一种基于多孔材料和质谱技术检测尿液中本周蛋白的方法与流程

本发明属于医疗检测领域，具体涉及基于多孔材料和质谱技术检测尿液中本周蛋白的方法。

背景技术：

纳米材料和质谱技术在医学诊断领域中有着广泛的应用。

本周蛋白(bence-jonesprotein)是指尿液中的免疫球蛋白轻链。恶性增殖的浆细胞产生过量的免疫球蛋白轻链，其量远远超过肾小管重吸收的阈值而出现在病人尿液中。本周蛋白分为lambda和kappa型，分别由染色体2和22编码。由于浆细胞产生kappa链的速度是lambda的2倍，因此正常人血清中kappa:lambda的量为2:1。本周蛋白主要用于诊断b细胞肿瘤如多发性骨髓瘤、淋巴瘤等等。目前临床上用于检测本周蛋白的方法包括免疫固定电泳和免疫比浊法。由于本周蛋白的异质性和抗原抗体反应的交叉性，使得免疫学方法灵敏度和准确性不高。[tatej,bazeleys,sykess,etal.quantitativeserumfreelightchainassay–analyticalissues[j].clinbiochemrev,2009,30(3):131-40.]

纳米孔材料是一类孔径在2-200纳米的多孔材料，具有较大的比表面积。由于其特殊的孔道尺寸，能够快速且有效的吸附生物大分子。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,maldi-tofms)自1980年代发展起来，具有超高灵敏度和特异性，目前已广泛应用于临床实验室诊断。maldi-tofms技术通过对生物分子的分子量进行准确测定，实现生物大分子的鉴定分析。通过分析不同细菌的指纹图谱，maldi-tofms能实现临床微生物快速鉴定。此外，maldi-tofms技术也广泛应用于蛋白质组学研究。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于多孔材料和质谱技术检测尿液中本周蛋白的新方法。本发明方法能实现本周蛋白的快速测试，其特异性强、灵敏度高。

本发明使用多孔材料富集尿液中的本周蛋白，不将蛋白从纳米孔材料中洗脱，用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱技术检测本周蛋白-纳米孔材料复合物。

本发明的技术方案具体如下。

本发明提供一种基于多孔材料和质谱技术检测尿液中本周蛋白的方法，其首先通过具有纳米尺寸孔道的多孔材料富集尿液中的本周蛋白得到本周蛋白-纳米孔材料复合物，再采用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱技术检测本周蛋白-纳米孔材料复合物。

本发明中，当质谱谱图中存在至少两个质谱峰满足第二个峰的质量数是第一个的两倍且两个峰的质量数分别在23000-26000道尔顿和46000-52000道尔顿时，检测结果为本周蛋白阳性。

本发明中，多孔材料的孔道尺寸在2～200nm之间。

本发明中，尿液在1.5～2毫升之间，多孔材料的量为15～20微克。

本发明中，采用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱技术检测时，其基质溶液由阿魏酸和乙腈、甲酸和去离子水组成的混合溶剂配制而成，乙腈、甲酸和去离子水的体积比为33:17:50；阿魏酸和混合溶剂的质量体积比为12.5：1mg/ml。。

和现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明方法具有较强的可操作性和实用性，本发明利用纳米孔材料吸附尿液中的本周蛋白，并通过maldi-tofms技术实现高灵敏度和特异度的检测。经检验该方法的灵敏度可以低至0.5毫克每升尿液中的本周蛋白。

目前仅限于尿液标本的检测，并未涉及其他类型的临床标本。

附图说明

图1:实验基本流程示意图。

图2：5个本周蛋白阳性标本和5个本周蛋白阴性标本的质谱结果。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实例对本发明作进一步的说明,但并不因此对本发明限制在所述的实例范围之内。

实施例中，提供一种基于纳米孔材料和质谱技术检测尿液中本周蛋白的方法，包括以下步骤：

选取合适的纳米孔材料用于本周蛋白的富集。以孔径约100纳米的硅材料为例，其合成方法在于：在35℃下，1.0克p123(peg-ppg-peg,eo20po70eo20)和1.7克硫酸钠加入到30毫升醋酸缓冲溶液(ph＝5.0,ct＝0.02m,ct＝cnaac+chac)，搅拌形成均匀的溶液。再加入1.52克四甲氧基硅烷(tetramethylorthosilicate,tmos)并搅拌5分钟。将混合溶液静置24小时，然后100℃水热法处理24小时。将沉淀通过布氏漏斗过滤，并用去离子水重复冲洗。最后将洗好的沉淀在550℃的温度条件煅烧5个小时，冷却后收集即为具有100纳米孔径的氧化硅材料。[hongningwang,xufengzhou,meihuayu,etal.supra-assemblyofsiliceousvesicles[j].journaloftheamericanchemicalsociety,2006,128(50):15992-3.]

基质溶液的配制：称取12.5毫克的阿魏酸加入到1毫升33％的乙腈，17％甲酸和50％去离子水(v/v)的混合溶液中。

maldi-tofms质谱检测：仪器条件：线性正离子模式，离子加速电压20kv，离子延迟提取时间1000ns，激光强度68％。

实施例1

将医院取得的5个本周蛋白阳性和5个本周蛋白阴性的尿液标本用本发明的方法进行检测。正常的尿液(阴性样本)主要包含一些小分子代谢物(如激素的代谢物，药物代谢分子)和盐类等。分子量大的蛋白不会通过肾小球滤过。分子量小的蛋白(如本周蛋白)虽然会通过肾小球滤过，但肾小球会重吸收>99％的蛋白，因此通常正常人的尿液中基本检测不到蛋白。多发性骨髓瘤患者血液浆细胞会合成过多的本周蛋白，超过肾小管的重回收的阈值，因此可以出现在阳性尿液中。

操作如下：

尿液标本离心：9,560g，5分钟后取上清液。其目的是去除尿液中可能存在的细菌和尿道上皮细胞等。

取1.5毫升尿液上清于离心管内，加入15-20微升的1毫克/毫升的纳米孔材料悬浊液，放在混匀仪上混匀2小时，混匀仪的条件为：850rpm，4℃。

离心：21,500g，5分钟，弃上清，沉淀即为纳米孔材料-本周蛋白复合物。

洗涤：加入1毫升去离子水洗2遍。离心21,500g，5分钟，弃上清。

点靶板：用移液枪将全部样品沉淀点在maldi-tofms配套的靶板上的一个样品点中，并点1.5微升标准蛋白校正液(2毫克每毫升细胞色素c，2毫克每毫升肌红蛋白和6毫克每毫升牛血清白蛋白)于样品点周围。放置室温一段时间，再在干燥的样品点和校正点上覆盖1.5微升基质溶液。待干燥后进行质谱检测。

maldi-tofms分析：质谱检测结果见图2。

图2中a是5个本周蛋白阳性标本谱图，p1-p5是样本编号；b是5个本周蛋白阴性的标本谱图(c1-c5是样本编号)。

对于质谱结果的解读：当谱图中存在至少两个质谱峰满足第二个峰的质量数是第一个的两倍且两个峰的质量数分别在23000-26000道尔顿和46000-52000道尔顿时为本周蛋白阳性，否则为阴性。

实施例2

用上述方法检测48例临床尿液样本：21例本周蛋白阳性标本和27例本周蛋白阴性标本。阳性样本中的本周蛋白含量信息详见表1，阴性样本中的本周蛋白含量其中kappa型低于7.1毫克每升，lambda型低于3.7毫克每升。计算方法的灵敏度和特异度。结果如表2所示：

表1

表2