一种以SERS基底结合多元线性回归模型进行2,4-D快速检测的方法与流程

本发明属于农产品快速检测技术领域，具体涉及一种以sers基底结合多元线性回归模型进行2,4-d快速检测的方法。

背景技术：

农产品在栽培和生产的过程中，不可避免的会使用到农药，但在农药的施用过程中常常由于错误的指导和违规操作，出现农药残留过量的现象。尤其是2,4-d、杀虫脒和敌百虫等水溶性农药不仅容易残留在农产品的表面和环境中，也会渗入农产品的内部，会随着人们的食用最终进入人体，这些农药在人体内会增加肿瘤、染色体病变、神经元损伤等风险。

其中，茶是我国传统饮料也是主要经济作物之一，因其独特的感官品质及生津止渴、降血脂等功效，使得茶在世界范围内得到了极高的赞誉。但茶叶在生长过程中由于农药的使用，极易残留2,4-d，会随着冲泡进入茶水中，从而进入人体。因此，对茶叶及茶汤中的农药残留进行快速、灵敏的检测对保护消费者健康有着重要意义。

目前对农药残留进行检测的手段包括常规理化检测、高效液相色谱法(hplc)、气相色谱-质谱法(gc-ms)以及酶联免疫法(elisa)等手段，这些检测手段能满足检测限及检测精度的要求，但是也都存在着检测周期长、成本高、前处理复杂的缺点；光谱学检测方法如拉曼光谱法和红外光谱法由于可以反映待测物成分的官能团等结构信息，在有机物残留检测中的应用愈发广泛。但不同于常规的数据采集，表面增强拉曼散射(sers)技术技术所收集到的每组数据都是一条完整的散射光谱，通常含有上千个变量，这对数据处理和分析就造成了很大的阻碍。不仅如此，光谱中还常常包含着很多与实际样品无关的变量，会影响定量计算的精度。

技术实现要素：

针对目前传统检测手段存在的检测周期长和预处理繁琐的弊端，本发明旨在解决所述问题之一；本发明以sers技术为基础同时结合多元线性回归模型对茶汤中2,4-d进行快速检测，其中多元线性回归模型是指使用偏最小二乘法(partialleastsquare,pls)，并结合竞争性自适应重加权算法(competitiveadaptivereweightedsampling,cars)进行波数变量筛选。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种以银-氧化锌为sers基底进行2,4-d快速检测的方法，包括如下步骤：

(1)样品液的制备：取样品与水混合后加热处理，然后进行真空抽滤，所得清夜作为样品液；

(2)将六水合硝酸锌加入水中，得到六水合硝酸锌水溶液，进行搅拌，然后加入氨水，调整温度后，继续搅拌，反应后得到的乳白色浑浊液，依次进行离心分离、乙醇清洗、去离子水清洗，真空干燥得到白色氧化锌粉末；

(3)然后将步骤(2)制备的氧化锌粉末、聚乙烯吡咯烷酮和葡萄糖加入去离子水中，加热至一定温度后，进行搅拌，之后加入硝酸银溶液，继续第二次搅拌，将得到的灰褐色浑浊液，依次进行离心分离、乙醇清洗、去离子水清洗，真空干燥后得到黑色银-氧化锌复合物粉末；

(4)样品液中2,4-d浓度预测模型的建立：向步骤(1)所制备样品液中分别加入2,4-d农药标品，配制为不同的2,4-d浓度，将预处理后的光谱导入matlab中，然后设置cars算法中进化次数、最低取样次数和变异系数，利用cars算法对所有预处理后的sers光谱进行变量筛选，选出交互验证均方根误差最低的变量组合用于预测模型的建立；

(5)样品液中sers光谱采集：取步骤(2)制备的银-氧化锌复合物粉末溶解于乙醇中，超声波分散，均匀滴在硅晶片表面，干燥，然后取步骤(1)制备的样品液均匀滴在硅晶片表面，设置激光器波长、光谱积分时间、光谱重复抓取次数、光源功率和扫描波数范围，进行sers光谱收集；

(6)将步骤(5)所收集的样品液的sers光谱代入步骤(4)所建立的预测模型中，即可实现对样品液中2,4-d浓度的检测。

优选的，步骤(1)中，所述样品与水的质量比为1:10，所述加热的温度为40～60℃。

优选的，步骤(2)中，所述六水合硝酸锌水溶液浓度0.004～0.01g/ml，所述氨水浓度为28wt％；所述六水合硝酸锌水溶液和氨水的体积比125:1。

优选的，步骤(2)中，所述搅拌的温度为40℃，转速为200rpm，时间为10min；所述调整温度为30～60℃；所述反应的时间为18h。

优选的，步骤(3)中所述氧化锌粉末、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、去离子水和硝酸银溶液的用量比为0.5g：2.5g：2g：50ml：5ml；所述硝酸银溶液的浓度为0.5mol/l。

优选的，步骤(3)中，所述一定温度为95～115℃，所述搅拌的转速为200rpm，时间5～15min；所述第二次搅拌的条件为，温度为95～115℃，转速为200rpm，时间30～120min。

优选的，步骤(2)和(3)中，所述真空干燥的温度为60℃，时间为12h。

优选的，步骤(4)中，所述预处理为一阶导数处理(firstderivate,d1)、二阶导数处理(secondderivate,d2)或标准正态变量变换(standardnormalvariatetransformation,snvt)中的一种或几种联合处理。

优选的，步骤(4)中，所述cars算法中进化次数为20～120、最低取样次数为25、变异系数为2～8。

优选的，步骤(4)中，所述农药浓度为10^-2～10⁶μg/l。

优选的，步骤(5)中，所述银-氧化锌复合物粉末与乙醇的用量比为0.2g：5ml。

优选的，步骤(5)中，所述激光器波长为785nm；光谱积分时间为2s，光谱重复抓取3次，光源功率350mw，扫描波数范围400～1800cm^-1。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明制备的表面增强拉曼基底，所选用的银-氧化锌复合纳米花具有多枝3d立体结构且表面结合有银纳米颗粒，可以提供大量的“拉曼热点”，使其拉曼增强效应高于以往的银纳米颗粒。经cars算法对所得sers光谱进行筛选后，剔除掉了大量无关变量，可以增加模型稳定性及建模效率也会对模型预测能力产生积极影响。

(3)本发明采用一阶导数、二阶导数、标准正态变量变换方法对sers光谱进行预处理，可以有效提高cars-pls预测模型的建模效率及稳定性。

(4)本发明制备的的检测方法可用于茶汤中2,4-d的原位检测，其检测速度快，检测范围广，稳定性、灵敏度高，在食品安全、环境监测等技术领域应用前景良好，具有检测其它农产品中农药残留的潜力。

附图说明：

图1中a为加入不同浓度农药后茶汤样品液的sers光谱；b为实施例1所得茶汤光谱经d1预处理后光谱图。

图2中a、b和c分别为实施例1中cars-pls模型运行次数与交互验证均方根误差、回归系数和变量数间关系图。

图3为实施例1所得cars-pls模型的训练及预测效果图。

具体实施方式：

实施例1：

(1)取10g的茶叶与水混合后加热到60℃，然后进行真空抽滤，所得清夜作为样品液；

(2)配制浓度为0.006g/ml的六水合硝酸锌溶液200ml，在磁力搅拌油浴锅中预加热至40℃并保持200rpm的转速搅拌10min；之后向溶液中加入2ml浓度为28wt％的氨水，并将温度设置为30℃，保持200rpm转速反应18h；反应结束后将得到的白色浑浊液冷却至室温，然后在8000rpm转速下离心15min，弃去上清液，利用去离子水对收集的白色沉淀进行洗涤；以相同条件继续离心，弃去上清液，并利用无水乙醇对白色沉淀进行洗涤，再次以8000rpm转速下离心15min，利用去离子水清洗并离心后收集所得白色沉淀即为纯氧化锌颗粒，在60℃条件下对沉淀进行干燥12h，最终得到白色氧化锌粉末。

(3)取上述纳米氧化锌颗粒0.5g与2.5g的pvpk30及2g葡萄糖共同溶解于50ml去离子水中，在磁力搅拌油浴锅中升温至80℃并在200rpm转速下搅拌10min，之后向溶液中加入浓度0.5mol/l的硝酸银溶液5ml，保持温度及转速反应1h，将最终灰褐色浑浊液在8000rpm转速下离心15min，将所得灰褐色沉淀按氧化锌颗粒的清洗流程进行彻底清洗，将清洗后的沉淀置于50℃条件下干燥8h，得到黑色粉末，即为银-氧化锌复合粉末。

(4)在茶汤样品液中加入2,4-d农药标品，使茶汤样品液中农药浓度分别为10^-2μg/l、10^-1μg/l、0μg/l、10¹μg/l、10²μg/l、10³μg/l、10⁴μg/l、10⁵μg/l和10⁶μg/l，每个浓度设置10个平行；然后对9个浓度梯度的茶汤进行sers光谱采集，并进行d1预处理；将预处理后的光谱导入matlab中，然后设置cars算法中进化次数、最低取样次数和变异系数，所述进化次数20、最低取样次数25、变异次数2；利用cars算法对所有预处理后的sers光谱进行变量筛选，选出交互验证均方根误差最低的变量组合用于预测模型的建立。

(5)将0.2g制得的银-氧化锌复合粉末分散于5ml乙醇中超声分散10min，均匀滴在1×1cm的硅晶片上，完全干燥后取5μl步骤(1)制备样品液的液滴在附着有银-氧化锌复合纳米材料的区域，之后进行sers光谱收集，将激光器波长设置为785nm；光谱积分时间为2s，光谱重复抓取3次，光源功率350mw，扫描波数范围400～1800cm^-1。

(6)将步骤(5)所收集的样品液sers光谱代入步骤(4)所建立的预测模型中，即可实现对样品液中2,4-d浓度的检测。

图1a为90条含有不同2,4-d农药浓度的茶汤sers光谱图，图中可以明显的看出光谱存在基线漂移的现象，不利于后期建模的稳定性和可靠性。图1b为d1预处理后所得样品液sers光谱图，图中可以看到基线漂移问题得到了良好的解决。

图2为实施例1参数下cars算法运行过程中运行次数与交互验证均方根误差、回归系数和所选变量数的关系图。

图3为所建立预测模型中样品液的真实值与预测值之间的拟合关系，可以看出拟合程度良好，可以用于真实样品液中农药的预测。

实施例2：

(1)取10g的茶叶与水混合后加热到40℃，然后进行真空抽滤，所得清夜作为样品液；

(2)配制浓度为0.004g/ml的六水合硝酸锌溶液200ml，在磁力搅拌油浴锅中预加热至40℃并保持200rpm的转速搅拌10min；之后向溶液中加入2ml浓度为28wt％的氨水，并将温度设置为50℃，保持200rpm转速反应18h；反应结束后将得到的白色浑浊液冷却至室温，然后在8000rpm转速下离心15min，弃去上清液，利用去离子水对收集的白色沉淀进行洗涤；以相同条件继续离心，弃去上清液，并利用无水乙醇对白色沉淀进行洗涤，再次以8000rpm转速下离心15min，利用去离子水清洗并离心后收集所得白色沉淀即为纯氧化锌颗粒，在60℃条件下对沉淀进行干燥12h，最终得到纳米氧化锌颗粒。

(3)取上述纳米氧化锌颗粒0.5g与2.5g的pvpk30及2g葡萄糖共同溶解于50ml去离子水中，在磁力搅拌油浴锅中升温至80℃并在200rpm转速下搅拌10min，之后向溶液中加入浓度0.5mol/l的硝酸银溶液5ml，保持温度及转速反应1h，将最终灰褐色浑浊液在8000rpm转速下离心15min，将所得灰褐色沉淀按氧化锌颗粒的清洗流程进行彻底清洗，将清洗后的沉淀置于50℃条件下干燥8h，得到黑色粉末，即为银-氧化锌复合纳米颗粒。

(4)在茶汤样品液中加入2,4-d农药标品，使茶汤样品液中农药浓度分别为10^-2μg/l、10^-1μg/l、0μg/l、10¹μg/l、10²μg/l、10³μg/l、10⁴μg/l、10⁵μg/l和10⁶μg/l，每个浓度设置10个平行；然后对9个浓度梯度的茶汤进行sers光谱采集，并进行d2预处理；将预处理后的光谱导入matlab中，然后设置cars算法中进化次数、最低取样次数和变异系数，所述进化次数50、最低取样次数25、变异次数5；利用cars算法对所有预处理后的sers光谱进行变量筛选，选出交互验证均方根误差最低的变量组合用于预测模型的建立。

(5)将0.2g制得的银-氧化锌复合粉末分散于5ml乙醇中超声分散10min，均匀滴在1×1cm的硅晶片上，完全干燥后取5μl步骤(1)制备样品液的液滴在附着有银-氧化锌复合纳米材料的区域，之后进行sers光谱收集，将激光器波长设置为785nm；光谱积分时间为2s，光谱重复抓取3次，光源功率350mw，扫描波数范围400～1800cm^-1。

(6)将步骤(5)所收集的样品液sers光谱代入步骤(4)所建立的预测模型中，即可实现对样品液中2,4-d浓度的检测。

实施例3：

(1)取10g的茶叶与水混合后加热到50℃，然后进行真空抽滤，所得清夜作为样品液；

(2)配制浓度为0.01g/ml的六水合硝酸锌溶液200ml，在磁力搅拌油浴锅中预加热至40℃并保持200rpm的转速搅拌10min；之后向溶液中加入2ml浓度为28wt％的氨水，并将温度设置为60℃，保持200rpm转速反应18h；反应结束后将得到的白色浑浊液冷却至室温，然后在8000rpm转速下离心15min，弃去上清液，利用去离子水对收集的白色沉淀进行洗涤；以相同条件继续离心，弃去上清液，并利用无水乙醇对白色沉淀进行洗涤，再次以8000rpm转速下离心15min，利用去离子水清洗并离心后收集所得白色沉淀即为纯氧化锌颗粒，在60℃条件下对沉淀进行干燥12h，最终得到纳米氧化锌颗粒。

(3)取上述纳米氧化锌颗粒0.5g与2.5g的pvpk30及2g葡萄糖共同溶解于50ml去离子水中，在磁力搅拌油浴锅中升温至80℃并在200rpm转速下搅拌10min，之后向溶液中加入浓度0.5mol/l的硝酸银溶液5ml，保持温度及转速反应1h，将最终灰褐色浑浊液在8000rpm转速下离心15min，将所得灰褐色沉淀按氧化锌颗粒的清洗流程进行彻底清洗，将清洗后的沉淀置于50℃条件下干燥8h，得到黑色粉末，即为银-氧化锌复合纳米颗粒。

(4)在茶汤样品液中加入2,4-d农药标品，使茶汤样品液中农药浓度分别为10^-2μg/l、10^-1μg/l、0μg/l、10¹μg/l、10²μg/l、10³μg/l、10⁴μg/l、10⁵μg/l和10⁶μg/l，每个浓度设置10个平行；然后对9个浓度梯度的茶汤进行sers光谱采集，并进行d1及snvt联合处理；将预处理后的光谱导入matlab中，然后设置cars算法中进化次数、最低取样次数和变异系数，所述进化次数120、最低取样次数25、变异次数8；利用cars算法对所有预处理后的sers光谱进行变量筛选，选出交互验证均方根误差最低的变量组合用于预测模型的建立。

(5)将0.2g制得的银-氧化锌复合粉末分散于5ml乙醇中超声分散10min，均匀滴在1×1cm的硅晶片上，完全干燥后取5μl步骤(1)制备样品液的液滴在附着有银-氧化锌复合纳米材料的区域，之后进行sers光谱收集，将激光器波长设置为785nm；光谱积分时间为2s，光谱重复抓取3次，光源功率350mw，扫描波数范围400～1800cm^-1。

(6)将步骤(5)所收集的样品液sers光谱代入步骤(4)所建立的预测模型中，即可实现对样品液中2,4-d浓度的检测。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。