本申请涉及一种保留时间对齐/校正用内标物、内标液、方法和试剂盒，属于分析化学领域。
背景技术：
组学、生物信息学等生物大数据分析需要通过大量甚至海量数据获得生物学相关发现。实验结果通常存在着实验间的变异和实验内的变异。一般来说，实验间的变异比实验内变异的量级要高。
在分析检测过程中，由于多种因素的影响，原始色谱图容易出现谱峰漂移和一些系统偏倚。这些误差很大程度上来源于色谱柱本身的影响(色谱柱老化，填充不均匀，柱内残留污染物等)。即使实验条件完全平行，这些误差也难以避免；即使使用相同的实验条件和样品，更换色谱柱色谱图也会产生差别。其次，一些实验条件(温度、洗脱梯度等)很难控制也是色谱保留时间偏差的主要原因之一。另外，仪器误差(死体积，流速变化，基线漂移等)也会对保留时间造成很大影响。谱峰漂移使谱图变得复杂，给化合物归属、定量、模式识别、数据挖掘等分析带来困难。因此谱峰保留时间的对齐与校正成为生物大数据分析预处理过程中的一个关键步骤。lc-ms谱图对齐与校正不但可以消除实验间的色谱分离分析误差，而且使不同时间、不同实验室产生的lc-ms结果进行同时比较成为可能。
生物样本(血浆、尿液、中药提取物、复方制剂等)作为典型的复杂体系，化学成分极其复杂。众多成分的理化性质不同，含量差别巨大。实验中各有实验因素对不同性质的化合物的色谱保留影响不尽相同。成分间极性的差异使得它们的保留时间覆盖整个色谱分离过程。实际分析中待分析样本可能没有共同化合物或者共同化合物色谱保留时间不够分散。目前尚未有商品化的用于液质联用仪负离子模式的保留时间内标试剂盒。
技术实现要素：
根据本申请的一个方面，提供了一种保留时间对齐/校正用内标物和内标液，该内标物和内标液能有效进行液质联用仪负离子模式下色谱保留时间对齐/校正。
具体地，本申请中采用极性差别显著、色谱保留时间阶梯式增加的物质作为保留时间内标。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于液质联用仪负离子模式的保留时间内标组合物、方法和试剂盒。使用这些内标物可以准确、方便对齐/校正液质联用仪负离子模式的数据。
所述保留时间对齐/校正用内标物，其特征在于，包含5-氟尿嘧啶、没食子酸、原儿茶酸、间硝基苯酚、4-叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚中的至少一种。
可选地，所述内标物包含5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，间硝基苯酚，4-叔丁基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚。
本申请的又一方面，提供了一种保留时间对齐/校正用内标液，其特征在于，包含上述所述的内标物中的至少一种。
可选地，所述保留时间对齐/校正用内标液，包含内标物；其中，所述内标物选自5-氟尿嘧啶、没食子酸、原儿茶酸、间硝基苯酚、4-叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚中的至少一种。
可选地，所述保留时间对齐/校正用内标液，包含内标物；其中，所述内标物包含5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，间硝基苯酚，4-叔丁基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚。
可选地，所述内标液还包括溶剂；其中，所述溶剂溶解所述内标物。
可选地，所述溶剂可以使用任何适合的溶剂。
可选地，所述溶剂包含乙腈、水、甲醇、乙醇中的至少一种。
可选地，所述溶剂选自乙腈、水、甲醇、乙醇中的至少一种。
可选地，所述溶剂选自乙腈、水、甲醇、乙醇中的至少两种以任意比例混合得到的混合物。
可选地，所述溶剂选自以任意比例混合的乙腈和水的混合物。
可选地，所述溶剂包含乙腈和水的混合物。
具体地，所述内标液包括预定浓度的内标物；和用于溶解所述内标物的溶剂。所述预定浓度为内标液中内标物的浓度。
可选地，所述内标液中4-叔丁基苯酚的浓度为最高浓度。
可选地，所述内标液中中间硝基苯酚的浓度为最低浓度。
可选地，所述内标液的浓度可有本领域技术人员根据具体的被评价的样本进行适应性的选择。
可选地，所述内标物和/或内标液用于质谱仪和/或液相色谱仪。
可选地，所述内标物和/或内标液用于负离子化模式中。
可选地，所述质谱仪为电喷雾质谱仪。
具体地，所述内标物和/或内标液用于但不局限于电喷雾质谱仪。
本申请的另一方面，提供了一种保留时间对齐/校正的方法，其特征在于，采用上述所述的保留时间对齐/校正用内标物、上述任一项所述的保留时间对齐/校正用内标液中的至少一种。
可选地，所述方法用于液质联用中保留时间对齐/校正。
可选地，所述方法用于液质联用仪负离子模式的保留时间对齐/校正。
可选地，所述方法包括：
(1)获得待分析样本；
(2)将所述内标液与步骤(1)中所述待分析样本混合，获得待测样品；
(3)将步骤(2)中待测样品加入至测试仪器中，获得待测样品的液质联用色谱图；
(4)提取待测样品中内标物的eic色谱图，测定各内标物的保留时间；
(5)进行保留时间对齐/校正。
可选地，步骤(1)中所述待分析样本为生物样本。
可选地，步骤(1)中所述待分析样本包括血浆、血清、脑脊液、尿液、中药原药材、中药的不同部位、中药的加工品中的至少一种。
可选地，所述中药的加工品包括饮片、粉末、制剂中的至少一种。
具体地，步骤(1)中所述待分析样本包括但不局限于血浆，血清，脑脊液，尿液，中药原药材、饮片、粉末、制剂(中药颗粒、中药注射液等)，同时也包含但不局限于中药的不同部位以及它们的各种加工品等等。
可选地，步骤(4)中所述内标物的eic色谱图选自m/z＝129.0110、169.0126、153.0191、138.0186、149.0963、205.1593的eic色谱图中的至少一种。
可选地，步骤(4)中所述内标物的eic色谱图选自m/z＝129.0110，169.0126，153.0191，138.0186，149.0963，205.1593的eic色谱图。
可选地，步骤(5)包括：色谱峰对齐或校正。
可选地，所述色谱峰对齐或校正的方法包括：相关优化解缠法、光谱排序算法、距离和频谱相关优化对齐、多尺度谱峰对齐算法、基于经验贝叶斯模型的谱峰对齐算法等。
可选地，所述方法包括：
a.获得待分析样本；
b.将内标液加入待分析样本中，充分混合，得到待测样品；
所述内标液含有内标物和用于溶解所述内标物的溶剂；
c.将待测样品注入液质联用仪中，经色谱柱分离，获得待测样品的液质联用色谱图；
d.提取待测样品m/z＝129.0110,169.0126,153.0191,138.0186,149.0963,205.1593的eic色谱图，测定各内标物的保留时间；
e.进行保留时间对齐/校正。
作为其中一种具体的实施方式，所述方法包括：
a1、按一定制备方法制备得到待分析样本；
b1、将一定体积的内标物加入待分析样本中，充分混合，得到待测样品。所述内标物含有多种已知化合物和用于溶解所述内标物的溶剂；
c1、将待测样品注入液质联用仪中，经色谱柱分离，获得待测样品的液质联用色谱图；
d1、提取待测样品m/z＝129.0110,169.0126,153.0191,138.0186,149.0963,205.1593的eic色谱图，测定各内标物的保留时间；
e1、根据实验需求进行保留时间对齐/校正。
可选地，上述所述的保留时间对齐/校正用内标物、上述任一项所述的保留时间对齐/校正用内标液用于液相色谱仪和/或质谱仪。
本申请的另一方面，提供了上述所述的保留时间对齐/校正用内标物和/或上述任一项所述的保留时间对齐/校正用内标液和/或上述任一项所述的保留时间对齐/校正的方法用于液质联用仪负离子模式的保留时间对齐/校正。
本申请的再一方面，提供了一种试剂盒，其特征在于，包含内标物和溶剂；
其中，所述内标物包含5-氟尿嘧啶、没食子酸、原儿茶酸、间硝基苯酚、4-叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚中的至少一种；
所述溶剂包含自乙腈、甲醇、乙醇、水中的至少一种。
可选地，所述溶剂包含乙腈和水的混合物。
可选地，所述内标物包含5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，间硝基苯酚，4-叔丁基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚。
可选地，所述溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、水中的至少一种。
可选地，上述任一项所述的试剂盒用于保留时间对齐/校正。
可选地，所述试剂盒为用于液质联用仪负离子模式的保留时间内标试剂盒。
作为其中一种具体的实施方式，所述用于液质联用仪负离子模式的保留时间内标试剂盒，包括预定浓度的内标物和用于溶解所述内标物的溶剂。
本发明提供了一种用于液质联用仪负离子模式的保留时间内标液、方法和试剂盒，其包括预定浓度的内标物和用于溶解所述组合物的溶剂，所述组合物包含5-氟尿嘧啶、没食子酸、原儿茶酸、间硝基苯酚、4-叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚。所述内标液用于生物样品的负离子化模式中，并且其可以用于但不局限于用于电喷雾质谱仪。所述内标液可以包括一种使得能够在宽保留时间范围内进行对齐/校正的混合物。
本申请中，“液质联用”，是指液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。
本申请能产生的有益效果包括：
(1)本申请中提供了用于液质联用仪负离子模式保留时间对齐/校正的保留时间内标试剂盒，可商业化。
(2)本申请所述试剂盒绿色环保，安全实用，配置简单，保存容易，能有效进行液质联用仪负离子模式下色谱保留时间对齐/校正。
(3)本申请所述方法操作过程简单易控，保留时间分散。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。其中，5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，间硝基苯酚，4-叔丁基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚对照品的购买来源为：北京万佳首化生物科技有限公司。
根据本申请的一种实施方式，一种用于液质联用仪负离子模式的保留时间内标组合物，其包含：预定浓度的内标物；和用于溶解所述内标物的溶剂。
可选地，所述内标物用于液相色谱仪。
可选地，所述内标物用于质谱仪。
可选地，所述内标物用于负离子化模式中。
可选地，所述内标物用于但不局限于电喷雾质谱仪。
可选地，所述内标物包含5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，间硝基苯酚，4-叔丁基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚。
可选地，所述溶解内标物的溶剂包含乙腈和水的混合物。
根据本申请的一种实施方式，一种用于液质联用仪负离子模式的保留时间内标使用方法，采用了上述任一项所述的组合物，具体包括：
(1)按一定制备方法制备得到待分析样本
(2)将一定体积的内标物加入待分析样本中，充分混合，得到待测样品。所述内标物含有多种已知化合物和用于溶解所述内标物的溶剂；
(3)将待测样品注入液质联用仪中，经色谱柱分离，获得待测样品的液质联用色谱图；
(4)提取待测样品m/z＝129.0110,169.0126,153.0191,138.0186,149.0963,205.1593的eic色谱图，测定各内标物的保留时间；
(5)根据实验需求进行保留时间对齐/校正。
可选地，所述内标物用于液相色谱仪。
可选地，所述内标物用于质谱仪。
可选地，所述内标物用于负离子化模式中。
可选地，所述内标物用于但不局限于电喷雾质谱仪。
可选地，所述内标物包含5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，间硝基苯酚，4-叔丁基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚。
可选地，所述溶解内标物的溶剂包含乙腈和水的混合物。
根据本申请的一种实施方式，一种用于液质联用仪负离子模式的保留时间内标试剂盒，其包含：预定浓度的内标物；和用于溶解所述组合物的溶剂。
可选地，所述内标物用于液相色谱仪。
可选地，所述内标物用于质谱仪。
按照上述所述用于液质联用仪负离子模式的保留时间内标试剂盒，其特征在于：所述内标物用于负离子化模式中。
可选地，所述内标物用于但不局限于电喷雾质谱仪。
可选地，所述内标物包含5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，间硝基苯酚，4-叔丁基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚。
可选地，所述溶解内标物的溶剂包含乙腈和水的混合物。
实施例1
1、待分析样本的准备。
本实施例采用来自于市场的中药样本川芎(1；样本数n＝23)，防风(2；样本数n＝24)，柴胡(3；样本数n＝22)，羌活(4；样本数n＝21)，蛇床子(5；样本数n＝21)，当归(6；样本数n＝21)，白芷(7；样本数n＝22)，藁本(8；样本数n＝22)，小茴香(9；样本数n＝22)，取每种中药样本粉末各100mg，分别加入体积浓度50％甲醇0.5ml，超声提取10min，15000转/分钟高速离心10min取上清液，滤渣再次加入0.5ml体积浓度50％甲醇超声提取10min，15000转/分钟高速离心10min取上清液。合并两次得到上清的提取液。
2.将10ul内标液加入到40ul待分析样本中，充分混合，得到待测样品；所述内标物含有5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，间硝基苯酚，4-叔丁基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚和用于溶解所述内标物的溶剂；
其中，10ul内标液的具体组成为：称取适量5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，间硝基苯酚，4-叔丁基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚对照品，加入乙腈-水混合溶液(乙腈和水的体积比为70:30)制得质量浓度分别为10mg/ml、1mg/ml、1mg/ml、0.3mg/ml、50mg/ml、33.33mg/ml的内标储备液。分别取上述内标母液各100ul，配制成混合内标溶液。
3.待测样品液质联用仪负离子模式数据的获取
本实施例中采用agilent1290超高效液相色谱系统(agilent，waldbronn，germany)串联6520q-tof-ms(agilentcorp，usa)。
(1)色谱方法本实施例中采用agilent公司zorbaxeclipseplusc18色谱柱(3.0*150mm,1.8um)，流动相a相为水(0.2％甲酸)，b相为乙腈，梯度洗脱：0-15min，b相5％-100％，流速为0.4ml/min。柱温为60℃，进样量为5ul。
其中，上述物质的百分数均为体积百分数。
(2)质谱方法
本实施例中质谱采用esi离子源，负离子模式采集数据。数据采集范围m/z100-3200。温度为350℃，干燥器流速8l/min，雾化气压力40psi，毛细管电压3500v，碎裂电压175v，锥孔电压65v。
4.提取待测样品m/z＝129.0110,169.0126,153.0191,138.0186,149.0963,205.1593的eic色谱图，测定各内标物的保留时间，见表1
其中，表1为实施例1中九种中药内标物保留时间列表。
5.进行保留时间对齐/校正：qi软件中指定um-1-001号样本参考样本，人工标注5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，间硝基苯酚，4-叔丁基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚的坐标，运行峰对齐程序。
从上述可以看出，该方法可实现预期，进行保留时间对齐/校正。
表1中“-”代表未检出。
本申请中所述的其他生物样本采用上述方法均可进行保留时间对齐/校正。
表1
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。