细胞增殖与毒性检测试剂盒的制作方法

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其是一种可提高检测灵敏度及稳定性、缩短反应时间、避免漏加检测液的细胞增殖与毒性检测试剂盒。

背景技术：

细胞增殖与毒性检测是测定物质毒性、评估药物安全和细胞健康的基本方法，同时可以指示肿瘤细胞增殖活性、目的基因瞬转/稳转细胞系的细胞增殖活性，目的基因过表达或rnai干扰的基因功能研究，在药物筛选及功能安全性研究中发挥重要作用。因此，细胞增殖与毒性检测技术已广泛应用于分子生物学、肿瘤生物学、免疫学、遗传学、药理和药代动力学等各个研究领域。

目前，细胞增殖检测方法主要包括dna合成检测、细胞增殖相关抗原检测及代谢活性检测三大类，其代谢活性检测方法是最为常用的方法。早期的代谢活性检测方法包括mtt法、xtt法、mts法及wst-1法等，即检测试剂盒中分别含有mtt、xtt、mts及wst-1检测液。mtt（四甲基偶氮唑盐）法的原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中（而死细胞无此功能），将结晶溶解后，测定570nm波长吸收值，在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比，吸光度越大，表示细胞活性越强，说明药物毒性越小。mtt法虽具有操作方便快捷、灵敏、无放射性等优点，但由于需要溶解甲臜产物，有时会因甲臜溶解不全或者带出而造成结果偏差，故重复性差，并且具有细胞毒性。

xtt（四氮唑衍生物）法与mtt原理相似，经活细胞线粒体脱氢酶作用，xtt被还原成水溶性的棕黄色甲臜，在电子偶合剂硫酸酚嗪甲脂（pms）存在时，棕黄色甲臜的生成量与活细胞数量呈正相关。但是由于xtt本身不易溶解且溶液不稳定，因此限制了其应用。

mts法和wst-1法与xtt原理相似，它们需要pms存在，但是克服了mtt和xtt的缺点，具有更高的灵敏度和特异性，但是mts或wst-1需要与pms分开配制，使用时再按比例混合，增加了操作的复杂性。

wst-8[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2h-tetrazolium]是近年来开发的一种较wst-1更新的水溶性四氮唑盐，使用原理与前述方法相似，在电子耦合剂（如pms）存在的条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物，生成的甲臜数量与活细胞的数量成正比，细胞增殖越多越快则颜色越深；细胞毒性越大则颜色越浅。这种方法灵敏度更高，甲臜溶解性更好、更稳定、更易保存，且wst-8与pms可配制成一种试剂，使用时更方便。但是，基于wst-8检测的试剂盒依旧存在如下缺陷：含有pms的检测液为与培养基颜色相同的粉色，容易造成检测液漏加或多加；没有配套的反应终止试剂，无法控制反应时间，不适合做大批量的药物筛选；检测液的稳定性较差，较高温度保存或运输时易变质；反应时间及检测灵敏度需要进一步改善。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可提高检测灵敏度及稳定性、缩短反应时间、避免漏加检测液的细胞增殖与毒性检测试剂盒。

本发明的技术解决方案是：一种细胞增殖与毒性检测试剂盒，有检测液，其特征在于所述检测液由wst-8、2-甲基-1,4-萘醌、氯化钠水溶液、氯化钾水溶液及氯化钙水溶液组成，所述wst-8与2-甲基-1,4-萘醌的摩尔比为12~18：1，所述氯化钠水溶液、氯化钾水溶液及氯化钙水溶液的浓度分别为8.6g/l、0.3g/l、0.28g/l；有反应终止液，所述反应终止液为0.05~0.15mol/lhcl。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

1.采用2-甲基-1,4-萘醌作为电子耦合剂，所制成的检测液为黄色，加入培养基后可以明显看到颜色变化，避免漏加或者多加检测液，减小误差。

2.采用的平衡盐体系与常规的生理盐水或者pbs相比，能够提供更加稳定的保存环境，避免检测液因发生氧化还原反应而变质，在50℃下放置20小时仍然不会影响检测效果。本发明的平衡盐体系更接近于细胞环境，对细胞影响更小，使检测结果更准确。

3.配有反应终止液，反应产物加入反应终止液后放入4℃不会结晶，方便多次读取吸光度；可通过反应终止液自行控制检测时间，适用于大批量细胞增殖与毒性检测。

4.优化了wst-8与2-甲基-1,4-萘醌的配比，提供了更高的检测灵敏度，吸光度在0.1~2.8之间都具有良好的线性关系，检测范围比以往试剂盒更宽；加入检测液孵育后20分钟即可达到合适的反应程度（即可读取吸光度），节省了时间，提高了效率。

附图说明

图1为本发明实施例1中c6细胞的细胞数标准曲线图。

图2为本发明实施例2中紫杉醇对hela细胞毒性检测结果。

具体实施方式

实施例1：

1.细胞增殖与毒性检测试剂盒100次使用量的配制方法：

检测液的配制：称取8.6mg氯化钠、0.3mg氯化钾、0.28mg氯化钙充分溶解于1ml超纯水中，然后向其中加入7.8mgwst-8和0.138mg2-甲基-1,4-萘醌，充分溶解后过0.22μm滤膜除菌，装于灭菌的1.5ml可立棕色管中。

2.反应终止液的配制：将8.5μlhcl加入到991.5μl超纯水中，混匀后过0.22μm滤膜除菌，装于1.5ml可立透明管中。

3.上述两种试剂经无菌检测合格，按照1:1装于试剂盒中，即组成细胞增殖与毒性检测试剂盒。

使用本发明实施例试剂盒进行c6细胞计数、检测细胞活性与增殖的方法：

1.制备c6细胞悬液，细胞计数。根据合适的铺板细胞数（0,234,469,938,1875,3750,7500,15000,30000），每孔约100μl细胞悬液，设置3个重复孔。37℃培养箱中培养2~4小时，使细胞贴壁。

2.每孔加入10μl检测液，轻轻敲击培养板以帮助混匀；或者直接配置含10%检测液的培养基，以换液的形式加入；

3.培养箱内孵育1~2小时，在每孔中加入10μl的反应终止液，测定450nm吸光度。

4.制作出一条以细胞数量为横坐标（x轴），吸光度为纵坐标（y轴）的标准曲线，根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。

采用日本同仁cck-8试剂盒作为对照，在相同的实验条件下，检测细胞活力，制作的细胞数标准曲线如图1所示。结果表明，本发明试剂盒测得的吸光度/细胞数目比值更大，灵敏度更高。

实施例2：

细胞增殖与毒性检测试剂盒100次使用量的配制方法：

1.检测液的配制：称取8.6mg氯化钠、0.3mg氯化钾、0.28mg氯化钙充分溶解于1ml超纯水中，然后向其中加入7.2mgwst-8和0.12mg2-甲基-1,4-萘醌，充分溶解后过0.22μm滤膜除菌，分装于灭菌的1.5ml可立棕色管中。

2.反应终止液的配制：将9μlhcl加入到991μl超纯水中，混匀后过0.22μm滤膜除菌，分装于1.5ml可立透明管中。

3.上述两种试剂经无菌检测合格，按照1:1装于试剂盒中，即组成细胞增殖与毒性检测试剂盒。

使用本发明实施例2试剂盒进行紫杉醇对hela细胞的毒性检测方法：

1.制备hela细胞悬液，细胞计数。根据合适的铺板细胞数（40000），每孔约100μl细胞悬液，设置3个重复孔。37℃培养箱中培养2~4小时，使细胞贴壁。

2.每孔加入10μl不同浓度（0,10,40,160,625,1500,2000,2500μg/ml）的紫杉醇，37℃培养箱中培养48小时（根据待测药物的性质和细胞的敏感性确定待测药物的培养时间，一般根据细胞周期来决定，至少培养一代以上的时间）。

3.每孔加入10μl检测液，轻轻敲击培养板以帮助混匀；或者直接配置含10%检测液的培养基，以换液的形式加入。

4.培养箱内孵育1~2小时，在每孔中加入10μl的反应终止液，测定450nm吸光度。

5.细胞存活率与抑制率计算：

细胞存活率=[(as-ab)／(ac-ab)]×100%；

抑制率=[(ac-as)／(ac-ab)]×100%；

as：实验孔（含有培养基、检测液、药物）的吸光度

ac：对照孔（含有培养基、检测液、没有药物）的吸光度

ab：空白孔（不含细胞和药物的培养基、检测液）的吸光度

采用日本同仁cck-8试剂盒作为对照，在相同的实验条件下，检测紫杉醇对hela细胞的毒性作用，以紫杉醇浓度为横坐标、吸光度为纵坐标制作折线图如图2所示。结果表明，本发明试剂盒测得的吸光度/药物浓度比值更大，说明对药物浓度改变的反应更加灵敏。

实施例3：

细胞增殖与毒性检测试剂盒500次使用量的配制方法：

1.检测液的配制：称取43mg氯化钠、1.5mg氯化钾、1.4mg氯化钙充分溶解于5ml超纯水中，然后向其中加入33mgwst-8和0.52mg2-甲基-1,4-萘醌，充分溶解后过0.22μm滤膜除菌，分装于灭菌的8ml棕色液体瓶中。

2.反应终止液的配制：将42.5μlhcl加入到4.96ml超纯水中，混匀后过0.22μm滤膜除菌，分装于8ml本色液体瓶中。

3.上述两种试剂经无菌检测合格，按照1:1装于试剂盒中，即组成细胞增殖与毒性检测试剂盒。

使用本发明实施例3试剂盒进行悬浮细胞活性与增殖检测的方法：

1.制备细胞悬液，细胞计数。根据合适的铺板细胞数，每孔约100μl细胞悬液，设置3个重复孔。

2.每孔加入10μl检测液，轻轻敲击培养板以帮助混匀。

3.培养箱内孵育1~2小时（对于大多数贴壁细胞孵育30分钟即可）。

4.在每孔中加入10μl的反应终止液，测定450nm吸光度。如果暂时不测定吸光度，可以在加入反应终止液后，遮盖培养板避光保存在2~8℃，在7天内吸光度不发生变化。

实施例4：

细胞增殖与毒性检测试剂盒500次使用量的配制方法：

1.检测液的配制：称取43mg氯化钠、1.5mg氯化钾、1.4mg氯化钙充分溶解于5ml超纯水中，然后向其中加入30mgwst-8和0.52mg2-甲基-1,4-萘醌，充分溶解后过0.22μm滤膜除菌，分装于灭菌的8ml棕色液体瓶中。

2.反应终止液的配制：将43μlhcl加入到4.96ml超纯水中，混匀后过0.22μm滤膜除菌，分装于8ml本色液体瓶中。

3.上述两种试剂经无菌检测合格，按照1:1装于试剂盒中，即组成细胞增殖与毒性检测试剂盒。

使用试剂盒进行悬浮细胞毒性检测的方法：

1.制备细胞悬液，细胞计数。根据合适的铺板细胞数，每孔约100μl细胞悬液，设置3个重复孔。

2.每孔加入0~10μl不同浓度的待测药物，37℃培养箱中培养适当时间。根据待测药物的性质和细胞的敏感性确定待测药物的培养时间，一般根据细胞周期来决定，至少培养一代以上的时间。

3.每孔加入10μl检测液，轻轻敲击培养板以帮助混匀。

4.培养箱内孵育1~2小时（对于大多数贴壁细胞孵育30分钟即可）。

5.在每孔中加入10μl的反应终止液，测定450nm吸光度。如果暂时不测定吸光度，可以在加入反应终止液后，遮盖培养板避光保存在2~8℃，在7天内吸光度不发生变化。

6.细胞存活率与抑制率计算：

细胞存活率=[(as-ab)／(ac-ab)]×100%；

抑制率=[(ac-as)／(ac-ab)]×100%；

as：实验孔（含有培养基、检测液、药物）的吸光度

ac：对照孔（含有培养基、检测液、没有药物）的吸光度

ab：空白孔（不含细胞和药物的培养基、检测液）的吸光度。