一种黄芩的鉴定方法及其应用与流程

文档序号：17181692发布日期：2019-03-22 20:57阅读：1305来源：国知局

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种黄芩的鉴定方法及其应用。

背景技术：

黄芩，中药名，为唇形科黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi)的干燥根。主产于我国河北、山西、内蒙古、河南、陕西等地，北方多数省区都可种植。临床应用广泛，常用于湿温、黄疸、泻痢、肺热咳嗽、痈肿疮毒、胎动不安等症。古今均将黄芩分为枯芩与条芩两个规格，且认为疗效不同，功能主治各异。条芩呈圆锥形，表面棕黄色或黄色，断面深黄色；枯芩老根木部枯朽，多中空。枯芩体轻主浮，专泻肺胃上焦之火；而条芩体重主降，专泻大肠下焦之火。条芩、枯芩现已形成商品规格市售。由于黄芩产地分布广泛，规格不同，且临床需求量逐年增加，在经济利益驱动下，导致市场上黄芩来源混乱，品质高低不齐。因此黄芩的质量控制对规范黄芩市场，保证临床治疗效果，具有重要的意义。

中药的物质基础是化学成分，要控制中药材的质量，需要对物质群整体予以控制。化学成分可以通过一定的分析手段和检测技术表征为指纹图谱，指纹图谱的峰代表相应的物质基础，若物质基础成分群相同，所表现的指纹图谱应该一致。目前，指纹图谱是现阶段可以较全面地反映中药材内在质量的有效手段之一。但是指纹图谱研究也存在着诸如基线漂移、色谱峰重叠、背景噪音高、低信号-信噪比等色谱分析常见问题，均在不同程度上限制了指纹图谱在中药质量控制和评价上的应用。化学模式识别利用统计学、数学、信号处理等工具，从化学量测数据推理出物质类的本质属性，进而对物质进行识别和归类。将化学模式识别方法引入中药质量控制和等级质量标准评价中，可用于解决中药指纹图谱中的常见问题，在原料产地、真假鉴别、产品质量控制与分析、品质鉴定等方面发挥重要的作用。然而，如果指纹图谱的数据不全面，可导致化学模式识别不准确。

因此，为了更好的对黄芩质量进行控制，保证临床疗效，需建立全面评价黄芩的质量控制方法。

技术实现要素：

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

本发明提供一种黄芩的鉴定方法，通过该方法可以短时间分析处理大量样本，对黄芩的产地、炮制和外观性状有效判别和区分，为黄芩质量控制及等级质量标准的划分提供方法依据；解决了黄芩检测方法无法从整体上检测和控制其质量的问题

本发明提供了一种黄芩的鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：以黄芩制备得供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：以溶解有黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品的溶液为对照品溶液；

(3)采用hplc分别测定步骤(1)的供试品溶液和步骤(2)的对照品溶液，并分别得到所述供试品溶液和所述对照品溶液的液相色谱；

(4)将步骤(3)得到的液相色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到黄芩指纹图谱；

(5)采用层序聚类分析(hierarchicalclusteranalysis，简称hca)、主成分分析(principalcomponentsanalysis，简称pca)、或偏最小二乘分析(partialleastsquares-discriminationanalysis，简称pls-da)处理步骤(4)得到的黄芩指纹图谱数据，从而对黄芩或其炮制品进行分类鉴别。

在本发明的实施方案中，所述黄芩的样品可收集自不同产地的黄芩及其炮制品。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(1)的供试品溶液的制备包括：将黄芩粉碎后过3号药典筛，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入体积分数为70％-100％的甲醇水溶液(这里，当体积分数为100％甲醇水溶液时该甲醇水溶液为甲醇)，定容至刻度，称定重量，超声处理30min-50min，冷却至室温，用体积分数为70％-100％的甲醇水溶液(这里，当体积分数为100％甲醇水溶液时该甲醇水溶液为甲醇)补足损失的重量，摇匀，离心机4000r/min-6000r/min离心5min-15min，取上清液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。作为优选方案，所述步骤(1)供试品溶液的制备包括：将黄芩粉碎后过3号药典筛，取黄芩粉末0.2g，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入体积分数为80％的甲醇水溶液，定容至刻度，称定重量，超声处理40min，冷却至室温，用体积分数为80％的甲醇水溶液补足损失的重量，摇匀，离心机4000r/min离心10min，取上清液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(2)的对照品溶液的制备包括：精密称取黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，加溶剂制成每1ml含有100μg～300μg黄芩苷、50μg～150μg汉黄芩苷、50μg～150μg黄芩素和10μg～50μg汉黄芩素的对照品溶液。作为优选方案，所述步骤(2)对照品溶液的制备包括：精密称取黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，加体积分数为80％甲醇水溶液制成每1ml含有240μg黄芩苷、100μg汉黄芩苷、100μg黄芩素和30μg汉黄芩素的对照品溶液。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(3)包括设置hplc色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温25℃-35℃，流速为0.8ml/min-1.2ml/min，检测波长250nm-320nm，并开启dad检测；以乙腈为流动相a，以体积分数为0.06％-0.2％磷酸水溶液为流动相b，在体积比为15～85:85～15的范围内梯度洗脱；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5μl～20μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱。

作为优选方案，所述步骤(3)设置hplc色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以c18(4.6mm×150mm，5.0μm)为色谱柱，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测波长为277nm，并开启dad检测；以乙腈为流动相a，以体积分数为0.2％的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，流动相a、b的比例变化为0～15min，a:b为15％:85％→15％:85％；15～30min，a:b为15％:85％→25％:75％；30～55min，a:b为25％:75％→30％:70％；55～85min，a:b为30％:70％→85％:15％；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(4)采用的中药色谱指纹图谱相似度评价系统为2004a版。所述步骤(4)包括：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版，将步骤(3)得到的液相色谱的数据导入、多点校正、数据匹配，分析得到黄芩指纹图谱。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(4)得到的黄芩指纹图谱包括黄芩苷对应的6号峰(s峰)、汉黄芩苷对应的9号峰、黄芩素对应的12号峰和汉黄芩素对应的14号峰，其相对保留时间分别为1.000、1.264、1.526、1.926。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(4)得到的黄芩指纹图谱的共有峰还包括相对保留时间为0.286的1号峰、相对保留时间为0.434的2号峰、相对保留时间为0.603的3号峰、相对保留时间为0.944的4号峰、相对保留时间为0.965的5号峰、相对保留时间为1.114的7号峰、相对保留时间为1.174的8号峰、相对保留时间为1.434的10号峰、相对保留时间为1.465的11号峰、相对保留时间为1.624的13号峰、相对保留时间为1.953的15号峰、相对保留时间为1.965的16号峰。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(4)得到的黄芩指纹图谱如图3所示。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)的所述分类鉴别包括但不限于区别条芩和枯芩、区别不同产地、区分不同炮制品、或区分不同外观性状。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)采用的层序聚类分析为无监督的模式识别模型，或者采用的主成分分析为无监督的模式识别模型，或者采用的偏最小二乘分析为有监督的模式识别模型。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)采用的层序聚类分析为无监督的模式识别模型，以系统聚类树显示聚类结果，用于区别条芩和枯芩、不同产地、不同炮制品、或不同外观性状。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)采用的主成分分析为无监督的模式识别模型，以得分图显示聚类结果，用于区别条芩和枯芩、不同产地、不同炮制品、或不同外观性状。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)采用的偏最小二乘分析为有监督的模式识别模型，绘制模型3d图和vip图(变量投影重要性)，用于区别条芩和枯芩、不同产地、或不同外观性状；还可以权衡每个变量对于识别力的重要性影响，找出化学标记物，为黄芩质量控制及其等级评价划分提供方法依据。

从外，在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)可以同时包括根据上述三种模式识别的结果，相互验证结果的可靠性，从而提高模型的准确度。

第二方面，本发明提供了上述黄芩的鉴定方法在判别和/或区分黄芩的产地、判别和/或区分黄芩炮制、或者判别和/或区分黄芩的外观性状中的应用，或者上述黄芩的鉴定方法在黄芩质量控制、或者黄芩等级质量标准的划分中应用，或者上述黄芩的鉴定方法在黄芩真伪品鉴别中的应用。

本发明取得的技术效果至少包括下列一种或多种：

(1)以不同产地的黄芩得到的黄芩指纹图谱可以代表黄芩的大部分药效成分，能够有效地表征黄芩的质量。

(2)以黄芩的指纹图谱作为一个整体看待，注重各种化学成分的指纹特征峰及相互关系，注重黄芩的整体面貌特征，避免了只测定一、二个指标性化学成分而判定黄芩质量的片面性，又减少了人为主观判断而造成误差的可能性。

(3)本发明的优点是结合化学模式识别，从化学量测数据推理出物质类的本质属性，进行对物质进行识别和归类。化学模式识别结果显示黄芩样本中条芩和枯芩明显聚为两类，临床实用及制剂应用时应注意区分；显示条芩被识别为两类，一类黄芩切片较薄，厚度小于2mm，一类多为未切制药材及切片较厚的条芩，厚度大于3mm；显示黄芩生品可与其炮制品酒黄芩明显区分。提示产地、规格差异和药材净制加工切片、炮制对于黄芩的等级质量标准的建立有重要意义，提示切片的薄厚、黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷含量可作为黄芩等级标准分类依据。

(4)本发明建立的一种黄芩鉴定方法，通过指纹图谱全面反映黄芩内在化学成分的种类和数量，进而反应黄芩的质量；通过化学模式识别对化学体系的测量值与体系状态之间建立的联系，找出样品的特征，进而对样品进行识别和归类。两者联合应用对黄芩不同规格、产地、炮制品的分析与预测能力，为黄芩药材、饮片及其炮制品的质量评价和真伪鉴别提供了新方法，对黄芩产地区分﹑建立全面的质量标准、临床合理用药提供参考。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

图1为4种对照品的hplc色谱图；

图1中，a：黄芩苷对照品，b：汉黄芩苷对照品，c：黄芩素对照品，d：汉黄芩素对照品；

图2为本发明实施例1中测得的黄芩的共有模式图谱；

图2中，6号峰：黄芩苷，9号峰：汉黄芩苷，12号峰：黄芩素，14号峰：汉黄芩素；

图3为本发明实施例1中20个批次黄芩指纹图谱叠加图谱；

图4为本发明实施例3中黄芩生品hca树状图；

图5为本发明实施例3中黄芩生品-炮制品hca树状图；

图6为本发明实施例3中黄芩生品pca得分图；

图7为本发明实施例3中黄芩生品-炮制品pca得分图；

图8为本发明实施例3中黄芩生品pls-da模型3d图；

图9为本发明实施例3中黄芩生品pls-da模型vip图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例用到的仪器及试剂如下：

1、仪器与试药

1.1仪器

十万分之一天平(sartoriusbt125d，赛多利斯科学仪器有限公司)；台式高速离心机(tg16-ws，长沙湘仪离心机仪器有限公司)；高效液相色谱仪(lc-10a，日本岛津公司，dad检测器)；超声波清洗器(kh3200b，昆山禾创超声仪器有限公司)；中药粉碎机(hc-150，黄城高速多功能粉碎机型号)。1.2试药

黄芩苷对照品(批号：170416，含量>98％)、汉黄芩苷对照品(批号：170109，含量>98％)、黄芩素对照品(批号：170324，含量>98％)、汉黄芩素对照品(批号：170320，含量>98％)，以上对照品均购自上海融禾医药科技有限公司。

色谱甲醇、乙腈购自美国sigma公司，色谱磷酸及盐酸购于天津科密欧化学试剂有限公司。所用水为屈臣氏蒸馏水。

共收集20个批次的黄芩样品，经鉴定为唇形科黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi)的干燥根。20个批次的黄芩供试样本基本信息见表1。

表1黄芩供试样本基本信息

共收集了5个批次的黄芩炮制品，经鉴定为酒黄芩。5个批次的酒黄芩供试样本基本信息见表2。

表2酒黄芩供试样本基本信息

实施例1黄芩指纹图谱的建立方法及方法学考察

1、黄芩指纹图谱的建立方法

黄芩指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取以上表1的20个批次不同产地黄芩粉碎后过3号药典筛，取黄芩粉末0.2g，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入体积分数为80％甲醇水溶液，定容至刻度，称定重量，超声处理40min，冷却至室温，用体积分数为80％甲醇水溶液补足损失的重量，摇匀，离心机4000r/min离心10min，取上清液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，加体积分数为80％甲醇水溶液制成每1ml含有240μg黄芩苷、100μg汉黄芩苷、100μg黄芩素和30μg汉黄芩素的对照品溶液；

(3)hplc色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以c18(4.6mm×150mm，5.0μm)为色谱柱，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测波长为277nm，并开启dad检测。以乙腈为流动相a，以体积分数为0.2％磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，流动相a、b的比例变化为0～15min，a:b为15％:85％→15％:85％；15～30min，a:b为15％:85％→25％:75％；30～55min，a:b为25％:75％→30％:70％；55～85min，a:b为30％:70％→85％:15％；

(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱；

(5)将液相图谱导入指纹图谱相似度评价软件(中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版)分析，以nm1药材图谱作为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.1min，采用平均数法计算，多点校正、数据匹配，生成叠加色谱图(见图3)和对照图谱(见图2)。将20批黄芩的指纹图谱与生成的对照指纹图谱进行相似度分析，结果显示20批黄芩的指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.961，见表3。

表320批黄芩的指纹图谱相似度

经与4种对照品比对，确定34.587min峰为黄芩苷(6号峰)、43.612min峰为汉黄芩苷(9号峰)、52.882min峰为黄芩素(12号峰)、66.679min峰为汉黄芩素(14号峰)。其中选取分离度较好，峰面积较大且稳定，保留时间适中的黄芩苷为参照峰(s)。以黄芩苷为参照峰的hplc指纹图谱共确定16个共有峰。以参照峰的相对保留时间为1，计算其它各共有峰的相对保留时间，结果见表4。

表420批黄芩的指纹共有峰相对保留时间

2、指纹图谱方法学考察

2.1精密度试验

取黄芩(nm1)，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例1中色谱条件连续进样6针，得到6张色谱图。以黄芩苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果见表5和表6。

表5黄芩指纹图谱精密度试验考察结果(各共有峰相对峰面积)

表6黄芩指纹图谱精密度试验考察结果(各共有峰相对保留时间)

由表5和表6可知，各共有色谱峰的相对峰面积rsd％<5％、相对保留时间rsd％<2％，说明该方法精密度良好。

2.2重复性试验

取黄芩(nm1)，平行称取6份，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按实施例1中色谱条件分别进样，得到6张色谱图。以黄芩苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果见表7和表8。

表7黄芩指纹图谱重复性试验考察结果(各共有峰相对峰面积)

表8黄芩指纹图谱重复性试验考察结果(各共有峰相对保留时间)

由表7和表8可知，各共有色谱峰的相对峰面积rsd％<5％、相对保留时间rsd％<2％，说明该方法重复性良好。

2.3稳定性试验

取黄芩(nm1)，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按实施例1中色谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h条件进样，得到6张色谱图。以黄芩苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果见表9和表10。

表9黄芩指纹图谱稳定性试验考察结果(各共有峰相对峰面积)

表10黄芩指纹图谱稳定性试验考察结果(各共有峰相对保留时间)

由表9和表10可知，各共有色谱峰的相对峰面积rsd％<5％、相对保留时间rsd％<2％，说明供试品溶液在24h内基本稳定。

实施例2黄芩指纹图谱的多波长定量成分的检测及方法学考察

1、多波长定量成分的检测

黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种药效指标成分的保留时间分别为：34.587min、43.612min、52.882min、66.679min。开启dad检测器进行全波长扫描，比较不同波长条件下各药效指标成分的峰面积，最终选取在277nm下检测黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量。

2、多波长定量成分检测方法学考察

2.1线性考察

精密量取含黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品溶液适量，逐级稀释，配成一系列浓度的对照品溶液，按实施例1中色谱条件进样分析，得到色谱图并记录峰面积。结果表明对照品浓度与峰面积呈良好线性关系。以峰面积为纵坐标(y)，浓度(x)为横坐标，求得的黄芩苷的回归方程：y＝2e+07x-2820.7，相关系数r＝0.9996；线性范围：0.00595mg·ml^-1～0.1904mg·ml^-1；汉黄芩苷的回归方程：y＝2e+07x-11925，相关系数r＝0.9993；线性范围：0.0025mg·ml^-1～0.06mg·ml^-1；黄芩素的回归方程：y＝3e+07x-36680，相关系数r＝0.9997；线性范围：0.0025mg·ml^-1～0.1mg·ml^-1；汉黄芩素的回归方程：y＝2e+07x+4439，相关系数r＝0.9998；线性范围：0.0025mg·ml^-1～0.1mg·ml^-1。

2.2精密度试验

按实施例1的对照品溶液的制备方法制备对照品溶液，按实施例1中色谱条件连续进样6针，得到6张色谱图。计算各特征峰的峰面积及保留时间，并计算rsd值，结果见表11和表12。

表11黄芩多波长定量成分检测精密度试验考察结果(特征峰峰面积)