种于种子培养基中，置于500ml挡扳瓶中在摇床上200rpm，25℃培养40h。种子培养基成分为：蔗糖75g/l，酵母膏3g/l，丁二酸3g/l，硫酸铵1g/l，碳酸钾0.4g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸锌0.03g/l，玉米浆1ml/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

发酵培养基接种，摇瓶：将种子培养液按体积比10%接种于14瓶50ml液体发酵培养基中，放于500ml挡板瓶内，于摇床上200rpm,25℃培养5.5天。取样离心，收集发酵上清液。发酵培养基成分为：蔗糖125g/l，蛋白胨35g/l，磷酸二氢钾0.15g/l，硫酸镁0.25g/l，氯化钾0.4g/l，硫酸锰0.03g/l，碳酸钙按质量体积比为2%。

建立校正样品集：将摇瓶5.5天收集的发酵上清液扫描近红外光谱，扫描波段为波长5500-6300cm^-1或7100-7700cm^-1的波段,每个样品扫描三次求平均值。同时用醇沉法测量发酵液中的总大分子产物浓度。

将样品集近红外光谱数据带入定量模型中，计算得到总大分子预测浓度，与醇沉称重法测得的浓度比较，计算rmsep值和相关系数。

以上对本发明所提供的一种测量出芽短梗霉发酵液中醇沉物干重的方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。