本发明属于药物残留检测领域，特别是一种定性和定量检测猪尿中磺胺类药物残留量的方法。
背景技术：
磺胺类药物(sas)是一类传统的合成抗菌药物，因其抗菌谱广和价廉易得等特点，一直在兽医临床和畜牧业中广泛应用，有研究表明磺胺二甲基嘧啶等科诱发啮齿类动物甲状腺增生或肿瘤，磺胺类药物毒性较高、能破坏人的造血功能，食品中残留半衰期长，对人和环境危害显著。磺胺类抗生素是以对位氨基苯磺酰胺为基本结构衍生出的一类具有抗菌作用的特效药，虽在人类疾病的治疗中起到了重要作用，但过量使用会对人体产生毒副作用，主要表现为毒性损害、变态反应、过敏反应以及致癌、致畸、致突变“三致”效应。随着社会发展和人民生活水平的提高，抗生素的种类和使用量不断增加，因不合理使用而产生不良影响的现象变得日益突出。
本研究建立了猪尿中3中磺胺类药物(磺胺二甲基嘧啶(sm2)、磺胺间二甲氧嘧啶(sdm)、磺胺嘧啶(sd))的超高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法，实验结果可靠，灵敏度高，提高了磺胺类药物的检测效率。
本发明与已有文献和专利相比，具有更高的回收率和更低的检测限及定量限，表现为如下几点：
1、首次对猪尿中磺胺类药物进行检测。
2、空白猪尿添加浓度为4.0、20.0、100.0μg/l时，磺胺二甲基嘧啶方法的平均回收率为87.8％～104％，日内相对标准偏差为2.32％～4.98％，日间相对标准偏差为4.55％～9.16％；空白猪尿添加浓度为4.0、20.0、100.0μg/l时，磺胺间二甲氧嘧啶方法的平均回收率为80.0％～99.6％，日内相对标准偏差为2.88％～5.86％，日间相对标准偏差为5.87％～9.97％；空白猪尿添加浓度为4.0、20.0、100.0μg/l时，磺胺嘧啶方法的平均回收率为92.0％～105％，日内相对标准偏差为3.08％～6.16％，日间相对标准偏差为4.53％～8.99％。
3、采用外标法定量，磺胺间二甲氧嘧啶的检出限(lod)为10.0μg/kg，磺胺二甲基嘧啶的检出限(lod)为20.0μg/kg，磺胺嘧啶的检出限(lod)为5.0μg/kg。
超高效液相色谱(ultraperformanceliquidchromatography\uplc)是分离科学中的一个全新类别，uplc借助于hplc(高效液相色法)的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相实验中。
超高效液相色谱仪优点：
超高效液相色谱法的原理与高效液相色谱法基本相同，所改变的地方有以下几点：
(1)小颗粒、高性能微粒固定相的出现。高效液相色谱的色谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的粒径是5um，而超高效液相色谱的色谱柱，会达到3.5um，甚至1.7um。这样的孔径更加利于物质分离。
(2)超高压输液泵的使用。由于使用的色谱柱粒径减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大。故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵。
(3)高速采样速度的灵敏检测器。
(4)使用低扩散、低交叉污染自动进样器。配备了针内进样探头和压力辅助进样技术；
(5)仪器整体系统优化设计。色谱工作站配备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动转换。
与传统的hplc相比，uplc的速度、灵敏度及分离度分别是hplc的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。
如今，超高效液相色谱仪主要应用于
(1)药物分析如天然产物中复杂组分的分析
(2)生化分析如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品
(3)食品分析如食品中农药残留的检测
(4)环境分析如水中微囊藻毒素的检测
(5)其他如化妆品中违禁品的检测
超高效液相色谱方法的突出优点体现在节省分析时间和溶剂用量上,尤其对基质复杂的痕量组分测定采用该方法以提高分析通量是今后发展的必然趋势。
三重四极杆串联质谱工作原理：
化合物分子在真空条件下受电子流的“轰击”或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带正电荷的离子，这些离子按质荷比(m/z)的大小被收集并记录的图谱。
电喷雾电离(esi)：
样品溶液在电场的作用下形成带高度电荷的雾状小液滴，在向质量分析器移动的过程中，液滴因溶剂不断挥发而缩小，导致表面电荷密度不断增大，当电荷之间的排斥力足以克服液滴的表面张力时，液滴发生裂分，如此反复进行，最后得到带单电荷或多电荷的离子。
三重四极杆串联质谱优点：
(1)不需进行衍生化。
(2)在单个分析中实现确认定量。
(3)在复杂很脏的基体中的低检测限。
(4)提高实验室效率/产出率(使用固相萃取技术)。
(5)更可靠和可值得信赖的测试结果。
(6)质量范围：5-1200amu
(7)分辨率：≤0.4da
(8)灵敏度高
(9)定量重现性好
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种方便、快速、灵敏、准确的检测猪尿中磺胺类药物残留量的方法。
本发明包括下列步骤：
吸取5.00ml试样，置于50ml离心管中，加入5g无水硫酸钠和15ml乙腈溶液，超声提取3min，以5000r/min离心5min。上清液倒入另一离心管中，残渣再加入15ml乙腈，重复上述操作1次。合并提取液，于50℃下氮气吹至近干，准确加入1.00ml溶解残渣，经0.22μm滤膜过滤后，用液相色谱-串联质谱仪测定。
本发明以超高效液相色谱-电喷雾串联质谱作为检测的基本原理，现代超高效液相色谱-电喷雾串联质谱系统配置有化学工作站、计算机和软件系统在内的数据采集与处理系统，可检测猪尿中磺胺类药物残留量的方法。
超高效液相色谱-电喷雾串联质谱分为两个步骤：数据采集与数据处理。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。
标准溶液的配置：
标准储备液：称取适量磺胺类药物标准品，用乙腈分别配制成1.0mg/ml的标准储备液，于-18℃下避光储存。
标准中间液：取上述标准储备液各1ml，用乙腈分别稀释成质量浓度为10.0mg/l的标准中间液，于-18℃下避光储存。
标准混合工作液：取上述标准中间液各1ml，用乙腈稀释成质量浓度为1.0mg/l的标准混合工作液，于-4℃下避光储存。
此法根据选择离子定性，外标法定量。配制磺胺类药物混合标准溶液质量浓度为0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、100.0μg/l的系列标准溶液，，以定量离子峰面积(y)对浓度(x，μg/l)做标准曲线。结果显示，磺胺类药物在0.5～100.0μg/l范围内的线性关系良好(r2＞0.999)。取空白猪尿样品，添加不同质量浓度的磺胺类药物混合标准溶液，按照优化实验条件由高至低的质量浓度进行检测，直至信噪比等于3(s/n＝3)和信噪比等于10(s/n＝10)时，确定猪尿样品中磺胺间二甲氧嘧啶的检出限(lod)为10.0μg/kg，磺胺二甲基嘧啶的检出限(lod)为20.0μg/kg，磺胺嘧啶的检出限(lod)为5.0μg/kg。
取空白猪尿样品，添加磺胺类药物混合标准溶液分别为4.0、20.0、100.0μg/l，然后按照本方法进行样品前处理和测定，每个添加水平测定6次，日内精密度通过1d内测定3个加标水平下的6个平行样品得到，日间精密度为连续6d(每天测定1次)测定3个加标水平下的样品得到，结果显示，磺胺类药物添加浓度为4.0、20.0、100.0μg/l时，磺胺二甲基嘧啶方法的平均回收率为87.8％～104％，日内相对标准偏差为2.32％～4.98％，日间相对标准偏差为4.55％～9.16％；磺胺间二甲氧嘧啶方法的平均回收率为80.0％～99.6％，日内相对标准偏差为2.88％～5.86％，日间相对标准偏差为5.87％～9.97％；磺胺嘧啶方法的平均回收率为92.0％～105％，日内相对标准偏差为3.08％～6.16％，日间相对标准偏差为4.53％～8.99％。精密度和相对标准偏差见表1。
表1空白猪尿中添加磺胺类药物日内和日间精密度及相对标准偏差(n＝6)
试样中磺胺类药物残留量以质量分数x计，数值以微克每千克(μg/l)表示，单点校正按式(1)、(2)计算：
式中：
ci—试样溶液中磺胺类药物浓度(μg/l)；
cs—对照溶液中磺胺类药物浓度(μg/l)；
ai—试样溶液中磺胺类药物峰面积；
as—对照溶液中磺胺类药物峰面积；
x—试样中磺胺类药物的残留量(μg/kg)；
v—样液最终定容体积(ml)；
m—试样质量(g)；
标准曲线校准按式(3)计算：
ci—标准曲线上查得的试样中磺胺类药物浓度(μg/l)；；
v—样液最终定容体积(ml)；
m—试样质量，单位为克(g)。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于两个测定值的算术平均值的20％。
对于样品痕量磺胺类药物检测，取样、样品前处理和质谱条件的优化是检测的基础与关键。
目前，磺胺类药物多采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法，这些方法大部分应用于血液、医药和动物组织中磺胺类药物的测定，而动物尿液中磺胺类药物残留的检测方法未见报道。由于大部分药物是通过尿液排出体外，且猪尿样品可以活体采样，在生猪屠宰前即可快速检测生猪中是否含有金刚烷胺类药物残留，从而达到从养殖源头控制禁用药物使用的目的。因此，研究建立猪尿中磺胺类药物残留的检测方法，对于有效监控该类药物的使用、保障我国动物性食品安全具有重要的意义。
乙腈在沉淀样品中的蛋白质效果方面要优于甲醇和丙酮，因此选用乙腈作为提取溶剂。
质谱条件的优化：
配制1.0mg/l的磺胺类药物，不通过色谱柱直接进入离子源，在esi+模式下分别进行质谱条件的优化。先进行一级质谱图全扫描，确定各目标化合物的母离子，并优化得到源内碎裂电压，然后在选定的源内碎裂电压条件下，对选定的母离子进行子离子扫描，选取丰度相对最强的1对碎片离子作为定量离子，次强的1对或2对碎片离子作为定性离子，并分别对子离子的碰撞能进行优化。最后在mrm模式下分别对雾化气压力、干燥气温度和流量等参数进行优化。优化后的质谱条件见表2。
表2mrm监测模式下磺胺类药物质谱优化条件
*定量离子
为进一步说明本发明的特点和效果，以下对发明做进一步的描述。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例：
吸取5.00ml试样，置于50ml离心管中，加入5g无水硫酸钠和15ml乙腈溶液，超声提取3min，以5000r/min离心5min。上清液倒入另一离心管中，残渣再加入15ml乙腈，重复上述操作1次。合并提取液，于50℃下氮气吹至近干，准确加入1.00ml溶解残渣，经0.22μm滤膜过滤后，用液相色谱-串联质谱仪测定。
设定液相色谱条件为：
色谱柱：eclipseplusc18(rrhd1.8μm，2.1×100mm)。流动相a为0.1％甲酸水溶液；b为乙腈。梯度洗脱程序：0～3.0min，3％～8％b；3.0～7.0min，8％～90％b；7.0～7.1min，90％b～3％b；7.1～9.0min，维持3％b。流速0.20ml/min；柱温30℃；进样体积：5.0μl；
质谱条件：电离模式：电喷雾电离正离子模式(esi+)；检测方式：多反应监测(mrm)；毛细管电压：4000v；离子源温度(tem)：325℃；干燥气温度：300℃；干燥气流量：15l/min；雾化气压力：50psi；鞘气温度：400℃；鞘气流量：12l/min。
当然，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本说明，而并非作为本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。