外泌体分析及癌症诊断方法与流程
本申请要求于2017年10月5日提交的美国临时专利申请系列第62/606687号的权益，该申请的公开内容通过全部引用的方式并入，包括任何数字、表格或附图。
背景技术：
外泌体被定位为癌症诊断的有效生物标志物。外泌体是通过多泡体(mvb)的质膜融合从细胞分泌的直径为30-150nm的非均匀膜状颗粒。从肿瘤组织脱落的外泌体携带许多生物标志物，例如跨膜蛋白和胞质蛋白(cd9，cd63，cd81等)，脂质，dna和微小rna。特殊蛋白质如glypican-1(gpc1)、纤连蛋白(fn)、前列腺特异性膜抗原(psma)和功能核酸如微小rna-145在早期癌症诊断中具有临床意义。此外，外泌体广泛存在于人体生物流体中，如血清、尿液、羊水、脑脊液、唾液，甚至眼泪；因此，为癌症诊断提供了非侵入性的独特特征。故外泌体在癌症的诊断、液体活检的监测和预后方面越来越受到重视。用于癌症外泌体分离、定量和表征的可靠的方法和工具对于推动该领域的发展至关重要。
用于分离外泌体的常规方法包括超速离心(uc)、过滤和密度梯度分离等。其中，uc被认为是外泌体分离的“黄金标准”。然而，这些传统的分离方法是基于机械的并且耗时的。同时，这些方法缺乏区分致瘤性和非致瘤性外泌体的特异性。
通常使用纳米颗粒跟踪分析(nta)，透射电子显微镜(tem)或流式细胞术来分析外泌体。nta提供囊泡数的粗略值，但要求样品处于高浓度水平(1×107-109颗粒/ml)。对于外泌体通常以低浓度水平存在的癌症早期诊断，nta不能提供用于监测癌症进展的生物标志物的准确测量。蛋白质印迹和elisa分析被认为是“黄金标准”方法，但仍然受到灵敏度差以及样品用量大的限制。流式细胞术可用于具有荧光标记的外泌体的高通量分选。然而，这种方法并不有效，因为外泌体经常与水珠结合，而流式细胞术的弱光散射可能造成数量损失。
电学方法包括电流体动力学系统和电化学生物传感器，尤其是基于适体的电化学传感器(适体传感器)已被用于检测外泌体。电流体动力学系统利用表面剪切力来减少非特异性吸附并提高特异性，但是检测限(lod)对于许多应用来说是不够的。适体传感器具有快速、灵敏、低功耗和连续监测等电化学检测方法的优点。然而，由于适体的二级结构不可预测，仍然难以获得合适的适体，并且尚未开发出有效的适体选择方法。最近，新技术如表面等离子体共振(spr)和拉曼散射，能够实时且无标记地读出靶外泌体。然而，从吞吐量和成本方面来看，这些方法对于临床应用仍然具有挑战性。
基于液滴或微孔的微流体已被证明是“微型化反应器”，其彻底改变了在传统吸管、烧杯、管道或烧瓶中进行的生物和化学分析。缩小液滴或微孔中的反应体积带来了各种独特的特征，例如高通量、最小试剂消耗、无污染、快速响应，小型化样品损失以及平行反应的分离。近十年来，随着微流体技术的飞速发展，液滴微流体技术已成为化学和生物学领域中分子检测、材料合成、分段反应或高通量筛选的多功能平台。
技术实现要素：
本发明提供了微流体技术用于外泌体的定量、分离和表征的应用。在某些实施方案中，a)通过使含有多个外泌体的样品与i)包含与第一结合剂结合的珠粒的捕获珠粒，和ii)包含可检测标记的第二结合剂接触来定量样品中的外泌体，其中第一结合剂特异性结合存在于多个外泌体中的第一生物分子，以产生包含捕获珠粒和第一外泌体的第一复合物，第二结合剂特异性结合存在于多个外泌体中的第二生物分子，以产生包含第二结合剂和第二外泌体的外泌体-第二结合剂复合物，或者包含捕获珠粒、第一外泌体和第二结合剂的第二复合物；b)从步骤a)结束时产生的组合物中分离捕获珠粒、第一复合物和第二复合物，c)从步骤b)结束时产生的组合物中，将每个捕获珠粒、第一复合物和第二复合物彼此分离，d)任意地，使分离的捕获珠粒、第一复合物和第二复合物与基质接触，所述基质从存在于第二复合物中的第二结合剂产生可检测信号，e)检测来自第二复合物的可检测信号，以量化样品中的外泌体。与捕获珠粒和第一复合物相比的第二复合物中珠粒的相对比例可用于定量样品中的外泌体。
第一结合剂和第二结合剂可以结合一种或多种癌症生物标志物。因此，本发明公开的方法可用于分离指示癌症的外泌体。相应的，本发明的某些实施方案提供了通过在从受试者获得的样品中定量含有癌症生物标志物的外泌体来诊断癌症的方法。
附图说明
图1为在珠粒上制备外泌体免疫复合物的示例性程序。
图2为使用基于液滴或微孔的方法对具有特定蛋白质的外泌体进行数字定量的示意图。
图3为使用液滴分选对具有特定生物标记物的所需外泌体进行分离的示意图。
图4为使用液滴融合和分选技术的单个外泌体测定平台的示意图。
图5a至5d为用于外泌体定量的液滴数字外显酶联免疫吸附试验(exoelisa)的示意图。(a)在磁珠上构建的单个外泌体免疫复合物。(b)将基质和珠粒共同包封在微滴中。(c)液滴数字exoelisa芯片。(d)用于具有靶外泌体的阳性液滴计数的荧光读数。
图6a至6c为外泌体的表征。(a)tem显示了直径约30-150nm具有双壁脂质膜层的外泌体。(b)通过nta分析的mda7mb-231外泌体的大小分布。该波段描绘了三个重复的实验。(c)通过蛋白质印迹分析在mda-mb-231外泌体和亲本细胞中表达cd63(外泌体标记物)和gpc-1(诊断标记物)。加载外泌体和细胞中等量的蛋白质(20μg)。
图7a至7h显示了液滴的产生。(a)将制备的珠粒和fdg基质共同包封成40μm直径的液滴，其在装置中以单层铺展用于检测。(b)液滴数字exoelisa校准结果显示捕获的外泌体的动态范围跨越5个数量级。虚线是背景加上标准偏差的3倍，指示lod(～10个外泌体/μl)。(c)没有靶外泌体的阴性对照。(d-h)通过连续稀释从mda-mb-231分离的外泌体样品的荧光读数梯度。nanosight用作外泌体数量浓度的基准测量。
图8a至8b显示了测定的特异性。测定的特异性。(a)蛋白质印迹分析显示在mda-mb-231细胞(阳性对照)和从mda-mb-231、hl-7702、raw264.7和hes细胞培养基中分离的外泌体中gpc-1的不同表达。每个泳道加载20μg蛋白质。(b)从mda-mb-231、hl-7702、raw264.7和hes细胞培养基分离的外泌体的液滴数字exoelisa的特异性。没有cd63ab的磁珠和没有外泌体的检测样品溶液的情况用作阴性对照。每个样品溶液每μl含有6.39×1048个外泌体颗粒。
图9a至9c显示了通过液滴数字exoelisa对gpc-1(+)外泌体的临床分析。(a)从5个健康样品(hs)、5个良性乳腺疾病(bbd)患者、12个乳腺癌患者(bc)的血清样品中定量gpc-1(+)外泌体。(b)散点图显示，与hs和bbd相比，bc患者的gpc-1(+)外泌体显著过表达(****，p<0.0001)。(c)2名患有乳腺癌(bc)和手术后乳腺癌(bc-as)的患者中gpc-1(+)外泌体的定量。误差棒代表三次独立实验的标准偏差。
图10a至10f显示了从mda-mb-231细胞培养基分离的外泌体中cd63和gpc-1的双色超分辨率图像。随机光学重建显微镜(storm)图像显示(a)用pkh67染色的外泌体膜；(b)用alexafluor647标记的cd63；(c)(a)和(b)的合并图像；(d)用pkh67染色的外泌体膜；(e)用alexafluor647标记的gpc-1；(f)(d)和(e)的合并图像。
图11a至11b为显示免疫磁性捕获的单个外泌体的tem图像。(a)使用pbs代替mda-mb-231外泌体溶液作为阴性对照。(b)在cd63抗体-结合的珠粒上捕获mda-mb-231外泌体。箭头指示单个外泌体。
图12a至12b显示在显微镜下以20x物镜捕获的明视场图像，显示磁珠被很好地分离成液滴。圆圈表示珠粒位于液滴中的区域。(a)当每个液滴的平均珠数设定为～0.1时，在视野中，所有液滴都含有0或1个珠粒。(b)当每个液滴的平均珠数设定为～0.3时，在视野中，只有1/85的液滴含有2个磁珠，5/85的液滴含有1个磁珠，其余的液滴是空的，这与泊松统计十分吻合。
图13显示了微滴中fdg催化反应的孵育时间的优化。f和f0分别是来自所有微滴和背景的信号的平均荧光强度。归一化信号在30分钟时达到最高值。误差棒是三次实验的标准偏差。
图14a至14c为代表性的nta图，其显示分别从(a)hl-7702、(b)raw264.7和(c)hes细胞培养基分离的外来体的大小分布。波段描绘了三个实验。
发明详述
本文所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，在说明书和/或权利要求中使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“有”、“与”或其变体的范围，这些术语旨在是以与“包括”一词类似的方式包含在内。过渡术语/短语(及其任何语法变体)“包括”、“包含”、“含有”，包括短语“基本上由......组成”、“基本上由......组成”，“基本上由......构成”和“由......组成”。
短语“基本上由......组成”或“基本上由......构成”表示该权利要求包含含有指定材料或步骤的实施方案以及不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的实施方案。
术语“约”意味着在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。在说明书和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意味着在特定值的可接受误差范围内。
在本文中，范围以简写形式陈述，以避免必须详细说明并描述该范围内的每个值。在适当的情况下，可以选择范围内的任何适当值作为范围的上限值，下限值或终点。例如，1-10的范围表示1和10的终值，以及2,3,4,5,6,7,8,9的中间值，以及1-10中包含的所有中间范围，例如2-5,2-8和7-10。此外，当本文使用范围时，意图明确包括范围的组合和子组合(例如，所公开范围内的子范围)和其中的具体实施方案。
本发明提供了用于外泌体的定量、分离和表征的微流体方法。所述微流体方法包括液滴或微孔微流体技术，例如区室化、分离和分选。对于所需外泌体的数字定量和分离，酶联免疫吸附测定可用于鉴定含有特定生物标记的外泌体。例如，通过特异性抗原-抗体结合，识别靶外泌体并将其固定在捕获珠上，形成酶联免疫复合物。将免疫复合物溶液分成足够数量的均匀分离的隔室(例如，微滴或微孔)，使得每个隔室含有一个或不含珠粒。必要时，将基质加入每个隔室中，以从珠粒产生颜色或荧光或可检测信号。对于那些含有珠粒的隔室，连接的酶触发隔室内的基质以产生吸光度或荧光或电化学信号(例如电流)，测量该信号以确定外泌体免疫复合物的存在和数量。由于珠粒制备和分配的随机性质，含有免疫复合物的珠粒的百分比和含有珠粒的分区的百分比都遵循泊松分布。基于分区的依赖泊松统计，靶外泌体可以量化到单个拷贝精度。在通过可检测信号识别靶外泌体后，可以使用液滴分选技术(例如，结合流式细胞术)或使用相机成像(用于基于微孔的方法)进一步分析分区(微滴或微孔)。可以回收靶外泌体用于进一步分析蛋白质，呈现在外泌体膜上或外泌体内的核酸。
相应的，本发明的某些实施方案提供了用于分离或定量样品中外泌体的方法，包括以下步骤：
a)使含有多个外泌体的样品与下列物质接触：
i)捕获珠粒，其包含与第一结合剂结合的珠粒，和
ii)包含可检测标记的第二结合剂，
其中第一结合剂特异性结合存在于多个外泌体中的第一生物分子，以产生包含捕获珠粒和第一外泌体的第一复合物，第二结合剂特异性结合存在于多个外泌体中的第二生物分子，以产生包含第二结合剂和第二外泌体的外泌体-第二结合剂复合物，或包含捕获珠粒、第一外泌体和第二结合剂的第二复合物；
b)从步骤a)结束时产生的组合物中分离捕获珠粒，第一复合物和第二复合物，
c)从步骤b)结束时产生的组合物中，将每个捕获珠粒、第一复合物和第二复合物彼此分离，
d)任意地，使分离的捕获珠粒、第一复合物和第二复合物与基质接触，并产生来自存在于第二复合物中的第二结合剂的可检测信号，
e)检测来自第二复合物的可检测信号。
在本文中使用上面列出的步骤a)至e)来指代本发明方法的具体步骤。此外，如上所列的步骤d)可以在步骤c)之前进行，但优选在步骤c)之后进行步骤d)。
本领域技术人员可以认识到，使样品与捕获珠粒和第二结合剂接触的步骤i)和ii)可以彼此同时或依次进行。例如，可以将样品、捕获珠粒和第二结合剂混合在一起。或者，可以首先混合样品和第二结合剂，随后添加捕获珠粒。此外，可以首先混合样品和捕获珠粒，随后添加第二结合剂。不管接触不同组分的顺序如何，该步骤通常导致形成以下混合物：捕获珠粒、第一复合物、第二复合物和外泌体-第二结合剂复合物。
如果捕获珠粒和第二结合剂彼此依次与样品接触，则可以在两个接触步骤之间进行洗涤步骤。例如，可以洗涤包含捕获珠粒、第一复合物、外泌体和样品的其他组分的混合物，以除去样品中未结合的外泌体和/或其他组分。这种洗涤将捕获珠粒和第一复合物分离，然后可以与包含可检测标记的第二结合剂接触。
使样品与捕获珠粒和/或第二结合剂接触的步骤在合适的条件下进行适当的时间以允许产生相应的结合复合物。通常，含有存在于样品中的合适生物分子的大部分外泌体，例如，存在于样品中的约90％以上的相关外泌体，与捕获珠粒和/或第二结合剂结合。本领域普通技术人员可以实现结合配偶体之间最大结合的适当条件。
用于本发明的珠粒的尺寸范围为约0.5微米至约20微米，优选约1至15微米，更优选约2至10微米，甚至更优选约3至6微米，最优选约4至5微米。珠粒通常由惰性材料制成，例如琼脂糖或惰性聚合物。珠粒也可以是超顺磁性的，即它们在磁场中表现出磁性，一旦从磁场中除去就没有剩磁。示例性超顺磁性材料包括铁氧体或磁铁矿(fe3o4)。适用于珠粒的另外的超顺磁性材料是本领域技术人员已知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
珠粒还可以具有覆盖有惰性材料(例如聚合物)的超顺磁性材料的核心。示例性聚合物包括聚苯乙烯。适用于生产捕获珠粒的其他材料是本领域技术人员已知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
珠粒与第一结合剂结合以产生捕获珠粒。第一结合剂特异性结合外泌体中存在的第一生物分子。
出于本发明的目的，短语“特异性结合”或其语法变体是指结合剂仅与其结合配偶体结合而与其他生物分子具有相对较小的非特异性亲和力的能力。特异性可以通过结合或竞争性结合测定来相对确定。特异性可以通过数学计算，例如，约10：1、约20：1、约50：1、约100：1、10,000：1或更高的亲和力/亲合力比值来计算，亲和力/亲合力比值是指与结合配偶体特异性结合相对于与其他不相关的生物分子非特异性结合的比值。例如，与抗原特异性结合的抗体的平衡解离常数(kd)低于约10-6m，低于约10-9m，或低于约10-12m，用于抗体和相应的抗原之间的结合。
另一方面，“非特异性结合”是指不基于结合剂与其结合配偶体之间的特异性相互作用的结合。非特异性结合可能是由非特异性相互作用引起的，例如范德瓦尔斯力。例如，抗体与非特异性抗原之间结合的kd通常高于约10-6m，高于约10-4m或高于约10-2m。
第一结合剂可以是抗体、抗体的抗原结合片段、适体、蛋白质结合配偶体，或存在于外泌体中的第一生物分子的核酸结合配偶体。在优选的实施方案中，第一结合剂结合存在于外泌体中的作为癌症生物标志物的第一生物分子。某些此类生物分子包括cd9、cd63、cd81、gpc1、fn、psma或微小rna-145。相应的，第一结合剂可以特异性结合cd9、cd63、cd81、gpc1、fn、psma或微小rna-145。作为存在于外泌体中的癌症生物标记的生物分子的其他实例是本领域已知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
第二结合剂特异性结合存在于外泌体中的第二生物分子。第一结合剂和第二结合剂可以结合相同的生物分子或不同的生物分子。如果第一结合剂和第二结合剂结合相同的生物分子，则优选它们结合相同生物标志物上的不同结合位点。通常，第二生物分子不同于第一生物分子。因此，第二结合剂特异性结合第二生物分子，第二生物分子不同于第一结合剂结合的第一生物分子。
出于本发明的目的，短语“存在于外泌体中的生物分子”表示生物分子可以存在于外泌体的表面上或外泌体的内腔中。优选地，生物分子存在于外泌体的表面上，以便为结合剂提供更容易接近生物分子的途径
第二结合剂可以是抗体、抗体的抗原结合片段、适体、蛋白质结合配偶体、或存在于外泌体中的第二生物分子的核酸结合配偶体。在优选的实施方案中，第二结合剂结合存在于外泌体中的作为癌症生物标志物的第二生物分子。某些此类生物分子包括cd9、cd63、cd81、gpc1、fn、psma或微小rna-145。相应的，在某些实施方案中，第二结合剂结合cd9、cd63、cd81、gpc1、fn、psma或微小rna-145。作为存在于外泌体中的癌症生物标记的生物分子的其他实例是本领域已知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。lietal.和nedaeiniaetal.的参考文献通过全部引用并入本文。
将捕获珠、第一复合物和第二复合物从步骤a)结束时产生的组合物中分离出来。在某些实施方案中，可以用合适的缓冲液洗涤珠粒以除去外泌体-第二结合剂复合物和可能来自样品和其他试剂的其他成分。
洗涤珠粒可以通过本领域已知并且适合于特定珠粒的方法进行。例如，可以在重复洗涤后将珠粒离心以将珠粒与其余组分分离。如果珠粒是磁性的或超顺磁性的，则可以使用磁场捕获珠粒，并且可以用适当的缓冲液洗掉其余成分。本领域普通技术人员可以设计合适的洗涤方法以将捕获珠粒、第一复合物和第二复合物与步骤a)结束时产生的组合物分离。
在步骤b)之后，将每个捕获珠粒、第一复合物和第二复合物彼此分离。因此，在步骤b)结束时产生的组合物被分成多个隔室，每个隔室不含珠粒、含有一个捕获珠粒、一个第一复合物或一个第二复合物。
某些实施方案中，使用液滴生成来进行分离捕获珠粒、第一复合物和第二复合物的步骤。在液滴生成中，将包含捕获珠粒、第一复合物、第二复合物的组合物(步骤b)结束时产生的组合物)分成液滴，其中每个液滴包封一个捕获珠粒、一个第一复合物或一个第二复合物。对于本文公开的按预期发挥作用方法，小于约5％，优选小于约4％，更优选小于约3％，甚至更优选小于约2％，最优选小于约1％的隔室含有两个或更多个珠粒。理想地，没有隔室包含两个或更多个珠粒。
在示例性实施方案中，使用两个不混溶的相来进行液滴生成；连续相(分成液滴的组合物)和分散相(形成液滴的相)。可以通过调节各种参数来控制液滴的尺寸，例如连续相和分散相的流速比，两相之间的界面张力，以及用于液滴生成的通道的几何形状。
液滴生成可以是主动的或被动的。在主动液滴生成中，提供外部能量输入，例如电、磁、离心能量，被提供于液滴操纵。被动液滴的生成可以使用某些微流体几何形状进行，即，交叉流动、流动聚焦和共流。
交叉流动涉及连续相和分散相以彼此成角度运行。通常，这些相垂直于彼此，即，在t形结中，分散相与连续相交叉。也可以执行其他配置，诸如y结。分散相延伸到连续相中并被拉伸直到剪切力破坏液滴。在t形结中，流速比和毛细管数控制液滴尺寸和形成速率。毛细管数取决于诸如连续相的粘度、连续相的表观速度和界面张力等方面。关于交叉流动液滴生成的其他细节是本领域普通技术人员所熟知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
流动聚焦涉及分散相流动并通常以一定角度交汇连续相(非平行流)。然后分散相经受约束，生成液滴。约束通常是窄通道，其通过对称剪切产生液滴。流速越慢，液滴尺寸越大，反之亦然。关于流动聚焦液滴生成的其他细节是本领域普通技术人员公知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
在共流动中，分散相通道封闭在连续相通道内，并且在分散相通道的末端，流体被拉伸直至其破裂以通过滴落或喷射形成液滴。当毛细作用力在系统中占优势时发生滴落，并且在通道端点处生成液滴，当连续相移动较慢时，通过加宽或拉伸发生喷射，从分散相通道开口产生流体。在加宽形式中，分散相比连续相移动更快，导致分散相减速，使液滴变宽并增加直径。在拉伸形式中，粘性阻力占主导地位，导致流体变窄，产生较小的液滴。液滴尺寸取决于相流速率和拉伸或加宽形式。关于共流动液滴生成的其他细节是本领域普通技术人员所熟知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
通常，在步骤b)结束时产生的组合物用作液滴相，并且提供连续相，例如，包含油或乳液。关于液滴生成步骤的具体细节取决于液滴的预期尺寸、测试的样品类型、外泌体中生物标记物的含量等，并且本领域普通技术人员可以根据需要确定这样的条件，这些实施方案在本发明的范围内。些这样的实施方案描述于下面的实施例1-4中。
如上所述，在步骤b)结束时产生的组合物被分成多个隔室，每个隔室不含珠粒、含有一个捕获珠粒、一个第一复合物或一个第二复合物。在某些实施方案中，使用微孔进行分离捕获珠粒、第一复合物和第二复合物的步骤。例如，可以将步骤b)结束时产生的组合物引入包含微孔的载体上。
“微孔”是指体积为1fl至1000nl的孔，优选50nl至900nl，更优选150nl至700nl，甚至更优选250nl至600nl，最优选地约500nl。芯片上的微孔的大小使得仅一个捕获珠粒、仅一个第一复合物或仅一个第二复合物可以适合于一个微孔。因此，可以根据捕获珠粒的大小来选择微孔的大小。
包含微孔的载体的一个实例是与硅网格结合的玻璃衬底，其形成微孔。包含微孔的载体也可以由聚(二甲基硅氧烷)聚合物或塑料制成。适用于制备包含微孔的载体的其他材料是本领域技术人员已知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
一旦捕获珠粒、第一复合物和第二复合物彼此分离，第二复合物的数目和/或数量可以基于第二结合剂提供的可检测信号来确定。
在本发明的方法中，一个捕获珠粒可含有数千个能够捕获外泌体的第一结合剂分子。通过控制珠粒与外泌体的比例，可以确保一个捕获珠粒与不超过一个外泌体结合。然后每个外泌体可以与第二结合剂的一个或多个分子结合。例如，一个捕获珠粒可以与一个外泌体结合，并且每个外泌体可以与第二结合剂的几个分子结合。由此，第二结合剂的更多分子将产生相对更强的信号。因此，可以基于捕获珠粒的数量和每个捕获珠粒产生的信号的强度来进行样品中外泌体的定量。
如上所述，第二结合剂含有可检测的标记。因此，可以基于可检测信号的存在或不存在将第二复合物与捕获珠粒和第一复合物区分开。
可检测标记可以产生具有或不具有基质的可检测信号。例如，如果可检测标记是荧光、放射性或化学发光分子，则第二结合剂可以产生没有基质的可检测信号。另一方面，如果可检测标记是作用于基质以产生可检测信号的酶，则提供基质以产生可检测信号，然后检测该可检测信号以检测第二复合物。
适用于本文公开的方法的可检测标记包括但不限于荧光部分、化学发光和生物发光试剂、酶和放射性同位素。荧光部分包括但不限于荧光素、异硫氰酸荧光素、级联蓝、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯、德克萨斯红、俄勒冈绿、花青(例如cy2、cy3和cy5)、伞形酮、别藻蓝蛋白或藻红蛋白。发光材料的实例包括鲁米诺。生物发光材料的实例包括但不限于荧光素、绿色荧光蛋白(gfp)、增强型gfp和水母发光蛋白。适用的酶包括但不限于荧光素酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和碱性磷酸酶。
当可检测标记是酶时，向酶提供合适的基质以产生可检测信号。例如，如果可检测标记是过氧化物酶，则基质可以是过氧化氢(h2o2)和3-3'二氨基联苯胺或4-氯-1-萘酚。适用于其他酶的其他基质是本领域熟知的。
适用的同位素包括但不限于125i、14c、35s和3h。
如果第二结合剂需要基质以产生可检测信号，则将分离的含有第一结合剂、第一复合物和第二复合物的捕获珠粒与基质接触，从而产生来自第二结合剂的可检测信号。使基质与分离的珠粒接触的步骤可以以各种方式进行，这取决于用于分离珠粒的方法。
例如，如果使用包含微孔的载体来分离珠粒，则将基质引入微孔中并在适当的条件下孵育适当的时间段以产生可检测的信号。可以以合适的组合物的形式引入基质，例如缓冲剂。根据用作可检测标记的酶的类型，可以在检测信号之前洗掉过量的基质。
如果进行液滴生成以分离珠粒，则可以将基质掺入连续相或液滴相中。(图4.)
如果第二结合剂不需要基质产生可检测信号，则测试分离的捕获珠粒、第一复合物和第二复合物的可检测信号以鉴定和定量第二复合物。检测信号的步骤取决于要检测的信号的类型。例如，如果可检测信号是荧光发射，则可以使用荧光照相机。检测特定检测信号的其他方法在本领域中是公知的，并且可以由本领域普通技术人员容易地识别。这些实施方案在本发明的范围内。
检测来自第二复合物的信号可用于将第二复合物与含有第一结合剂和第一复合物的捕获珠粒区分开。取决于用于分离珠粒的方法，可以以各种方式进行这种检测。
例如，如果使用包含微孔的载体来分离珠粒，则可以使用照相机对微孔进行成像并鉴定含有捕获珠例和第一复合物以及第二复合物的微孔的数量。如果使用液滴生成来分离珠粒，则可以进行流式细胞术以鉴定含有捕获珠粒和第一复合物以及第二复合物的液滴的数量。
与捕获珠粒和第一复合物相比的第二复合物的相对数量，以及来自每个第二复合物的可检测信号的强度可用于定量第二复合物，从而定量样品中的外泌体。标准曲线可以与含有已知量的外泌体的对照样品一起使用，以进一步促进样品中外泌体的定量。本领域技术人员可以为这种定量设计合适的标准曲线，并且这些实施方案在本发明的范围内。
外泌体可用作癌症诊断的生物标志物。外泌体从肿瘤组织中脱落并携带许多癌症生物标志物，例如跨膜蛋白和胞质蛋白(cd9、cd63、cd81等)、脂质、dna和微小rna。特殊蛋白质如gpc1、fn、psma和功能性核酸如微小rna-145可用于早期癌症诊断。此外，外泌体广泛存在于人体生物流体中，如血清、尿液、羊水、脑脊液、唾液、甚至眼泪；故为癌症诊断提供了非侵入性的独特特征。因此，根据本文描述的方法检测和定量外泌体可用于癌症诊断、监测和预后。
相应的，本发明的某些实施方案提供了检测受试者中癌症的方法，该方法包括：
(i)在以下样品中确定含有一种或多种癌症生物标志物的外泌体水平：
i)从受试者获得的测试样品，
ii)任意地，对照样品；
(ii)任意地获得对应于含有一种或多种癌症生物标志物的外泌体水平的参考值，
(iii)将受试者确定为：
i)基于测试样品中含有一种或多种癌症生物标志物的外泌体水平与对照样品中的水平或参考值相比，具有癌症，或
ii)基于测试样品中含有一种或多种癌症生物标志物的外泌体水平与对照样品中的水平或参考值相比，不具有癌症。
如果受试者被鉴定为患有癌症，则该方法可以进一步包括向受试者施行治疗方法以治疗和/或管理癌症。如果受试者被鉴定为没有患癌症，则该方法可以进一步包括停止对受试者的治疗方法以治疗和/或管理癌症。
癌症治疗方法可选自放射疗法、化疗、手术、免疫疗法，如单克隆抗体疗法(例如，贝伐单抗或西妥昔单抗)，或其任何组合。施行于受试者的疗法取决于癌症的类型、受试者的年龄、癌症的阶段和其他此类个体化参数。
在优选的实施方案中，上述公开的用于定量样品中外泌体的方法用于测定从受试者和任意的对照样品获得的测试样品中含有一种或多种癌症生物标志物的外泌体的水平。因此，本发明的某些实施方案提供了用于确定样品中含有一种或多种癌症生物标志物的外泌体水平的方法，包括以下步骤：
a)将样品与以下物质接触：
i)捕获珠粒，其包含与第一结合剂结合的珠粒，和
ii)包含可检测标记的第二结合剂，
其中第一结合剂特异性结合存在于外泌体中的第一癌症生物标志物，以产生包含捕获珠粒和第一外泌体的第一复合物，第二结合剂特异性结合存在于外泌体中的第二癌症生物标志物，以产生包含第二结合剂和第二外泌体的外泌体-第二结合剂复合物，或包含捕获珠粒、第一外泌体和第二结合剂的第二复合物；
b)从步骤a)结束时产生的组合物中分离捕获珠粒，第一复合物和第二复合物，
c)从步骤b)结束时产生的组合物中，将每个捕获珠粒、第一复合物和第二复合物彼此分离，
d)任意地，使分离的捕获珠粒、第一复合物和第二复合物与基质接触，并产生来自存在于第二复合物中的第二结合剂的可检测信号，
e)检测来自第二复合物的可检测信号以量化样品中的外泌体。
第一结合剂和第二结合剂可以彼此独立地是抗体、抗体的抗原结合片段、适体、蛋白质结合配偶体，或存在于外泌体中的第一癌症生物标志物的核酸结合配偶体。某些此类癌症生物标志物包括cd9、cd63、cd81、gpc1、fn、psma或微小rna-145。相应的，在某些实施方案中，第一结合剂结合cd9、cd63、cd81、gpc1、fn、psma或微小rna-145。存在于外泌体中的癌症生物标志物的其他实例是本领域已知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
第一结合剂和第二结合剂可以结合相同的癌症生物标志物或不同的癌症生物标志物。如果第一结合剂和第二结合剂结合相同的癌症生物标志物，则优选它们结合相同癌症生物标志物上的不同结合位点。
上述讨论的用于定量样品中外泌体的方法的细节也适用于本文所述的癌症诊断方法。例如，上述讨论的特异性结合剂、珠粒、可检测标记、基质、用于分离珠粒的方法、用于检测可检测信号的方法、用于定量第二复合物的方法等，也适用于癌症诊断方法，并且这些实施方案在本发明的范围内。
为了实施本文所述的用于鉴定受试者患有癌症的方法，可以从以下一种或多种方式中获得对照样品：
a)与受试者属于同一物种且未患癌症的个体，
b)属于与受试者相同物种并且已知具有低风险或无发展癌症风险的个体，或
c)在患癌症之前的受试者。
对照样品的其他实例是本领域普通技术人员公知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
在某些实施方案中，对照样品和测试样品获自相同类型的器官或组织。可用作样品的器官或组织的非限制性实例是胎盘、脑、眼、松果体、脑下垂体、甲状腺、甲状旁腺、胸腔、心脏、肺、食道、胸腺、胸膜、肾上腺、阑尾、胆囊、膀胱、大肠、小肠、肾脏、肝脏、胰腺、脾脏、气孔、卵巢、子宫、睾丸、皮肤、血液或血液的血沉棕黄层样本。器官和组织的其他实例是本领域普通技术人员所熟知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
在某些其他实施方案中，对照样品和测试样品获自相同类型的体液。可用作样品的体液的非限制性实例包括羊水、房水、玻璃体液、胆汁、血液、脑脊液、乳糜、内淋巴、外淋巴、女性射精、淋巴、粘液(包括鼻腔引流和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、大黄、唾液、痰液、滑液、阴道分泌物、精液、血液、血清或血浆。体液的其他实例是本领域普通技术人员所熟知的，并且这些实施方案在本发明的范围内。
本文所描述的方法可用于鉴定受试者患有癌症。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人、猿、犬、猪、牛、啮齿动物或猫科动物。
诊断癌症的方法可用于诊断癌症类型，所述癌症包括但不限于：棘皮瘤，腺泡细胞癌，听神经瘤，肢端黑色素瘤，肢端螺旋体，急性嗜酸性粒细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，急性巨核细胞白血病，急性单核细胞白血病，成熟急性髓细胞白血病，急性髓系树突状细胞白血病，急性髓细胞白血病，急性早幼粒细胞白血病，釉质瘤，腺癌，腺样囊性癌，腺瘤，腺瘤样牙源性肿瘤，肾上腺皮质癌，成人t细胞白血病，侵袭性nk细胞白血病，艾滋病相关癌症，艾滋病相关淋巴瘤，肺泡软组织肉瘤，成釉细胞瘤，肛门癌，间变性大细胞淋巴瘤，甲状腺未分化癌，血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤，血管平滑肌脂肪瘤，血管肉瘤，附件癌，星形细胞瘤，非典型畸胎瘤横纹肌瘤，基底细胞癌，基底样癌，b细胞白血病，b细胞淋巴瘤，贝里尼导管癌，胆道癌，膀胱癌，胚母细胞瘤，骨癌，骨肿瘤，脑干瘤，脑肿瘤，乳腺癌，布伦纳瘤，支气管肿瘤，细支气管肺泡癌，棕色肿瘤，伯基特淋巴瘤，原发部位不明癌，类癌肿瘤，癌，原位癌，阴茎癌，未知原发部位癌，癌肉瘤，卡斯尔门病，中枢神经系统胚胎肿瘤，小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤，宫颈癌，胆管癌，软骨瘤，软骨肉瘤，脊索瘤，绒毛膜癌，脉络丛乳头状瘤，慢性淋巴细胞白血病，慢性单核细胞白血病，慢性粒细胞白血病，慢性骨髓增生性疾病，慢性中性粒细胞白血病，透明细胞瘤，结肠癌，结肠直肠癌，颅咽管瘤，皮肤t细胞淋巴瘤，德戈斯病，皮肤纤维肉瘤，皮样囊肿，增生性小圆细胞瘤，弥漫性大b细胞淋巴瘤，胚胎发育不良性神经上皮肿瘤，胚胎癌，内胚窦瘤，子宫内膜癌，子宫内膜癌，子宫内膜样肿瘤，肠病相关t细胞淋巴瘤，室管膜母细胞瘤，室管膜瘤，上皮样肉瘤，红白血病，食道癌，雌激素母细胞瘤，尤文氏肿瘤家族，尤文氏家族肉瘤，尤文氏肉瘤，颅外生殖细胞肿瘤，外生殖细胞肿瘤，肝外胆管癌，乳腺外派杰氏病，输卵管癌，胎中胎，纤维瘤，纤维肉瘤，滤泡性淋巴瘤，滤泡性甲状腺癌，胆囊癌，胆囊癌，神经胶质瘤，神经节细胞瘤，胃癌，胃淋巴瘤，胃肠道癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤，胃肠道间质瘤，生殖细胞肿瘤，生殖细胞瘤，妊娠绒毛膜癌，妊娠滋养细胞肿瘤，骨巨细胞瘤，多形性胶质母细胞瘤，胶质瘤，脑胶质瘤病，血管球瘤，胰高血糖素瘤，性腺母细胞瘤，颗粒细胞瘤，毛细胞白血病，毛细胞白血病，头颈癌，心脏癌，血管母细胞瘤，血管外皮细胞瘤，血管肉瘤，血液系统恶性肿瘤，肝细胞癌，肝脾t细胞淋巴瘤，遗传性乳腺癌，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑神经胶质瘤，炎性乳腺癌，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌，胰岛细胞瘤，青少年髓单核细胞白血病，肉瘤，卡波西肉瘤，肾癌，克拉茨金瘤，克鲁肯贝格瘤，喉癌，恶性黑色素瘤，白血病，白血病，唇和口腔癌，脂肪肉瘤，肺癌，黄体瘤，淋巴管瘤，淋巴管肉瘤，淋巴上皮瘤，淋巴细胞白血病，淋巴瘤，巨球蛋白血症，恶性纤维组织细胞瘤，骨恶性纤维组织细胞瘤，恶性胶质瘤，恶性间皮瘤，恶性外周神经鞘瘤，恶性横纹肌样瘤，恶性氚核瘤，malt淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，肥大细胞白血病，纵隔生殖细胞瘤，纵隔肿瘤，甲状腺髓样癌，成神经管细胞瘤，髓母细胞瘤，黑色素瘤，黑色素瘤，脑膜瘤，默克尔细胞癌，间皮瘤，隐匿性鳞状颈癌，隐匿性原发性，转移性尿路上皮癌，混合性苗勒氏肿瘤，单核细胞白血病，口腔癌，粘液瘤，多发性内分泌肿瘤综合征，多发性骨髓瘤，蕈样真菌病，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常综合征，骨髓性白血病，骨髓瘤，骨髓增生性疾病，粘液瘤，鼻腔癌，鼻咽癌，鼻咽癌，肿瘤，神经鞘瘤，神经母细胞瘤，神经母细胞瘤，神经纤维瘤，神经瘤，结节性黑色素瘤，非霍奇金淋巴瘤，非黑色素瘤皮肤癌，非小细胞肺癌，眼肿瘤学，寡淋巴细胞瘤，少突神经胶质瘤，嗜酸细胞瘤，视神经鞘膜脑膜瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，骨肉瘤，卵巢癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低恶性潜在肿瘤，乳腺佩吉特病，肺上沟瘤，胰腺癌，乳头状甲状腺癌，乳头状瘤病，副神经节瘤，鼻窦癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，血管周围上皮样细胞瘤，咽癌，嗜铬细胞瘤，中间分化的松果体实质肿瘤，松果体母细胞瘤，垂体细胞瘤，垂体腺瘤，垂体瘤，浆细胞肿瘤，胸膜肺母细胞瘤，多胚胎瘤，前体t淋巴母细胞淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，原发性积液淋巴瘤，原发性肝细胞癌，原发性肝癌，原发性腹膜癌，原始神经外胚层肿瘤，前列腺癌，腹膜假性粘液瘤，直肠癌，肾细胞癌，15号染色体上涉及nut基因的呼吸道癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌瘤，横纹肌肉瘤，里氏病变，骶尾部畸胎瘤，唾液腺癌，肉瘤，神经鞘瘤病，皮脂腺癌，继发性肿瘤，精原细胞瘤，浆液性肿瘤，支持细胞间质细胞瘤，性索间质瘤，塞萨里综合征，印戒细胞癌，皮肤癌，小蓝圆细胞肿瘤，小细胞癌，小细胞肺癌，小细胞淋巴瘤，小肠癌，软组织肉瘤，生长抑素瘤，烟尘疣，脊髓肿瘤，脊柱肿瘤，脾边缘区淋巴瘤，鳞状细胞癌，胃癌，浅表性扩散黑素瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，表面上皮-间质瘤，滑膜肉瘤，t细胞急性淋巴细胞白血病，t细胞大颗粒淋巴细胞白血病，t-细胞白血病，t细胞淋巴瘤，t细胞淋巴细胞白血病，畸胎瘤，晚期淋巴癌，睾丸癌，卵泡膜细胞瘤，喉癌，胸腺癌，胸腺瘤，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，移行细胞癌，脐尿管癌，尿道癌，泌尿生殖系肿瘤，子宫肉瘤，葡萄膜黑色素瘤，阴道癌，弗纳-莫里森综合征，疣状癌，视觉通路胶质瘤，外阴癌，瓦尔登斯特罗氏巨球蛋白血症，沃辛氏肿瘤，肾母细胞瘤，或其任何组合。在优选的实施方案中，根据本发明的诊断癌症的方法可用于诊断，脑肿瘤、乳腺癌、胃肠癌、结肠直肠癌、肺癌或前列腺癌。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物均以引用的方式整体并入本文，包括所有附图和表格，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾。
以下是说明实施本发明方法的实施例。这些实施例不应被解释为限制。除非另有说明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例均以体积计。
实施例1-在珠粒上构建外泌体免疫复合物
数字酶联免疫吸附测定在各种微流体平台中得到了证明。外泌体溶液从生物流体获得，并通过超速离心、超滤、密度梯度分离和免疫亲和捕获方法制备。由于抗原存在于外泌体的表面，因此它们可被特异性抗体识别。鉴定外泌体的一对抗体以免疫复合物的形式构建在珠粒上。免疫复合物在珠粒上的构建如图1所示。可以识别外泌体表面上的生物标记物(例如cd63)的抗体与珠粒(例如，dynabeadstm或琼脂糖珠)结合。然后将珠粒与外泌体溶液一起孵育。孵育后，通过磁力或离心收集珠粒。彻底洗涤后，结合在珠粒上的靶外泌体从样品溶液中纯化。接着，使用能够识别外泌体上相同(例如cd63)或不同生物标记物(例如gpc-1)的第二抗体来检测外泌体。检测抗体通常与能够识别酶(例如，链霉抗生物素蛋白结合的β-半乳糖苷酶)的标签(例如，生物素)结合。本文公开的用于外泌体定量和分离的方法不限于特定的生物标志物。已经在外泌体膜上发现的具有相应抗原-抗体对的不同外泌体生物标志物是适用的。
实施例2-靶外泌体的数字化定量
通过特异性蛋白质生物标志物对与靶外泌体结合的免疫复合物珠粒进行数字化定量。将免疫复合物构建的珠粒溶液流入通道中以将溶液与另一通道的基质(例如fdg)流混合并形成混合物的液滴。除了使用液滴作为隔室，也可以利用在扁平芯片上制造的微孔来划分样品溶液。首先可以将具有珠粒的样品滴在芯片上并刮入孔中。随后将基质(例如fdg)溶液加入每个隔室中。然后将微孔芯片在顶部密封以隔离每个单独的空间用于反应。微流体工作流程如图2所示。孵育后，具有构建的免疫复合物的珠粒的液滴/孔发出颜色或荧光或电化学信号用于检测。可以通过荧光显微镜或电化学传感器阵列检测信号。通过计数阳性和阴性液滴/孔数，可以根据两个相关的泊松方程计算靶外泌体的数量：
其中n是捕获分子的绝对数量，nb是珠粒的总数，vs是总测试样品体积，vd是液滴/孔体积，p是阳性液滴/孔与总液滴/孔数量的比率。
实施例3-外泌体分离
通过在珠粒上构建免疫复合物并将它们包封成液滴，来自标记的荧光素或化学发光的信号可以用作液滴分选的触发器。含有靶外泌体的液滴可以通过液滴分选技术分离，所述液滴分选技术包括电分选、机械分选或声学分选。图3为具有所需信息的荧光外泌体的分离示意图。
实施例4-外泌体表征
由于从肿瘤组织脱落的外泌体携带许多生物标记物(例如蛋白质、dna或微小rna等)以单独表征和分析每个外泌体的内容，因此液滴微流体可用于高通量测定。图3为通过液滴融合、分选或其他液滴操作技术表征外泌体的示意图。通过将外泌体稀释和包封成足够数量的液滴，可以在单个外泌体水平上进行外泌体测定。通过将试剂添加到具有外泌体的液滴中，可以研究包含在单个外泌体中的信息。加入到液滴中的试剂可以是外泌体裂解缓冲液、pcr混合物、rt混合物等。
实施例5-用于癌症诊断的单一外泌体计数免疫测定
肿瘤细胞脱落的外泌体由于其独特的组成和功能而被认为是癌症诊断的有前景的生物标志物。存在于极少量临床样品中的低浓度特异性外泌体的定量可用于非侵入性性癌症诊断和预后。本发明提供了一种使用液滴微流体对靶外泌体进行数字化定量的免疫吸附测定法。外泌体通过夹心elisa复合物固定在磁性微球上，所述夹心elisa复合物上标记有产生荧光信号的酶报告物。将构建的珠粒进一步分离并包封成足够数量的液滴，以确保仅单个珠粒包封在液滴中。基于液滴的单外泌体计数酶联免疫测定(液滴数字exoelisa)方法能够对癌症特异性外泌体进行绝对计数，从而实现前所未有的准确性。检测限(lod)达到每微升10个酶标记的外泌体复合物(～10-17m)。证明了液滴数字exoelisa平台在直接来自乳腺癌患者的血浆样品中外泌体的定量检测中的应用。使用本文公开的方法可以实现癌症的早期诊断和用于临床诊断的癌症外泌体生物标志物的加速发现。
有证据表明，从肿瘤组织中脱落的外泌体分子物质可被鉴定为潜在的非侵入性癌症诊断生物标志物，因为它反映了母体肿瘤的遗传或信号传导改变。例如，通过免疫印迹分析，发现外泌体膜蛋白磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(gpc-1)在癌性外泌体上的表达比非癌症高得多，揭示了其作为外泌体生物标志物在早期诊断胰腺、乳腺和结直肠癌中的临床价值。
由有核细胞分泌的外泌体广泛存在于人体生物体液中，并且存在各种外泌体亚群。最近，发现肿瘤来源的外泌体亚群对于临床诊断是有价值的。准确地量化和分类来自生物流体的肿瘤衍生外泌体对于癌症诊断、预后和监测治疗的响应具有潜在意义。诸如纳米颗粒跟踪分析(nta)、蛋白质印迹、elisa和流式细胞术的常规方法已经在外泌体定量测量的研究实验室中广泛采用。然而，nta仅在高浓度水平(1×107-109个颗粒/ml)提供外泌体的估计数量，并且缺乏特异性。蛋白质印迹、elisa和流式细胞术都需要大量的样品输入并且灵敏度有限。不幸的是，在癌症的早期阶段，使用这些传统的定量方法很难检测出外周血液循环中有限的肿瘤来源的外泌体。研究人员已经做出许多努力来提高检测方法的灵敏度，包括微型微流体平台、基于适体的电化学传感器、表面等离子体共振(spr)和拉曼散射。然而，这些检测方法在批量溶液中进行，这几乎不能实现绝对量化或分类。由于液体活检早期存在的癌症生物标志物浓度范围在10-12至10-16m，为了定量这种低丰度标记物，检测所需的灵敏度需要达到单分子水平。最近，基于光子计数技术的单细胞外囊泡分析(sea)已经应用于使用elisa的单个细胞外囊泡的多重分析。由于单个囊泡的低信噪比，需要仔细的缓冲液洗涤和复杂的成像过程来区分它们与蛋白质复合物或其他簇，并且检测极限仍然非常高(例如，具有102个计数的强度截止值)。然而，由于吞吐量和成本，这些方法对于广泛采用仍然是不切实际的。高灵敏度和特异性的外泌体定量的可靠平台仍然缺乏。
近年来，数字pcr和数字elisa平台彻底改变了核酸和蛋白质绝对定量的检测技术。与传统的在吸管、烧杯、管道或烧瓶中大量进行的生物和化学分析相比，分子数字化定量的基本原理是将样品均匀分成大量小隔室(在微孔或在液滴中)。通过这样做，单个分子被限制在小体积中，其中信号可以被放大和浓缩以用于检测。分区技术确保每个隔室中的分子分离以遵循泊松分布，这是数字化定量成功的核心。液滴微流体在高通量(以khz为单位)下以微微升至纳升尺度产生均匀液滴，使得许多单分子分析能够并行进行。近年来，用于形成和操纵单分散液滴的基于液滴的平台的开发以及用于高通量和高灵敏度的液滴含量分析的一系列基于荧光技术的相关应用取得了巨大进步。
基于液滴的单外泌体计数免疫测定方法被开发用于外泌体的数字化定量。采用外泌体酶联免疫吸附试验(exoelisa)鉴定具有靶膜蛋白生物标志物的外泌体。该方法在本文中也称为液滴数字exoelisa，其流程在图5a-5d中示出。磁性珠粒用作捕获和分离靶外泌体的介质。首先，将外泌体悬浮液与足够数量的与捕获抗体结合的磁性珠粒混合，所述捕获抗体可以选择性地结合外泌体膜上的特定蛋白质。经过有效的磁分离和洗涤，一个靶外泌体被固定并捕获到磁性珠粒上。用酶报告物标记的检测抗体进一步识别捕获的外泌体上的抗原，在珠粒上形成单个酶联免疫复合物(图5a)。其次，使用微流体芯片将制备的珠粒和酶促基质共同包封成足够数量的微滴以确保大多数液滴含有不超过一个珠粒(图5b-5c)。第三，对于含有具有外泌体免疫复合物的珠粒的那些液滴，基质被酶催化以在液滴内发射荧光素(图5d)。基于荧光液滴的统计，可以计算靶外泌体浓度。液滴数字exoelisa方法能够检测到每μl少至～5个外泌体。除了高灵敏度外，液滴数字exoelisa为靶向具有特定蛋白质生物标记物的外泌体提供了高特异性和绝对定量。为了进行临床验证，来自乳腺癌患者的gpc-1(+)外泌体以及在手术前后产生了不同的gpc-1(+)表达水平的结果，表明液滴数字exoelisa平台用于癌症诊断的巨大潜力。
按照我们之前的工作，通过多步超速离心从乳腺肿瘤细胞系(mda-mb-231)中纯化和分离外泌体。外泌体的标准表征分别使用透射电子显微镜(tem)、nta和蛋白质印迹进行。如图6a所示，tem图像显示在超速离心后，脂质双层结构在纯化的外泌体上保持完整，并且外泌体的大小范围为直径50nm至150nm。通过nta分析，确定外泌体的大小分布和浓度(图6b)。制备的外泌体的平均直径为104.2±3.9nm，相应的浓度为6.39×108±4.90×106个颗粒/ml。cd63蛋白是跨膜4超家族的成员，被选作用于捕获外泌体的蛋白质生物标志物，因为cd63是位于膜上的富含外泌体的蛋白质，并且根据文献，其通常用于外泌体捕获。蛋白印迹分析显示从mda-mb-231培养基分离的外泌体上的外泌体标记cd63与从阳性对照相同的细胞系中提取的cd63蛋白一致，表明这些样品中存在cd63(图6c，顶行)。此外，双色超分辨率显微镜用于确认cd63在外泌体膜上的定位(图10a-c)。选择gpc-1蛋白作为乳腺癌报告基因。通过蛋白印迹分析(图6c，底行)和双色超分辨率显微镜(图10d-f)证实了gpc-1在mda-mb-231细胞系外泌体上的高表达和gpc-1在外泌体膜上的位置。因此，分离的乳腺癌外泌体可以进一步用于使用exoelisa在磁性珠粒上外泌体免疫复合物的构建。
建立了一种在珠粒上构建单个外泌体免疫复合物的方案。首先，制备与cd63抗体结合的磁性珠粒。然后将官能化珠粒用于捕获外泌体。结合在一个珠粒上的外泌体数量的概率遵循泊松统计量。因此，当每个珠子捕获的外泌体的平均数小于0.1时，大多数珠子(>99.53％)捕获至多一个靶外泌体。因此，加入比预期的外泌体多10倍的珠粒以确保单外泌体捕获。为了证明通过cd63抗体-抗原结合珠粒成功捕获外泌体，进行了tem实验。将涂有cd63捕获抗体的磁性珠粒暴露于两个样品：一个具有mda-mb-231外泌体，另一个没有外泌体作为对照组。图11a显示表面上没有外泌体的裸珠，而图11b清楚地显示在磁性珠粒上构建了一个外泌体。这些结果证明，官能化磁性珠粒能够通过exoelisa特异性地在单一复合物中结合外泌体。在珠粒上捕获单个外泌体后，将先前用生物素标签生物素化的抗gpc-1用作检测抗体，以在靶外泌体的膜上结合gpc-1蛋白质标记物。在珠粒上形成免疫复合物后，检测抗体进一步与酶报告物β-半乳糖苷酶结合，其催化荧光素-二-β-d-吡喃半乳糖苷(fdg)基质以产生用于在液滴微流体系统中检测的荧光信号。
分别用于制备的珠粒样品和fdg基质溶液的具有两个样品入口的流动聚焦液滴生成装置，用于在矿物油中生成直径为40μm的液滴(图7a)。同样地，珠粒在微滴中的封装也基于泊松分布。将每个液滴的珠粒的平均数量设定为<0.3，以确保大多数液滴不含或含有一个珠粒(参见图12中捕获的珠粒包封的液滴阵列的明亮图像)。重要的是，包含至少一个目标外泌体的阳性液滴可以在对两个相关泊松分布进行1次分析之后，根据目标分子与磁性珠粒的比例和磁性珠粒与液滴的比例来计算。这两个比值被设定得足够低，以允许泊松统计的线性动态范围来计数靶外泌体。因此，几乎所有阳性液滴仅含有一个靶外泌体。此外，直接“数字”计数靶外泌体是可行的，通过简单地计数荧光液滴，而不需要高灵敏度的检测方法或复杂的图像处理来测量磁性珠粒的真实数量。
将生成的液滴以单层构型铺展在液滴储存室中，并在观察之前孵育。荧光信号上升时间为几分钟，表明在液滴生成之前在微通道中预混的影响可以忽略不计。研究fdg催化反应以优化测定孵育时间(图13)。选择30分钟作为40μm直径液滴的最佳孵育时间，但是如果使用较小的液滴则可以缩短孵育时间。一旦孵育完成，就进行荧光液滴的终点计数(阳性拷贝)。荧光液滴的数量代表靶外泌体的数量。
使用上述mda-mb-231外泌体校准液滴数字exoelisa。以初始浓度为6.39×108个外泌体/ml进行样品的10倍连续稀释。结果如图7b所示。检测到的gpc-1外泌体与nanosight中测量的总颗粒具有良好的线性关系。误差棒代表三次重复实验的标准偏差。由于皮升液滴的尺寸，我们的液滴数字exoelisa的lod，由背景(阴性对照)信号加上背景信号的3倍标准偏差(sd)确定，约为10个外泌体/μl。与报道的外泌体检测方法(表1)相比，本文公开的方法实现了最低的lod。因为在样品离散化中，有足够数量的珠粒与外泌体混合，并将珠粒分成足够数量的液滴，以实现一个荧光液滴代表一个靶外泌体，其置信度超过99％。图7c显示了测定的背景，可能是由于与珠粒表面的非特异性结合或游离的报告酶携带到包封的液滴中引起的。图7(d-h)是通过10倍连续稀释的腔室中荧光液滴的图像。值得注意的是，在荧光液滴中，一些液滴发出比其它液滴更强的荧光信号。这种差异可能是由于gpc-1在单个外泌体上的不同表达或单酶催化的异质性造成的。生成一百万个液滴，并且允许动态范围达到线性状态的5log范围。通过采用两个相关泊松统计，可以进一步扩展动态范围。
表1.用于检测外泌体的目前测试方法的检测限(lod)和加载血清样品体积的比较。
外泌体亚群蛋白质生物标志物的多样性使外泌体计数显著复杂化。外泌体亚群的分化基于免疫测定，其具有优异的特异性。为了检查gpc-1(+)外泌体检测在乳腺癌外泌体(mda-mb-231exo)中的特异性，使用三种非癌外泌体，包括人正常肝外泌体(hl-7702exo)、小鼠正常巨噬细胞外泌体(raw264.7exo)和人胚胎干外泌体(hesexo)进行对照实验。蛋白印迹分析用于鉴定mda-mb-231exo、hl-7702exo、raw264.7exo和hesexo中gpc-1的表达水平，并发现gpc-1在mda-mb-231exo中的表达略高于其他三组(图8a)由于蛋白质印迹的检测能力有限，如果样品含有少量gpc-1(+)外泌体，样品中外泌体上的其他蛋白质可能会干扰蛋白质印迹分析中的gpc-1(+)。此外，蛋白质印迹分析只能定性地指示gpc-1是否在样品中表达，因为它不能测量gpc-1(+)外泌体的特定数量。接着，在四个选择的外泌体和两个阴性对照中测量液滴数字exoelisa对gpc-1(+)外泌体检测的特异性：使用不含cd63ab的磁性珠粒和不含外泌体样本的样品(图8b)。nta分析用于估计外泌体数量浓度。对于hl-7702exo、raw264.7exo和hesexo，测量值分别为4.22×108、2.86×108和2.85×108个颗粒/ml(图14a-c)。适当稀释后，每个样品每μl含有6.39×10415个外泌体。在这些样品中，仅mda-mb-231exo显示显著高数量的gpc-1(+)外泌体(每μl40141个外泌体)。对于阴性对照例，每个实验观察到非常少的荧光液滴(每μl～5个可检测的拷贝)，证实测定的背景主要是由于与磁性珠粒的低酶非特异性结合。
为了证明我们的方法的临床相关应用，使用来自5例健康个体(hs)、5例良性乳腺疾病(bbd)、12例乳腺癌患者(bc)和2例手术后乳腺癌患者(bc-as)的血清的临床样品进行用于检测gpc-1(+)外泌体的液滴数字exoelisa(图9)。从hs获得的血清样品用作该研究的对照。即使在健康人血清样品中也存在约0.3％-4.7％(平均2.3％)gpc-1(+)外泌体，并且血液中每毫升约109个囊泡。图9a显示hs组平均每微升有5448个gpc-1(+)外泌体，类似的bbd组中gpc-1(+)外泌体(～6914个外泌体/μl)，而bc组平均gpc-1(+)外泌体增加5到7倍。因此，与正常和良性乳腺疾病样品相比，gpc-1的表达在肿瘤来源的外泌体上显着增加。这种增加可能是肿瘤细胞脱落的gpc-1(+)外泌体水平高于正常细胞的结果。图9b显示bc患者过表达gpc-1(+)外泌体，并且可以与hs和bbd组很好地区分(p<0.0001)。值得注意的是，对于bc1-as和bc2-as，手术后患者bc1和bc2的两个样本，bc1-as和bc2-as中gpc-1(+)外泌体的测量值分别显著低于bc1和bc2(图5c)，但相对高于hs和bbd(图5a)。因此，这些数据不仅证实了gpc-1可被视为区分非bc患者与乳腺癌患者的外泌体生物标志物，而且还表明本文公开的方法适用于检测gpc-1(+)外泌体以用于术前和术后监测。液滴数字exoelisa已被证明是一种可靠的方法，用于量化来自bc临床样品的hs、bbd和bc-ac的靶外泌体。在疾病(特别是癌症)的早期阶段，其中一些仅由肿瘤细胞分泌的外源体亚群非常小，与其他报道的方法相比，液滴数字exoelisa对于检测极低丰度的外泌体是非常有价值的(表1)。因此，液滴数字exoelisa可用于临床研究中的早期癌症诊断和术后监测。
本文描述了利用液滴微流体进行单分子/拷贝检测的方法。标准的exoelisa技术被扩展用于检测具有特定靶蛋白的超低速救护车外泌体。数字exoelisa方法能够实现前所未有的外泌体定量的准确性和高特异性，并且可以通过液滴中的荧光信号水平区分单个外泌体上的靶蛋白表达水平。液滴数字exoelisa可以在5log的动态范围内检测靶外泌体，检测限可以低至每μl10个外泌体。通过用来自多种外泌体亚群蛋白生物标志物的靶gpc-1生物标志物定量外泌体也证明了高特异性。本文公开的方法可用于对来自乳腺癌患者的血清样品中的外泌体进行绝对定量。因此，液滴数字exoelisa方法可以推动癌症外泌体生物标志物的发现。
方法
微流体装置制造和微滴中的exoelisa测定
液滴数字exoelisa装置使用标准软光刻程序由聚二甲基硅氧烷(pdms)制成。将sylgard-184pdms(dowcorning)以10：1的基础和交联剂的混合比浇铸在母模顶部，在真空中脱气并在70℃的烘箱中固化2小时。然后，将固化的pdms从模具中取出并切成单个芯片。用潘氏针对液体进出口的孔进行冲孔。将pdms复制品和载玻片(sailbrand)用o2等离子体处理并粘合在一起。将器件在100℃的热板上烘烤8小时以恢复表面疏水性。将磁性珠粒和荧光素-二-β-d-吡喃半乳糖苷(fdg)基质溶液用矿物油包封成直径为40μm的液滴，其中含有3wt.％的abilem90和0.1wt.％的tritonx-100稳定表面活性剂(图7a)。对于装置操作，珠粒悬浮液和fdg相的流速保持相同，为0.7μl/min，而油相的流速使用注射泵(phdultra，harvardapparatus)控制在2.3μl/min。在完成液滴生成后，将液滴原位孵育30分钟。
荧光图像采集和数据分析
孵育完成后，通过fitc18染料(ex：490nm，em：525nm)的过滤立方体，将装置置于具有50mw强度的纤维照明器(nikonintensilightc-hgfi)的反向荧光显微镜(eclipseti-u，nikon)上。为了减轻液滴成像过程的复杂性和持续时间，在自动xy电动载物台上扫描整个液滴储存室，使用ccd相机(exiblue，qimaging)结合2x物镜拍摄图像以获得用于计算一帧中更多液滴的更宽的图像窗口。在取出储存室中的所有液滴图像之后，使用定制程序来合并和分析荧光和总液滴。通过设定强度阈值，获得具有不同强度的两个不同的液滴群，并计数阳性液滴数。在每个实验中，计数一百万个液滴用于数据分析。
细胞培养和外泌体分离
所有细胞系均来自中国上海中国科学院细胞库。mda-mb-231和hl-7702在含有10％(v/v)胎牛血清(fbs，systembiosciences)和61％(v/v)青霉素-链霉素的5rpmi-1640培养基中培养。将raw264.7培养在dmem细胞培养基中，补充10％(v/v)fbs和1％(v/v)青霉素-链霉素。将所有细胞系在5％co2的潮湿气氛中于37℃孵育。为了从三种细胞系中分离外泌体，将细胞在含有10％(v/v)fbs和1％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中培养至60-70％汇合，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤两次，然后在无血清基础培养基中保持12小时，然后用pbs洗涤一次，然后在含有2％(v/v)exo-fbstm外泌体耗尽的fbs(系统生物科学)和1％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中保持48小时。将hes(人胚胎干)细胞系在psceasy培养基(cellapybio)中于37℃在5％co2培养箱中培养至90-100％汇合。从四种细胞系收集上清液，并依次以2000g离心20分钟以消除细胞和碎片，并以10000g离心30分钟以消除微泡。然后，使用w32ti转子(l-80xp，beckmancoulter)以135000g超速离心两次外泌体，持续70分钟，再重悬于pbs中，储存在-80℃直至进一步使用。
纳米粒子跟踪分析(nta)
使用nanosightns300和nta3.2软件(malvern)测量外泌体的浓度和大小。将样品稀释至合适的浓度～1×107-109个颗粒/ml，并注入配备有405nm激光的检测室中。进行三组测量，每组持续60秒。
双色超分辨率成像
将50μl外泌体样品溶液固定在由聚-l-赖氨酸(sigma-aldrich)包被的盖玻片(saldbrand)上，在室温下孵育30分钟，然后用pbs洗涤三次。使用pkh67绿色荧光细胞连接器微型试剂盒(sigmaaldrich)对外泌体膜进行染色。将50μl的pkh67稀释溶液快速施加到样品上，并通过吸液混合。将混合物在室温下定期混合孵育4分钟，然后加入100μl的1％bsa2分钟，以防止过量染料的结合。用pbs冲洗三次后，立即将盖玻片在室温下置于初级抗体溶液(1：400抗cd63或1：400抗gpc-1)中1小时，然后用pbs洗涤三次。在最后一步中，施用alexafluor647-结合的二级抗体(1：2000bioss，bs-0295g-af647)，然后在室温下孵育30分钟。将最终样品用pbs洗涤三次并储存在pbs中以进一步对外泌体进行超分辨率成像。
使用尼康n-strom(随机光学重建显微镜)超分辨率显微镜系统通过具有488和647nm的全内反射荧光14(tirf)照射来捕获图像。在成像期间，将外泌体浸入成像缓冲液中，该缓冲液由pbs中的0.56mg/ml葡萄糖氧化酶(sigma-aldrich)、0.3mg/ml过氧化氢酶(sigma-aldrich)和10mm半胱胺(sigma-aldrich)组成。结合在第二抗体上的pkh67和alexafluor647分别被激发用于外泌体膜和蛋白质(cd63或gpc-1)的成像。通过ixon3du-897e电子倍增电荷耦合器件(emccd)相机(andortechnology)通过planapochromattirf100×油浸镜头获得一系列20000张图像，数值孔径为1.49。
透射电子显微镜(tem)
将分离的外泌体用浓度比为4：1的2％磷钨酸(pta)染色10分钟。然后将混合物加载到铜网格上并在室温下干燥。用透射电子显微镜(hitachih-7650)观察网格。对于免疫磁性捕获的外泌体的tem分析，根据泊松分布使用cd63包被的磁性珠粒制备单外泌体-珠粒复合物。然后将混合物用2％pta染色10分钟并置于铜网上。进一步干燥后，通过tem成像网格。将未与外泌体混合的cd63包被的磁性珠粒用作阴性对照。
蛋白质印迹分析
通过ripa裂解缓冲液(beyotimeinstituteofbiotechnology)提取来自mda-mb-231细胞的总蛋白质。将细胞蛋白质或外泌体上清液在5×十二烷基磺酸钠(sds)缓冲液中变性。通过10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离每泳道20μg蛋白质，并将其转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(millipore，billerica)上，在室温下在5％脱脂牛奶中封闭2小时，然后用tbs-tween20(tbst)缓冲液(137mmnacl，25mmtris-hcl，ph7.6，0.1％吐温20)洗涤三次。在4℃下用1：1000抗cd63(ab134045，abcam)或1：1000抗gpc-1(ab199343，abcam)过夜探测膜。用tbst缓冲液洗涤后，在室温下用荧光二级抗体(cellsignalingtechnology)孵育印迹1小时，然后用bio-radchemidocxrs成像系统(bio-radlaboratories)进行化学发光测量。
与cd63抗体结合的磁性珠粒的制备
根据制造商的说明书，用
用生物素标签修饰gpc-1抗体
使用ez-linkmicrosulfo-nhs-lc-生物素化试剂盒(thermoscientific)进行抗gpc-1的生物素化。将10μl抗gpc-1与0.24μl9mm磺基-nhs-lc-生物素在室温下混合1小时。然后使用zeba脱盐柱(thermoscientific)除去过量的生物素，产生400μl的1:40生物素化的抗gpc-1用于下一研究。
外泌体捕获、磁分离和酶结合
将cd63-功能化的磁性珠粒与mda-mb-231外泌体(各种浓度6.39,63.9,639,6390,63900个颗粒/μl)混合。将混合物在
临床样品制备
共有24份临床血清样本(5例hs、5例22bbd患者、12例bc患者和2例bc-as患者)从广州南方医科大学南方医院实验医学部获得。通过组织活检的组织学检查证实bbd和bc的诊断。将血清样品以2000g、5分钟的条件离心两次以消除细胞和碎片，然后以16100g离心20分钟以除去微泡。仔细收集上清液并在使用前储存在-80℃。所涉及的临床血清样本经南方医科大学南方医院伦理委员会批准，并获得所有患者和健康个体的书面同意书。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且由此对本领域技术人员启发的各种修改或改变，均包括在本申请的精神和范围内以及所附的权利要求书的范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他要素或限制(单独地或以任何组合)或其任何其他发明或实施方式组合，所有这些组合在本发明的范围内，但不限于此。
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