补体C1抑制剂的检测试剂盒制备方法与流程

本发明涉及检测试剂盒领域，具体地说，涉及一种补体c1抑制剂的检测试剂盒制备方法。
背景技术：
：补体c1抑制剂(c1inhibitor，c1-inh)基因突变导致的c1-inh量的减少和(或)功能缺乏会导致遗传性血管水肿(hereditaryangioedema，hae)的发生。遗传性血管水肿是一种以反复发作的皮下和(或)黏膜下水肿为主要表现的罕见遗传性疾病。水肿为自发性或由某些因素诱发，具有局限性、非凹陷性、自限性的特点。常见受累部位包括颜面部、四肢、消化道及上呼吸道黏膜。遗传性血管水肿是一种常染色体先行遗传病，发病率1/10000～1/50000。由于hae发病率低，临床上易发生误诊、误治，从而导致较高的死亡率。该疾病的诊断除需要了解家族史和根据典型的临床表现外，主要依赖于实验室对c1-inh功能活性检测。近年来，国外较多推荐采用比色法对c1-inh的功能进行检测。但比色法的灵敏度和特异性较低，且操作较复杂，用时较长。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种补体c1抑制剂的检测试剂盒制备方法。为了实现本发明目的，本发明首先提供一种补体c1抑制剂的检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被链霉亲和素的载体、生物素标记的c1-inh反应物、c1-inh标准品、抗人c1-inh抗体偶联的辣根过氧化酶试剂、化学发光底物液a和b以及洗涤液进一步地，所述载体为化学发光板。进一步地，所述抗人c1-inh抗体选自鼠抗人c1-inh单克隆抗体、兔抗人c1-inh多克隆抗体、羊抗人c1-inh的多克隆抗体、鸡抗人c1-inh多克隆抗体中的一种或多种。作为优选，所述抗人c1-inh抗体选自鼠抗人c1-inh单克隆抗体。本发明还提供了所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)包被链霉亲和素的载体的制备：包被链霉亲和素的96孔化学发光板：将包被用包被链霉亲和素加至碳酸盐缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100μl，包被浓度5～15μg/ml，4℃过夜孵育，用磷酸盐缓冲液洗涤微孔板5遍后，再加入含有bsa的磷酸盐缓冲液，37℃孵育2小时后，弃去孔内液体，37℃干燥2小时，于铝箔袋真空包装，放2-8℃保存；(2)生物素标记的c1-inh反应物的制备：用0.1mol/l，ph8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/l，ph8.6的硼酸盐缓冲液，对c1-inh反应物充分透析；然后将c1-inh反应物用0.1mol/l，ph8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/l，ph8.6的硼酸盐缓冲液稀释到1mg/ml备用；用0.2mldmso溶解1mg的nhsb；向1mlc1-inh反应物溶液加入150μlnhsb溶液；在室温下持续搅拌2-4小时；加入9.6μl1mol/lnh4cl，在室温下搅拌10分钟；在4℃，对pbs充分透析，以除去游离的生物素；将样品过1ml的分子筛柱，以pbs缓慢洗脱，收集1ml/管；最后，样品加入叠氮钠及1.0g/lbsa.将结合产物置4℃，避光保存；(3)鼠抗人c1-inh抗体偶联的辣根过氧化酶试剂的制备：a称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中，加入1ml新配的0.06mnaio4溶液，4℃避光孵育30分钟。b孵育结束后加入0.6ml的200mm乙二醇，室温孵育30分钟。c孵育结束后加入5mg鼠抗人c1-inh抗体，混合均匀后装入透析袋中，于2l的ph9.6碳酸盐缓冲液中透析，4℃搅拌过夜。d取出透析液，加入0.5ml的5mg/mlnabh4水溶液，混合均匀后，放4℃孵育2小时，加等量甘油保存。本发明还进一步提供了前述试剂盒的应用：1)在微孔中每孔加入50μl的生物素标记的c1-inh反应物，室温或37℃孵育10min～30min；2)孵育结束后，洗板3次3)将浓度分别为0u/ml、0.05u/ml、0.1u/ml、0.5u/ml、2u/ml、6u/ml、12u/ml的c1-inh校准品各100μl依次加入到微孔板中，然后将100μl样品加入微孔中，室温或37℃孵育30min～60min；4)孵育结束后，洗板5次；5)加入100μl鼠抗人c1-inh抗体偶联的辣根过氧化酶试剂，室温或37℃孵育15min～30min6)孵育结束后，洗板5次；7)加入化学发光底物a液和底物b液各50μl，5min后读数；8)建立校准品曲线，将样本检测孔化学发光值代入校准品曲线，计算出样本中的补体c1抑制剂浓度本发明的有益效果在于：本发明提供了一种化学发光免疫分析法用于c1-inh的检测，达到对补体c1抑制剂疾病的诊断。相比比色法，化学发光免疫分析法，灵敏度和特异性更高，临床上，操作更简单，操作时间更短，能用于全自动或半自动发光免疫分析仪。附图说明图1为试剂盒校准曲线具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1试剂盒的制备(一)化学发光板的制备：将包被用链霉亲和素加至碳酸盐缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100μl，包被浓度5～15μg/ml，4℃过夜孵育，用磷酸盐缓冲液洗涤微孔板5遍后，再加入含有bsa的磷酸盐缓冲液，37℃孵育2小时后，弃去孔内液体，37℃干燥2小时，于铝箔袋真空包装，放2-8℃保存；(二)生物素标记c1-inh反应物的制备用0.1mol/l，ph8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/l，ph8.6的硼酸盐缓冲液，对c1-inh反应物充分透析；然后将c1-inh反应物用0.1mol/l，ph8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/l，ph8.6的硼酸盐缓冲液稀释到1mg/ml备用；用0.2mldmso溶解1mg的nhsb；向1mlc1-inh反应物溶液加入150μlnhsb溶液；在室温下持续搅拌2-4小时；加入9.6μl1mol/lnh4c1，在室温下搅拌10分钟；在4℃，对pbs充分透析，以除去游离的生物素；将样品过1ml的分子筛柱，以pbs缓慢洗脱，收集1ml/管最后，样品加入叠氮钠及1.0g/lbsa.将结合产物置4℃，避光保存；(三)鼠抗人c1-inh抗体偶联的辣根过氧化酶试剂的制备称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中，加入1ml新配的0.06mnaio4溶液，4℃避光孵育30分钟；孵育结束后加入0.6ml的200mm乙二醇，室温孵育30分钟；孵育结束后加入5mg鼠抗人c1-inh抗体，混合均匀后装入透析袋中，于2l的ph9.6碳酸盐缓冲液中透析，4℃搅拌过夜；取出透析液，加入0.5ml的5mg/mlnabh4水溶液，混合均匀后，放4℃孵育2小时，加等量甘油保存。实施例2分析性能评价(一)最低检测限用含5％新生牛血清的pbs溶液作为阴性样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的rlu值(相对发光值)，带入到标准曲线中，计算其浓度平均值(m)和标准差(sd)，得出m+3sd为试剂盒最低检测限。表1：阴性样本浓度值表1可计算出0浓度样本浓度均值x＝0.01325u/ml，sd＝0.002149试剂盒最低检测限x+3sd＝0.019697u/ml(二)线性按试剂盒说明书进行操作，建立标准曲线，使用双对数法(将每一校准品浓度化学发光值和校准品浓度值取对数)进行直线拟合，计算线性相关系数r2。图1可知，线性相关系数为0.9991(三)精密度评价(1)批内精密度将实施例1制备的同一批试剂盒，分别测定低、中、高三种不同浓度的血清，平行检测10次，得出的分析内变异系数为3.85％～6.69％。结果参见表2。表2：批内精密度浓度u/ml测定次数批内偏差(％)0.1106.690.6106.121.2103.85(2)批间精密度将实施例1制备的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定低、中、高三种不同浓度的血清，平行检测10次，每份血清得到30个浓度值，统计分析变异系数为5.13％～8.66％。结果参见表3表3：批间精密度浓度u/ml测定次数批间偏差(％)0.1308.660.6306.361.2305.13(四)稳定性评价对实施例1的试剂盒分别在4℃和37℃放置，置于4℃试剂盒分别于1月、3月、6月、9月、12月和15月取样检测，置于37℃的试剂盒，分别于3天、6天和9天取样检测，结果表明试剂盒的最低检测限、线性、批内精密度、批间精密度等均在正常范围之内，试剂盒有效期可达15个月。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12