本发明属于生物医学、临床检验医学及快速检测技术领域，涉及一种对生物标志物的识别信号转换成可见光色谱的标记方法及应用。
背景技术：
随着老龄化社会到来，骨科疾病对人体的危害程度日显突出，对相关疾病早期诊断、进程掌握的要求也越来越高。病理上对人体骨骼代谢及相关疾病认识清晰，针对骨的生理状态(骨形成与吸收)综合评估是判断骨发育、骨衰减以及骨流失，从而对骨疾病进行诊断分析的基础。其中i型胶原是骨结构中最主要的成分之一，在骨组织中骨基质代谢中，i型胶原被降解，生成的分子片段被释放在血液或尿液中，这些小片段能够有效的反应骨形成与吸收。反映骨形成的标志物片段有i型原胶原羧基端前肽(picp)，反映骨吸收的标志物片段有i型胶原吡啶交联终肽(ictp)与i型胶原羧基端肽(ctx)等等，同时其它类型胶原降解生成的尿吡啶醚(pyd)和脱氧吡啶醚(dpd)也是反映骨吸收的重要指标。因此快速检测血清、尿液中i型胶原的上述分子片段是骨疾病分析诊断的主要方法，也是快速诊断的基础。
在诸多针对i型胶原及其分子片段的检测方法中，基于免疫学分析检测方法是综合评估的重要方法。免疫标记技术(ia)是指在已知抗原或抗体上标记某种易于检测的物质，通过将抗原与抗体的特异性结合，转换成其它信号，检测某些分子的存在与否或浓度大小。由于这一技术使用的标记物种类多样，其中许多产物制备简单，成本低廉，因此它在多种不同的应用领域中具有极大的应用价值。并且不同的标记物转换出的信号也不同，根据标记物不同可将免疫标记技术分为，放射免疫标记技术、酶联免疫标记技术、化学发光免疫标记技术、荧光免疫标记技术以及胶体金免疫标记技术等。这些标记方法共同的问题是不适用于快速检测和半定量分析，特别不适于老龄化社会的社区医院及家庭养老。下面例举已有标记技术存在着的不足之处：
(1)放射免疫标记技术：存在微弱的放射性污染，废料处理难度大；放射性同位素半衰期的存在增大了实验操作难度；
(2)酶联免疫标记技术：酶标记物容易失活；灵敏度不高；反应过程相对复杂；
(3)荧光免疫标记技术：反应过程迅速，但同时易受到光散射以及样品内源性荧光物质的影响；
(4)发光免疫标记技术：需要额外的固相载体，操作过程相对复杂；
(5)胶体金免疫标记技术：灵敏度受影响，技术要高，操作过程困难。
综上所述，针对目前因为标记带来的不利于基层医院及家庭快速诊断方法，该发明基于免疫分析，设计一种新型标记方法，对尿液、血清中i型胶原分子片段的快速诊断、床前诊断(poct)，对小孩、老人尤为重要。对比用各种不同标记与分析方法，采用了一种基于力致变色技术，成为可见光颜色信号的转换方式，并制备成颜色谱图或比色板，适用于对家庭育儿与养老及其它需要简单、快速而又科学判断的地方。
技术实现要素：
本发明的目的在于建立一种新的免疫标记方法，利用力致变色技术，将抗体抗原间特异性结合力转换成为肉眼可见的光信号。这种可见关光信号以颜色变化为特征，从而设计出一种适用于快速检测i型胶原的新型免疫分析技术。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种适用于现场快速检测的免疫标记方法，包括：
利用联乙炔结构单体和磷脂分子聚集体，制备具有力致变色为可见光信号脂质体；
将该脂质体与能够特异性识别待测物的抗体、凝集素或多肽分子修饰在脂质体表面得到生物标记物；
目标待测物与生物标记物反应，根据溶液发生的颜色变化进行定性判断。
所述的联乙炔结构单体选自10,12-二十五碳二炔酸、10,12-二十三碳二炔酸、10,12-二十五二炔-1-醇、2,4-十五碳二炔酸、2,4-十九碳二炔酸、2,4-十七碳二炔酸、10,12-二十七碳二炔酸、10,12-二十五烷二炔酸甲酯、10,12-二十九碳二炔酸、5,7-十六碳二炔酸中之一种。
所述的脂质体通过将联乙炔结构单体的一种或多种溶解于溶剂中，或者将单体与磷脂分子混合后溶解，制备出不同尺寸及形态的脂质体。
优选的，所述的脂质体的具体制备过程为在溶剂中将联乙炔结构单体与不同联乙炔结构单体或磷脂分子混合，配置成溶液并除去溶剂，再加入缓冲液并保持浓度，将该分散液在一定条件下超声震荡后保存。
其中，所述的缓冲溶液选自磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、硼酸盐、巴比妥酸、三羟甲基氨基甲烷碱或醋酸盐缓冲液中的任意一种。
优选的，通过膜过滤的方式，分离所述尺寸形态不同的脂质体，留下尺寸在30～250nm间的光滑球状结构的脂质体。
优选的，所述的脂质体采用注入法或旋转薄膜超声法或氮吹成膜超声法的方法制备。
优选的，针对联乙炔结构单体组装的聚集体，所述的修饰手段选自嵌入、吸附或偶联。其中化学偶联的交联剂选自碳二亚胺、戊二醛、谷氨酰胺转胺酶、京尼平中之一种。
优选的，针对联乙炔结构单体与磷脂分子混合制备的聚集体，所述的修饰手段为将探针分子(配体)嵌入在磷脂分子中得到。
利用本发明方法将不同浓度的抗体装配在脂质体表面，用得到的抗体/脂质体生物标记物检测识别不同浓度的目标物，根据颜色渐变绘制出颜色谱图或比色板。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种生物标记物，所述的生物标记物通过将能够特异性识别待测物的抗体、凝集素或多肽分子装配在联乙炔结构单体和磷脂分子聚集体的表面得到。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种用于标记i型胶原及其相关分子片段的生物标记物，通过联乙炔结构单体与磷脂分子混合制备聚集体，将探针分子嵌入在磷脂分子中得到。
其中，所述的探针分子为i型胶原单克隆抗体、i型原胶原羧基端前肽(picp)单克隆抗体、i型胶原吡啶交联终肽(ictp)单克隆抗体、i型胶原羧基端肽(ctx)单克隆抗体、尿吡啶醚(pyd)单克隆抗体或脱氧吡啶醚(dpd)单克隆抗体。
所述的i型胶原相关分子片段为i型原胶原羧基端前肽(picp)，i型胶原吡啶交联终肽(ictp)、i型胶原羧基端肽(ctx)、尿吡啶醚(pyd)或脱氧吡啶醚(dpd)等。
在本发明的另一方面，一种用于快速检测i型胶原及其相关分子片段的免疫标记方法，将含一定量的i型胶原或相关分子片段的待测血清或尿液样品加入上述生物标记物中，恒温孵育一段时间，观察颜色变化，对照比色板，快速得到目标物浓度大小。
在本发明的另一方面，上述生物标记物作物检测i型胶原及其相关分子片段在纳米传感器中的应用。
在本发明的另一方面，也可以提供一种基于荧光信号转换的新型免疫标记技术。
所述基于荧光信号转换的新型免疫标记技术的使用方法包括：将含一定量的i型胶原分子或相关分子片段的待测血清或尿液样品加入上述生物标记工具中，恒温孵育一段时间，观察混合液颜色变化，该颜色变化受到样品中胶原分子或小分子片段浓度大小的影响，脂质体荧光信号出现转变，利用共聚焦显微镜进行半定量分析。
本发明的有益效果为：
本发明提供一种区别于传统免疫标记技术的新型标记方法，针对当前传统免疫标记技术存在的缺陷，依据免疫识别技术，以及由共轭聚合物在可见光范围内发生力致变色的机理等，建立一种区别于传统免疫标记技术的新型标记手段。本发明具有操作简单，反应迅速，稳定性高，信号易识别的特点，是一种比传统生物标记方法更加高效，更易普及，成本更低廉的新型标记技术。本发明利用抗体、凝集素或多肽分子对对应目标物的特异性识别以及分子聚集体在可见光范围发生力致变色的机理，将该识别信号转变为能够肉眼识别的光信号，从而可以对目标物进行定性与定量分析。
本发明作为一种具备高效识别目标物的新型标记技术，具有简单、快速、稳定、高效的特点；本发明中所设计的新型生物检测识别工具，转变后的信号在可见光范围发生明显的颜色变化，更利于肉眼识别；本发明所设计的新型生物标记技术，相比传统的免疫识别技术，所需成分更少，所耗成本更低，反应过程更快。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
含有联乙炔结构的两亲性单体可以自组装形成脂质体结构，在紫外光照下会发生聚合反应，使得分子间形成含有共轭双键的刚性片段。脂质体表面的双层分子膜结构类似生物膜，在聚合前同时兼备稳定性与流动性的特点。而在成型过程中，因为膜表面存在电荷的关系，使得薄膜在闭合形成脂质体同时易发生团聚现象。由于存在上述两种特点，使得该两亲性单体自组装形成的脂质体，有几种形态尺寸互不相同的结构。在上述结构的脂质体中，尺寸大小在30-250nm，表面结构光滑的球状脂质体具备优秀的力致变色性能。当脂质体表面受到外力作用时，分子间的含有共轭双键结构的刚性片段沿受力方向发生取向，从而使得整个膜结构中的共轭双键的电子云密度发生改变，使其对可见光的吸收发生迁移。在宏观上体现为肉眼可见的颜色转变。因此，该脂质体在受到外力作用时，能够在可见光范围内迅速产生明显的色变，具有优异的信号转变功能。当其用于免疫标记领域时，能有效改善传统免疫标记技术信号识别困难，反应过程慢的缺点。同时，该脂质体在受到外界刺激时会出现荧光信号的转变，同样能够用于免疫标记领域。
此外，由于脂质体表面的双层分子膜结构同时兼备稳定性与流动性的特点，当其用作免疫标记领域时，能够同时起到固相载体与信号转变器的作用。因此，利用免疫标记技术，将能特异性识别目标待测物的抗体、凝集素或多肽分子与待测物结合，再将该信号转变为可见光范围内可肉眼识别的光信号，或者易通过仪器检测的荧光信号，达到定性或半定量快速检测的目的。
本发明所设计的新型标记方法中，所需的生物标记物制备方法如下：
首先将联乙炔结构单体溶解在溶剂中，通过注入法或在55～75℃之间利用薄膜超声法制备出三种不同尺寸及形态的脂质体，交联后避光保存。
通过透析或过滤的方式分离所述尺寸形态不同的脂质体，留下尺寸在30～250nm间的光滑球状结构的脂质体。
利用嵌入、吸附或偶联等装配手段，将该脂质体与能够特异性识别待测物的抗体、凝集素或多肽分子进行组装，得到一种区别于传统免疫标记技术的新型标记工具，避光4℃保存。
其中联乙炔结构单体为10,12-二十五碳二炔酸(10,12-pentacosadiynoicacid)、10,12-二十三碳二炔酸(10,12-tricosadiynoicacid)、10,12-二十五碳二炔-1-醇(10,12-pentacosadiyn-1-ol)、2,4-十五碳二炔酸(2,4-pentadecadiynoicacid)、2,4-十九碳二炔酸(2,4-nonadecadiynoicacid)、2,4-十七碳二炔酸(2,4-heptadecadiynoicacid)、10,12-二十七碳二炔酸(10,12-heptacosadiynoicacid)、10,12-二十五烷二炔酸甲酯(methyl-10,12-pentacosadiynoate)、10,12-二十九碳二炔酸(10,12-nonacosadiynoicacid)、5,7-十六碳二炔酸(5,7-hexadecadiynoicacid)中的任意一种。
脂质体中溶剂为溶液磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、硼酸盐、巴比妥酸、tris碱(三羟甲基氨基甲烷碱)或醋酸盐缓冲液中的任意一种。
装配中的化学偶联是所述偶联剂为碳二亚胺、羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、谷氨酰胺转胺酶、京尼平中的任意一种，反应温度保持在4-37℃之间。
本发明中用于识别目标待测物的新型标记方法的操作手段如下：
将一定量的含有目标待测物的组织、血清或尿液样品加入上述生物标记物中，恒温孵育一段时间，观察溶液颜色变化，该颜色变化受到样品中目标待测物浓度大小的影响，溶液颜色与荧光信号会发生转变，利用紫外-可见光分光光度计或共聚焦显微镜进行半定量分析。
本发明使用了带有联乙炔结构的两亲分子，利用两亲分子的特殊结构，使其自组装形成脂质体，利用交联固定后的聚合脂质体分子主链的特殊结构，当外界应力作用在脂质体表面的分子侧链上时，能够影响到主链上共轭双键上电子云分布，最终导致脂质体发生肉眼可见的颜色变化。利用这种变色性能，将抗体偶联在脂质体表面，与待测分子特异性结合，产生的外力直接作用在聚合物分子侧链，从而导致脂质体颜色变化。通过对比前后比色度的变化可检测待测物的含量。此外，脂质体在受到外界作用力时同样会产生荧光信号的转变，可以通过对比前后荧光强度检测待测物含量。
下面结合本发明的具体实施例对本发明的应用做进一步说明：
实施例1
将10,12-二十五碳二炔酸(10,12-pentacosadiynoicacid,pcda)溶于无水乙醇中，利用薄膜超声法制备出脂质体。制得脂质体溶液中溶剂为pbs缓冲液(10mm)，脂质体浓度为1mm。4℃下避光保存过夜，紫外交联得到蓝色聚合物脂质体。将能特异性识别β异构ctx片段的多克隆抗体溶解在浓度为10mm的pbs缓冲液中，与脂质体溶液混合，加入碳二亚胺(edc)与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(浓度比edc:nhs:liposome＝2:1:1)，将探针偶联在脂质体表面，离心除去溶液中游离的抗体，避光保存。
将6μl浓度为1mg/ml含目标检测物的样品加入，25℃下孵育30分钟，颜色由蓝变红。
实施例2
将10,12-二十九碳二炔酸(10,12-nonacosadiynoicacid)溶于氯仿中与磷脂分子混合，利用注入法制备出脂质体。制得脂质体溶液中溶剂为pbs缓冲液(10mm)，脂质体浓度为0.5mm。4℃下避光保存过夜，紫外交联得到蓝色聚合物脂质体。将能特异性识别ctx片段的多克隆抗体溶解在浓度为10mm的pbs缓冲液中，与脂质体溶液混合，加入质量分数25％的戊二醛，将探针偶联在脂质体表面，离心除去溶液中游离的抗体，避光保存。
将4μl浓度为1mg/ml含目标检测物的样品加入，25℃下孵育30分钟，颜色由白变红。
实施例3
将10,12-二十三碳二炔酸(10,12-tricosadiynoicacid)溶于氯仿中，利用薄膜超声法制备出脂质体。制得脂质体溶液中溶剂为pbs缓冲液(10mm)，脂质体浓度为0.5mm。4℃下避光保存过夜，紫外交联得到蓝色聚合物脂质体。将能特异性识别i型胶原蛋白的多克隆抗体溶解在浓度为10mm的tris缓冲液中，与脂质体溶液混合，加入质量分数25％的戊二醛，将探针偶联在脂质体表面，离心除去溶液中游离的抗体，避光保存。
将6μl浓度为0.5mg/ml含目标检测物的样品加入，25℃下孵育30分钟，颜色由灰变紫。
实施例4
将10,12-二十三碳二炔酸(10,12-tricosadiynoicacid)和2,4-十五碳二炔酸(2,4-pentadecadiynoicacid)溶于氯仿中，利用薄膜超声法制备出脂质体。制得脂质体溶液中溶剂为缓冲液(10mm)，脂质体浓度为0.5mm。4℃下避光保存过夜，紫外交联得到浅蓝聚合脂质体。将能特异性识别i型胶原蛋白的多克隆抗体溶解在浓度为10mm的tris缓冲液中，与脂质体溶液混合，加入质量分数25％的京尼平，将探针偶联在脂质体表面，离心除去溶液中游离的抗体，避光保存。
将6μl浓度为0.5mg/ml含目标检测物的样品加入，25℃下孵育30分钟，颜色由浅蓝变紫。
实施例5
将10,12-二十五烷二炔酸甲酯(methyl-10,12-pentacosadiynoate)和2,4-十五碳二炔酸(2,4-pentadecadiynoicacid)及磷脂分子混溶于氯仿中，利用薄膜超声法制备出脂质体。制得脂质体溶液中溶剂为缓冲液(10mm)，脂质体浓度为0.3mm。4℃下避光保存过夜，紫外交联得到无色聚合脂质体。将能特异性识别i型胶原蛋白的多克隆抗体溶解在浓度为10mm的tris缓冲液中，与脂质体溶液混合，加入质量分数20％的京尼平溶液，将探针偶联在脂质体表面，离心除去溶液中游离的抗体，避光保存。
将6μl浓度为0.5mg/ml含目标检测物的样品加入，25℃下孵育30分钟，颜色由无色变红。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。