一种农药速测卡的制备和应用的制作方法

本发明涉及纳米材料、催化及分析化学领域，具体包括一种农药速测卡的制备和应用。

技术背景

随着农业技术的发展，农药得到了广泛的应用。而农药残留成为威胁人类食品安全的重要隐患，因此，农药的检测变的尤为重要，受到的让人们极大的关注。已有许多关于农药检测的文章，例如，jung等人在《m13bacteriophage/silvernanowiresurface-enhancedramanscatteringsensorforsensitiveandselectivepesticidedetection》利用m13噬菌体功能化的银纳米线通过拉曼来灵敏和选择性检测农药（acsappliedmaterials&interfaces2018,10,10388-10397）。pumera等人在《two-dimensional1t-phasetransitionmetaldichalcogenidesasnanocarrierstoenhanceandstabilizeenzymeactivityforelectrochemicalpesticidedetection》中利用二维的过渡金属硫化物作为纳米载体来增强酶的活性用于电化学检测农药（acsnano2017,11,5774-5784）。mukherjee等人在《acetylcholinesterase(ache)-mediatedimmobilizationofsilvernanoparticlesforthedetectionoforganophosphoruspesticides》一文中将乙酰胆碱酯酶固定到银纳米粒子上实现对有机磷农药的比色检测（rscadvances2016,6,64769-64777）。虽然，这些报道都实现了对农药的检测，但检测过程比较复杂，需要发展一种新的方法实现对农药的快速检测。

试纸条作为一种便携式的快速检测方法在生活中已有广泛的应用，如血糖试纸条、尿液分析试纸条等等。因此，许多文献也对试纸条做了一定的研究。yan等人在《nanozyme-stripforrapidlocaldiagnosisofebola》一文中将传统试纸条中的胶体金替换为磁性纳米酶，通过显色的方法检测埃博拉病毒，并且使试纸条的灵敏度提高了100倍（biosensorsandbioelectronics2015,74,134-141）。cai等人在《asimpleandrapidcolloidalgold-basedimmunochromatogarpicstriptestfordetectionoffmdvderotypea》一文中将免疫分析与试纸条相结合用来检测口蹄疫病毒（acsappliedmaterials&interfaces2014,6,21624-21631）。虽然试纸条已有一定程度的应用，但是现有的方法制作过程比较复杂且成本较高，并且上述试纸条作用机理与农药小分子检测的作用机理有本质区别。因此，需要发展一种新的方法实现简单、快速的制备和农药小分子检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种农药速测卡的制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种农药速测卡的制备，其特征在于所述农药速测卡的制备过程如下：

（1）将质量浓度为1%的牛血清蛋白（bsa）溶液滴在纤维素膜上，静置1小时并在室温下干燥；

（2）将质量浓度为2%的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）分别滴在步骤（1）中所述修饰有bsa的纤维素膜上，静置5小时，水洗并在室温下干燥；

（3）将复合催化材料的溶液均匀滴涂到步骤（2）中所得的纤维素膜上，4℃下过夜，水洗并干燥；

（4）将有机显色剂溶液滴涂到步骤（3）中所述修饰有复合催化材料的纤维素膜上，4℃下干燥，得到速测卡。

复合催化材料的制备过程，其特征在于该方法包括如下步骤：

（1）向含有bsa和二价钴离子的混合溶液中加入一定量的硼氢化钠，反应、离心、干燥得到co3o4nps；

（2）将一定量的四氧化三钴纳米球（co3o4nps）加入到0.2mm的氨基甲酸叔丁酯（boc）溶液中，静置2小时后水洗、干燥；

（3）将步骤（2）所得的co3o4nps加入到质量浓度为2%的edc和nhs混合溶液中，静置5小时，水洗、干燥；

（4）将步骤（3）所得的co3o4nps加入到乙酰胆碱酯酶（ache）和胆碱氧化酶（chox）加混合液中，4℃下过夜反应，水洗、干燥，制得复合催化材料。

一种农药速测卡的制备和应用，所述的复合催化材料可用于农药的检测。

优选是，所述农药速测卡由基底、复合催化材料和显色剂构成，复合催化材料是修饰有ache和chox的co3o4nps，复合催化材料与显色剂固定到基底上。

更优是，所述基底可以为硝酸纤维素膜、乙酸纤维素膜、聚酯纤维、玻璃纤维、无纺布等；所述有机显色剂为2,2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、多巴胺或苯酚。

进一步优选是，所述的一种农药速测卡的检测应用，其特征在于应用过程如下：

（1）取两个速测卡，一个在速测卡上加一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药溶液，另一个不加农药，放置5分钟，使有机磷或氨基甲酸酯类农药与复合催化材料充分作用；

（2）然后加一定量的乙酰胆碱于速测卡上，静置5分钟，使其与复合催化材料充分反应；

（3）观察速测卡的颜色变化以实现对有机磷或氨基甲酸酯类农药的定性检测，若与不加有机磷或氨基甲酸酯类农药的速测卡对比颜色变浅则说明体系中有有机磷或氨基甲酸酯类农药；

（4）用智能手机拍照，在拍照时可以在led灯照射下进行以防止照片模糊。通过使用手机的颜色识别软件读取照片中速测卡的具体的rgb值，由bn=b/(r+g+b)计算得到bn，代入bn-浓度工作曲线方程以计算农药的浓度，实现对有机磷或氨基甲酸酯类农药的定量检测。

更优是，所述的有机磷农药可以是对氧磷、对硫磷、二溴磷、二嗪农等有机磷农药；所述的氨基甲酸酯类农药可以是速灭威、西维因、涕灭威、克百威、叶蝉散和抗蚜威等氨基甲酸酯类农药。

本发明的效果是：

1.本发明利用具有仿过氧化物酶活性的四氧化三钴纳米球与乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的串联反应，构建快速检测有机磷农药的传感器。

2.本发明合成的复合催化材料及所制备试纸条实现了一锅法农药检测，避免了分步反应的进行。

3.本发明在实际的生活中有一定的实用价值，并且可扩展到食品发酵、生物医药、化工、环境、生物技术等领域的定量分析和催化剂等方面。

附图说明

图1为本发明实施例提供的速测卡的制备流程图。

图2为本发明实施例提供的速测卡的检测原理图。

图3为本发明实施例提供的速测卡检测的可行性。

图4为本发明实施例提供的复合催化材料的一锅法ph优化。

图5为本发明实施例提供的速测卡的定性检测照片。

图6为本发明实施例提供的农药定量测定的标准工作曲线。

具体实施方式

为了深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施例，但本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体实验条件或方法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。

实施例1

复合催化材料的制备过程，其特征在于该方法包括如下步骤：

（1）向含有bsa和二价钴离子的混合溶液中加入一定量的硼氢化钠，通过硼氢化钠的还原和氧气的氧化作用得到co3o4nps，离心、干燥得到固体；

（2）将一定量的co3o4nps加入到0.2mm的boc溶液以保护co3o4nps上的氨基，静置2小时后水洗、干燥；

（3）将步骤（2）所得的co3o4nps加入到质量浓度为2%的edc和nhs混合溶液中以活化co3o4nps上的羧基，静置5小时，水洗、干燥；

（4）将步骤（3）所得活化羧基后的co3o4nps加入到ache和chox加混合液中，ache和chox上的氨基会与co3o4nps上的羧基发生酰胺反应使其固定到co3o4nps上，4℃下过夜反应，水洗、干燥，制得复合催化材料。

实施例2

速测卡的制备流程（图1）：

（1）将质量浓度为1%的bsa溶液滴在纤维素膜上，静置1小时并在室温下干燥；

（2）将质量浓度为2%的edc和nhs分别滴在步骤（1）中所述修饰有bsa的纤维素膜（选用吸水性好的硝酸纤维素膜）上以活化bsa的羧基，静置5小时，水洗并在室温下干燥；

（3）将复合催化材料的溶液均匀滴涂到步骤（2）中所得的纤维素膜上，复合催化材料上的氨基会与bsa上的羧基发生酰胺反应使其固定到纤维素膜上，4℃下过夜，水洗并干燥；

（4）将有机显色剂溶液滴涂到步骤（3）中所述修饰有复合催化材料的纤维素膜上，4℃下干燥，得到速测卡。

速测卡的检测原理（图2）：

农药速测卡由基底、酶和显色剂构成，基底采用硝酸纤维素滤纸，将连接有ache和chox的co3o4nps与显色剂固定到基底上，其检测的基本原理为：当加入乙酰胆碱时，乙酰胆碱首先在ache的催化作用下生成胆碱，生成的胆碱继续与chox反应生成h2o2,之后具有仿过氧化物酶活性的co3o4nps会催化h2o2使abts变色，测速卡由无色变为绿色；有机磷或氨基甲酸酯类农药会抑制ache的活性，导致一系列的催化、氧化反应无法正常进行，速测卡的颜色变化较小或不变色，可以根据速测卡的变色情况实现农药的定量分析。

实施例3

速测卡检测的可行性：

催化反应体系（a）将比色卡剪碎放到乙酰胆碱（1mmol/l）溶液中（ph=5.0），反应5分钟后取反应液进行全波长扫描。另做一组对照实验（b）将比色卡剪碎放到缓冲溶液中（ph=5.0），反应5分钟后取反应液中进行全波长扫描。

如图3所示，催化反应体系（a）有明显的紫外吸收峰，催化反应体系（b）无紫外吸收峰，证明只有在乙酰胆碱存在的条件下催化反应才能进行。

实施例4

复合催化材料的一锅法ph优化：

催化反应体系包括复合催化材料（30μg/ml）、乙酰胆碱（1mmol/l）和不同ph的缓冲液（ph1.0−2.0，甘氨酸-盐酸缓冲液；ph3.0−6.0，醋酸-醋酸酸钠缓冲液；ph7.0−8.0，磷酸盐缓冲液；ph9.0，tris-盐酸缓冲液）。在室温（25°c）下反应5分钟后，测反应液在650nm处的吸光度。如图4（a）所示，最适ph为5.0左右。

另做一组对照实验，催化反应体系包括co3o4nps（30μg/ml）、ache（3.75μg/ml）、chox（1.25μg/ml）、乙酰胆碱（1mmol/l）和不同ph的缓冲液（ph1.0−2.0，甘氨酸-盐酸缓冲液；ph3.0−6.0，醋酸-醋酸酸钠缓冲液；ph7.0−8.0，磷酸盐缓冲液；ph9.0−10.0，tris-盐酸缓冲液）。在室温（25°c）下反应5分钟后，测反应液在650nm处的吸光度。如图4（b）所示，在ph为3.0−6.0左右都有较高活性，但其活性小于3（a）的活性。

实施例5

速测卡的定性检测：

（1）取三个速测卡，速测卡（a）不加农药，速测卡（b）加10ng/l有机磷或氨基甲酸酯类农药，速测卡（c）加100ng/l的有机磷或氨基甲酸酯类农药，放置5分钟，使有机磷或氨基甲酸酯类农药与复合催化材料充分作用；

（2）然后加1mmol/l的乙酰胆碱于速测卡上，静置5分钟，使其与复合催化材料充分反应；

（3）用智能手机拍照，在拍照时可以在led灯照射下进行以防止照片模糊。如图5所示，不加农药的速测卡（a）变绿，加较小浓度农药的速测卡（b）较速测卡（a）颜色变浅，加较大浓度农药速测卡（c）不变色，说明速测卡（c）上滴加的农药浓度最大，速测卡（b）次之，速测卡（a）没加农药，这再次证明了此农药速测卡检测农药的可行性，因此，此农药速测卡可以实现对农药的检测。

实施例6

农药定量测定的标准工作曲线：

（1）取八个速测卡，速测卡上滴加不同浓度的对硫磷农药（0-50ng/ml），放置5分钟，使有对硫磷农药与复合催化材料充分作用；

（2）然后加10μl10mm的乙酰胆碱于速测卡上，静置5分钟，使其与复合催化材料充分反应；

（3）用智能手机拍照，在拍照时可以在led灯照射下进行以防止照片模糊。通过使用手机的颜色识别软件读取照片中速测卡的具体的rgb值，由bn=b/(r+g+b)计算得到bn，得到标准曲线，具体工作曲线如图6所示，线性范围为0-20ng/l，方程为y=-0.0194x+0.7975（r²=0.9981）。