一种血清中胆固醇的检测方法与流程

本发明属于生物小分子分析检测技术领域，具体涉及一种血清中胆固醇的检测方法。

背景技术：

胆固醇最早是从胆石中发现的，其广泛存在于动物体内，是所有动物细胞膜的基本结构成分，在维持膜结构完整性和流动性方面发挥重要作用，而且合成胆汁酸，维生素d和激素都需要胆固醇做原料。健康人血清中总胆固醇的正常水平一般低于5.2mmol·l^-1。血液中胆固醇水平过高，称为高胆固醇血症，会明显增加冠心病，高血压和动脉粥样硬化等血管疾病的风险。另一方面，胆固醇的缺乏被认为与抑郁症、癌症和脑出血等疾病的出现相关联。随着生活水平的提高，胆固醇异常导致的冠心病、糖尿病和高血压等疾病呈增长趋势，并且胆固醇被世界卫生组织国际癌症研究机构列为3类致癌物。因此，开发一种检测血清中胆固醇含量的方法具有极为重要的意义。

目前开发了多种分析方法用于胆固醇含量的检测，如色谱和电化学结合法，色谱法，电化学法，比色法，等离子体吸收光谱法等。但是大多数方法需要繁琐的实验过程且实验成本高；或者依赖于胆固醇氧化酶的高选择性催化反应进行胆固醇测定，但是此方法中酶易失活导致方法的不稳定性和成本昂贵；或者方法中使用了具有危害性的化学试剂。因此，有必要开发一种选择性高，成本低，绿色环保的方法进一步改善目前方法的缺陷。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种血清中胆固醇的检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种血清中胆固醇的检测方法，包括如下步骤：

(1)将β-cd@aunps、cqds和适量以无水乙醇为溶剂制备的胆固醇储备液混合后，配制不同浓度的胆固醇标准溶液；将荧光激发波长固定在390nm，分别记录不同浓度的胆固醇标准溶液的荧光发射光谱，以荧光发射峰em＝528nm的强度作为定量依据，以荧光恢复效率(f-f0)/f0对不同胆固醇浓度做线性拟合，测定检测限，f0为不加胆固醇的荧光发射峰em＝528nm的强度，f对应不同胆固醇标准溶液的浓度的荧光发射峰em＝528nm的强度；当胆固醇浓度为10-210μmol·l^-1，荧光恢复效率(f-f0)/f0与胆固醇浓度呈现良好的线性关系，获得线性工作曲线y＝0.0052x-0.0139，r²＝0.996，y＝(f-f0)/f0，x为胆固醇浓度；上述β-cd@aunps是以氯金酸(haucl4)溶液为前驱体，以β-环糊精(β-cd)为还原剂和稳定剂，加热回流一步制备而成，上述cqds是以氯化十六烷基吡啶(cpc)溶液为前驱体，通过超声一步法合成；

(2)将新鲜血液于室温下保存过夜，隔天取其中淡黄色的上清液离心，获得血清；在上述血清中加入0～160μmol·l^-1的胆固醇标准溶液，根据步骤(1)的参数进行荧光测定，重复测定至少三次，获得相应的荧光发射峰em＝528nm的强度；

(3)将步骤(3)获得的荧光发射峰em＝528nm的强度代入上述线性工作曲线中，获得血清中的胆固醇浓度。

在本发明的一个优选实施方案中，所述β-cd@aunps的制备方法为：反应容器中先后加入超纯水，0.1mol·l^-1且ph7.0的pbs缓冲液，0.01mol·l^-1的haucl4溶液和0.01mol.l^-1的β-cd水溶液，搅拌均匀后，移入油浴锅中，在100℃下强力搅拌回流60min，溶液颜色由浅黄色变成浅红色最终变为葡萄酒红，待溶液自然冷却后，经0.45μm滤膜过滤后于4℃下保存。

进一步优选的，所述超纯水、pbs缓冲液、haucl4溶液和β-cd水溶液的体积比为35∶5∶1∶10。

在本发明的一个优选实施方案中，所述cqds的制备方法为：往15mmol·l^-1的cpc溶液中加入2.0mol·l^-1的naoh溶液，在超声30min后，用浓盐酸调节溶液ph值至7.0，使反应终止，再经透析袋透析24h后，冷冻干燥得到cqds固体，根据实验需要的浓度将cqds固体重新溶解于水，4℃保存；超声期间溶液颜色由无色变成浅黄最终变成棕黄色。

进一步优选的，所述cpc溶液和naoh溶液的体积比为100∶9。

在本发明的一个优选实施方案中，所述β-cd@aunps的平均粒径分别为24-26nm。

在本发明的一个优选实施方案中，所述cqds的平均粒径分别为2.8-3.2nm。

本发明的有益效果是：本发明不仅能够克服色谱法，电化学法，比色法，等离子体吸收光谱法等技术的缺陷，且具检测线性范围广、灵敏度较高、选择性好等优势。

附图说明

图1为本发明实施例1中(a)β-cd@aunps的透射电子的显微镜(tem)图；(b)单个β-cd@aunps的高分辨透射电子的显微镜(hrtem)图；(c)β-cd@aunps的粒径分布直方图；(d)cqds的tem图和(d)粒径分布直方图。

图2为本发明实施例1中(a)cqds的荧光激发光谱(ex＝390nm)和发射光谱(em＝528nm)，β-cd@aunps的紫外-可见吸收光谱(abs)，插图中1-4和5-8分别为日光下和365nm紫外光照射下的cqds、β-cd@aunps、cqds/β-cd@aunps、cqds/β-cd@aunps/胆固醇；(b)cqds、cqds/β-cd@aunps和cqds/β-cd@aunps中加入60μmol·l^-1胆固醇的荧光光谱。

图3为本发明实施例1中(a)cqds中加入不同浓度的β-cd@aunps后的荧光发射光谱；(b)f0/f与β-cd@aunps浓度的关系曲线(f0为不加β-cd@aunps时cqds的荧光发射峰强度，f为加入不同浓度的β-cd@aunps后荧光发射峰强度，ex＝390nm，em＝528nm)；(c)cqds中加入β-cd@aunps(2ml)前后荧光强度随时间变化曲线；(d)cqds/β-cd@aunps中加入胆固醇(60μmol·l^-1)后荧光强度随时间变化曲线。

图4为本发明实施例1中(a)不同物质对cqds/β-cd@aunps的荧光选择性响应；(b)cqds/β-cd@aunps对胆固醇浓度的荧光标准曲线拟合及相应的比色图像。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1：

1、β-cd@aunps和cqds的制备

β-cd@aunps的制备是以氯金酸(haucl4)溶液为前驱体，以β-环糊精(β-cd)为还原剂和稳定剂，加热回流一步制备β-环糊精修饰的金纳米粒子(β-cd@aunps)。具体步骤如下：烧瓶中先后加入35ml超纯水，5mlpbs缓冲液(0.1mol·l^-1，ph7.0)，1ml的haucl4溶液(0.01mol·l^-1)和10ml的β-cd水溶液(0.01mol·l^-1)，搅拌均匀后，移入油浴锅中，在100℃下强力搅拌回流60min，溶液颜色由浅黄色变成浅红色最终变为葡萄酒红。待溶液自然冷却后，经0.45μm滤膜过滤后于4℃下保存(ph7.0的pbs缓冲溶液(0.1mol·l^-1)配制：将0.68g的kh2po4加入29.1ml的0.1mol·l^-1的naoh溶液中，再用超纯水稀释至100ml)。所制得的β-cd@aunps如图1(a)-(c)所示。

cqds的制备是以氯化十六烷基吡啶(cpc)溶液为前驱体，通过超声一步法合成。主要步骤如下：往100ml(15mmol·l^-1)的cpc溶液中加入9ml(2.0mol·l^-1)的naoh溶液，在超声30min(期间溶液颜色由无色变成浅黄最终变成棕黄色)后，用浓盐酸调节溶液ph值至7.0，使反应终止。再经透析袋(mw≈3500)透析24h后，将溶液冷冻干燥得到碳量子点(cqds)固体，根据实验需要的浓度将cqds固体重新溶解于水，4℃保存。所制得的cqds如图1(d)所示。

如图1所示，上述制备的β-cd@aunps和cqds的颜色分别为葡萄酒红和棕黄色，呈圆球状，平均粒径分别约为25nm和3nm。

2、各物质的光学特性

如图2(a)所示，cqds的荧光发射峰为528nm，与之对称的荧光激发峰为390nm，蓝色曲线为β-cd@aunps的紫外-可见吸收光谱，在528nm有最大吸收，其与cqds的荧光发射峰很好地重合。说明β-cd@aunps能够高效地猝灭cqds的荧光，可能构建荧光共振能量转移体系，cqds为荧光能量供体，β-cd@aunps为荧光能量受体。cqds溶液和β-cd@aunps溶液在日光下分别呈亮黄色和酒红色(图2中插图的1和2)，且在365nm紫外光照射下cqds发出强烈荧光而β-cd@aunps不发光(图2中插图的5和6)。

如图2所示，cqds的荧光发射峰明显，强度大；当加入β-cd@aunps溶液后发生荧光猝灭，此时体系溶液呈淡红色(图2(a)中插图的3)，在365nm紫外光照射下只显示微弱荧光(图2(a)中插图的7)；之后再继续加入胆固醇，cqds的荧光部分恢复(如图2(b))，体系溶液颜色变为暗粉色(图2(a)中插图的4)，在365nm紫外光照射下显示荧光恢复(图2(a)中插图的8)。综上说明β-cd@aunps有效使cqds的荧光猝灭，而胆固醇使cqds的荧光恢复，且过程中伴随着溶液颜色变化。

3、反应条件的优化

如图3(a)所示，cqds的荧光强度随加入的β-cd@aunps的体积的增加而降低，并且在加入β-cd@aunps的体积为0-2000μl时(图3b)时，cqds的荧光强度f0/f与加入β-cd@aunps的体积成良好的线性，当β-cd@aunps体积继续加大时，曲线向上弯曲，说明对cqds的荧光猝灭效率减弱。因此选择取2ml的β-cd@aunps作为荧光猝灭剂和比色显示剂。因为cqds和β-cd@aunps都在溶液ph7左右制备，且在ph7左右稳定。如图3(c)所示，cqds的荧光强度在加入β-cd@aunps后随即猝灭，反应迅速，所以对于荧光猝灭的反应时间可以忽略不计。但加入胆固醇(60μmol·l^-1)后的荧光恢复时间则不可忽略，如图3(d)所示，在加入胆固醇后，cqds的荧光强度随时间延长而不断增加，在40min时荧光强度趋于稳定，荧光恢复过程基本完成，所以选择40min作为cqds/β-cd@aunps体系中荧光恢复的反应时间。

4、cqds/β-cd@aunps对血清中胆固醇的选择性研究

对血清中主要物质进行荧光响应测定，主要包括nacl、kcl、mgcl2、葡萄糖、尿酸、甘氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽(还原型)、抗坏血酸和胆固醇(浓度都为90μmol·l^-1)，测定结果如下图4(a)所示，胆固醇对cqds/β-cd@aunps的荧光恢复效率最为明显，达到1.2左右。总体上cqds/β-cd@aunps对胆固醇选择性高。

5、本实施例的具体检测方法如下：

(1)取上述制备的β-cd@aunps2ml，加入300μl(0.4mg·ml^-1)的cqds，再分别加入适量的胆固醇储备液(用无水乙醇做溶剂，浓度10mmol·l^-1)，配制0，10，30，50，70，90，110，130，150，170，190，210μmol·l^-1的胆固醇标准溶液，用超纯水定容至5ml。荧光激发波长固定在390nm，分别记录加入不同浓度胆固醇标准溶液的荧光发射光谱，以荧光发射峰(em＝528nm)强度作为定量依据。以荧光恢复效率(f-f0)/f0对不同胆固醇浓度做线性拟合(f0为不加胆固醇的荧光发射峰强度，f对应加入不同胆固醇浓度的荧光发射峰强度)，测定该方法的检测限。当胆固醇浓度范围在10-210μmol·l^-1时，荧光恢复效率(y＝(f-f0)/f0)与胆固醇浓度(x)呈现良好的线性关系(r²＝0.996)，y＝0.0052x-0.0139。

(2)动物血清中胆固醇含量测定

从市场上获得新鲜干净的猪血，储存于蓝盖试剂瓶中室温下保存过夜。隔天取出淡黄色上清液离心(4000rpm，6min)，可获得相对纯净的猪血清。根据(1)中的方法加入50μl的猪血清，分别加入0，40，80，160μmol·l^-1的胆固醇标准溶液，定容至5ml，40min后进行荧光测定。所有实验在室温下重复测定三次。

(3)将步骤(2)所得的前后荧光强度值代入步骤(1)中的线性工作曲线，即可获得相应的胆固醇浓度。

该方法对实际猪血清中胆固醇分析测定，结果如表1所示：

表1基于cqds/β-cd@aunps的荧光方法对于猪血清中胆固醇浓度(μmol·l^-1)的测定(n＝3)

综上，本实施例的方法中cqds/β-cd@aunps荧光信号稳定，较其他的荧光探针具有水溶性好和生物毒性低等优势，利用荧光共振能量转移和主客体识别作用协同优势，该方法线性范围广、选择性高、检测限低，可有效克服色谱法，电化学法，比色法，等离子体吸收光谱法等方法存在的缺陷。胆固醇在不同浓度范围内取得线性工作曲线：y＝0.0052x-0.0139，线性范围：10-210μmol·l^-1。实验过程伴随溶液颜色的变化，可进一步开发比色-荧光双通道检测胆固醇的方法。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。