一种中药材中的菊粉型低聚糖的快速定量检测方法与流程

本发明属于中药化学成分分析技术领域，具体涉及一种中药材中的菊粉型低聚糖的快速定量检测方法。

背景技术：

菊粉型低聚糖是天然的生物活性物质，被誉为二十一世纪健康新糖源，被广泛应用于食品、保健品和药品中。菊粉型低聚糖分子是由d-呋喃果糖经β(1→2)糖苷键链接而成的线性直链多糖，通常末端带有一个葡萄糖残基(菊粉型低聚糖结构式见图1)，聚合度(degreeofpolymerization，dp)为2～60，其中平均聚合度dp≤9的菊粉型低聚糖又称为短链菊粉。菊粉型低聚糖的分子式表示为gfn，其中g代表终端葡萄糖分子，f代表果糖分子，n代表果糖的单位数。菊粉型低聚糖的空间构型独特，其分离和定量分析一直是研究的热点和难点问题，以往的研究报道中，分离体系复杂，耗时长，能够同时定量测定的成分少。目前，未见有对中药材中的菊粉型低聚糖gf2至gf11成分进行同时定量研究的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种中药材中的菊粉型低聚糖的快速定量检测方法。

本发明所提供的中药材中的菊粉型低聚糖的快速定量检测方法，包括如下步骤：

1)用甲醇水溶液将对照品溶解，得到对照品混合储备液，备用；取所述对照品混合储备液，用所述甲醇水溶液稀释，配制成一系列各对照品浓度已知的标准溶液，备用；

2)将中药材样品干燥、粉碎、过筛，用甲醇水溶液超声提取，离心，收集上清液，过滤，得到供试品溶液，备用；

3)采用超高压液相色谱(ultraperformanceliquidchromatography，uplc)串联蒸发光散射检测器(evaporativelightscatteringdetector，elsd)，分别对步骤1)中配制的一系列各对照品浓度已知的标准溶液进行检测，记录色谱图，测定峰面积，绘制标准曲线；在同样的条件下，对步骤2)中得到的供试品溶液进行检测，记录色谱图，测定峰面积，根据上述标准曲线，得到中药材中各成分的含量。

上述方法步骤1)中，所述对照品为d-果糖、d-葡萄糖、蔗糖、gf2、df3、gf4、gf5、gf6、gf7、gf8、gf9、gf10、gf11标准品；

所述甲醇水溶液具体可为体积浓度50％(v/v)的甲醇水溶液；

所述对照品混合储备液中，d-果糖、d-葡萄糖、蔗糖、gf2、df3、gf4、gf5、gf6、gf7、gf8、gf9、gf10、gf11标准品的质量浓度依次可为2.300、2.575、2.475、1.372、1.425、1.681、1.656、1.606、1.412、1.450、1.638、0.984、0.998g·l^-1。

所述稀释可依次按照1、2、3、4、8、16、32、64、128、256倍进行稀释。

上述方法步骤2)中，所述中药材样品可为：含菊粉型低聚糖类成分的中药材，具体可为：巴戟天生药材、巴戟天通货(均去芯)、巴戟肉、盐巴戟天等样品。

所述干燥具体可为冷冻干燥。

所述过筛具体可为过40目筛。

所述甲醇水溶液具体可为体积浓度50％的甲醇水溶液；

所述超声提取在室温下进行，时间可为20-40min，具体可为30min。

所述离心的条件可为12000g离心10min。

所述超声提取可进行多次，具体可为2次。

所述过滤可为经0.2μm微孔滤膜过滤。

上述方法步骤3)中，色谱条件如下：

色谱柱：acquityuplcbehamidec18(2.1x100mm，1.7μm)；

流动相a：乙腈(v/v，0.1％氨水)，流动相b：水(v/v，0.1％氨水)；

洗脱梯度：0～1.0min(98％→70％a，即，在0～1.0min内流动相由98％的乙腈2％的水逐渐变为70％的乙腈30％的水)，1.0～3.0min(70％→70％a)，3.0～6.5min(70％→55％a)，6.5～10.0min(55％→55％a)，10.0～10.5min(55％→98％a)，10.5～15min(98％→98％a)；

柱温35℃；

流速：400μl·min^-1；

进样量：0.6μl；

检测器漂移管温度：50℃；

载气(n2)压力：40psi。

步骤3)中采用外标法进行定量分析。

所述标准曲线以峰面积积分的自然对数值为纵坐标，对照品含量的自然对数值为横坐标进行绘制。

各成分的保留时间(t/min)如下：果糖3.051；葡萄糖3.675；蔗糖3.668；gf24.456；gf35.104；gf45.653；gf56.114；gf66.528；gf76.879；gf87.187；gf97.459；gf107.704；gf117.921。

上述方法在含菊粉型低聚糖类成分的中药的原材料、饮片以及中药生产过程中的质量控制及质量监测中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明利用超高压液相色谱(ultraperformanceliquidchromatography，uplc)串联蒸发光散射检测器(evaporativelightscatteringdetector，elsd)，在弱碱性条件下，建立了中药材中的果糖、葡萄糖、蔗糖以及gf2至gf11的菊粉型低聚糖成分同时定量检测的方法，并成功对中药材巴戟天及其饮片中的果糖、葡萄糖、蔗糖以及gf2至gf11的菊粉型低聚糖成分进行了定量测定。该方法准确、快速、简便，该方法适用于含菊粉型低聚糖类成分的中药原材料、饮片以及中药生产过程中的质量控制和质量监测。

附图说明

图1为菊粉型低聚糖结构式。

图2为果糖、葡萄糖、蔗糖及gf2-gf11等13种糖类成分的uplc色谱图，其中，a：混合对照品溶液；b：巴戟天药材；c：巴戟肉；d:盐巴戟天；1，果糖；2，葡萄糖；3，蔗糖；4，gf2；5，gf3；6，gf4；7，gf5；8，f6；9，gf7；10，gf8；11，gf9；12，gf10；13，gf11。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.仪器

watersacquityi-classuplc^tm超高压液相色谱仪，acquityuplcbehamidec18(2.1x100mm，1.7μm)色谱柱，外接柱温箱、四元溶剂管理器、真空脱气机、自动进样器、蒸发光散射检测器(elsd)、empower3工作站(waters公司，美国)，mettlertoledoxs105du分析天平(梅特勒公司，瑞士)，kq-100de超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，milli-q纯水系统(millipore公司，美国)，离心机(eppendorf公司，德国)，0.2μm注射器式滤器(pall公司，美国)。

2试剂

2.1试剂

色谱级乙腈、甲醇(merck公司，德国)；氨水(色谱级，德国merck公司)；超纯水；d-果糖(批号g-f056-161216,hplc≥98％)，d-葡萄糖(批号p-f012-170222,hplc≥98％)，蔗糖(批号z-f038-160715，hplc≥98％)，gf2(批号z-f039-170608)，gf3(n-016-161216，hplc≥98％)，gf4(批号11965-201501)，hplc≥98％)，均由北京融城鑫德科技有限公司提供，以上对照品纯度≥98％；gf5(bp4063)、gf6(bp4064)，gf7(bp4065)，gf8(bp4066)，gf9(bp4067)，购自成都普瑞法科技开发公司，含量≥98％；gf10(batchnumber:e1110-07ec2,hpaecanalysis：69.4％dp11,9.5％dp10,17.6％dp12,2.7％dp13)，gf11(batchnumber:e1204-10ec27,hpaecanalysis：75.2％dp12,16.1％dp11,4.1％dp13)，购自elicityl-oligotech.com,france。

fruβ(2-1)-[fruβ(2-1)]n-α(2-1)glc

图1为菊粉型低聚糖结构式。

2.2对照品溶液制备

分别精密称取对照品d-果糖、d-葡萄糖、蔗糖、gf2、df3、gf4、gf5、gf6、gf7、gf8、gf9、gf10、gf11，加50％甲醇水溶液，超声溶解，配制成质量浓度分别2.300、2.575、2.475、1.372、1.425、1.681、1.656、1.606、1.412、1.450、1.638、0.984、0.998g·l-1的对照品混合储备液，室温避光保存，备用。

2.3标准溶液制备

取对照品混合储备液，用50％甲醇水溶液，依次按1、2、3、4、8、16、32、64、128、256倍稀释，配成编号依次为ⅰ～ⅺ的10个浓度的标准溶液，室温避光保存，备用。

3.方法

3.1色谱条件

通过优化条件实验，优选出色谱条件如下：流动相a为乙腈(v/v，0.1％氨水)，流动相b为水(v/v，0.1％氨水)；洗脱梯度：0～1.0min(98→70a)，1.0～3.0min(70→70％a)，3.0～6.5min(70％→55％a)，6.5～10.0min(55％→55％a)，10.0～10.5min(55％→98％a)，10.5～15min(98％→98％a)，柱温35℃，流速400μl·min^-1；进样量0.6μl；检测器漂移管温度50℃，载气(n2)压力40psi。

3.2供试品溶液制备

市场采购的巴戟天(均去芯)、巴戟肉、盐巴戟天等样品，因糖含量较高，正常情况下，用打粉机不易粉碎，本实验粉碎条件经优化，选出供试品溶液制备方法如下：冷冻干燥后、再常规粉碎、过40目筛，精密称取0.1000g，加10.0ml50％甲醇水溶液(v/v)，室温超声30min，12000g离心10min，取上清液，重复提取1次，合并上清液，经0.2μm微孔滤膜过滤，室温避光保存，备用。

3.3定量分析

empower3工作站进行色谱峰数据处理，外标法定量分析，以峰面积积分的自然对数值为纵坐标，含量的自然对数值为横坐标，绘制工作曲线，spss18进行统计分析。

4.结果

4.1方法学考察

4.1.1系统适用性实验

分别取ⅲ号混合对照品溶液、巴戟天样品溶液，按3.1色谱条件，分别进样，记录色谱图。结果显示，在选定的分析条件下，混合对照品以及样品中的果糖、葡萄糖、蔗糖、以及gf2至gf11菊粉型低聚糖成分分离完全(见图2)。

4.1.2线性关系考察

取ⅰ～ⅷ号8个浓度的标准混合溶液，按3.1色谱条件进样，测定峰面积，以峰面积积分的自然对数值为纵坐标，对照品含量的自然对数值为横坐标，绘制标准曲线。结果表明：果糖在35.94～766.67μg/ml范围内具有良好的线性关系，计算得回归方程为：y＝1.9422x-0.407，(r²＝0.991)。通过对不同浓度的对照品溶液检测，分别按3倍信噪比(s/n)和10倍s/n，考察果糖的检测下限(lod)和定量下限(loq)，分别为10.78μg·ml^-1，35.94μg·ml^-1；同样，通过检测不同浓度的混合对照品溶液，测出另外12种待测成分的线性范围、线性方程，检测下限和定量下限，结果见表1。结果表明，13种待测成分在相应的线性范围内线性关系良好。

表1果糖、葡萄糖、蔗糖及gf2-gf11等13种糖类成分的线性范围和定量下限

4.13精密度检查

取ⅲ号标准混合溶液，按3.1色谱条件，连续重复进样6次，计算峰面积和相对标准偏差(rsd)，结果见表2。结果表明，对于13种待测成分的相对标准偏差在1.67％～3.81％之间，方法的精密度良好。

表2果糖、葡萄糖、蔗糖及gf2-gf11等13种糖类成分的精密度实验结果

4.14重复性试验

准确称取同一样品粉末6份，按3.2制成供试品溶液，在按3.1色谱条件测定，计算各待测成分的含量(mg·g^-1)。结果见表3。结果显示，巴戟天样品中果糖、葡萄糖、蔗糖及gf2-gf11等13种糖类成分含量的相对标准偏差在0.62％～4.76％之间，方法的重复性良好。

表3样品中果糖、葡萄糖、蔗糖及gf2-gf11等13种糖类成分的重复性实验结果

4.15稳定性试验

准确称取巴戟天样品，按3.2制备样品溶液，3.1色谱条件下，分别于0，4，12，24、36、72h进样测定，记录保留时间，计算峰面积及相对标准偏差，结果见表4。结果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖及gf2-gf11等13种糖类成分相对标准偏差小于5.00％，在72小时内稳定。

表4样品中果糖、葡萄糖、蔗糖及gf2-gf11等13种糖类成分的稳定性实验结果

4.16回收率试验

准确称取同一个巴戟天样品9份，每份0.1g，精密加入对照品，按3.2制备样品溶液，3.1色谱条件下进样测定，计算回收率，回收率＝(c-a)/b*100％，a为巴戟天样品中相应成分的含量，b为加入对照品的量，c为实测值)，结果见表5，样品中果糖、葡萄糖、蔗糖及gf2-gf11等13种糖类成分的回收率在98.59％-103.67％之间，回收率的相对标准偏差在0.33％～2.85％之间。

表5样品果糖、葡萄糖、蔗糖及gf2-gf11等13种糖类成分的回收率

4.2结果

取各不同来源的巴戟天样品，按项方法制备成样品溶液，按照3.1项色谱条件，测定样品中果糖、葡萄糖、蔗糖及gf2-gf11等13种糖类成分种成分的含量，定量测定结果见表6。

表6不同来源的巴戟天样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、gf2～gf11含量测试结果(mg·g^-1)

注：广西苍梧18个批次，广西岑溪16个批次，福建南靖15个批次，福建永定18个批次；广东高要20个批次，广东德庆60个批次，广东郁南60个批次；巴戟肉购自广东高要、郁南、德庆，共30批次；盐巴戟天购自河北安国药材市场，共10批次。

4.讨论

低聚糖在氨基柱上的保留时间受流动相中水相的比例影响，随着聚合度dp的增加，一方面低聚糖与水形成更多的氢键，保留时间更短；同时，随着水相比例的增加，削弱了低聚糖与氨基柱填料之间的氢键结合能力，低聚糖的保留时间更短。综合考虑低聚糖成分分离效果和实际实验控制，本研究通过优化分离条件，选择水相比例为30％～45％进行梯度洗脱，在10min内，实现了果糖、葡萄糖同分异构体的完全分离，以及与蔗糖、gf2～gf11的菊粉型低聚糖的完全分离，分离效果好、时间短，定量测定结果准确、可靠。该方法适用于含菊粉型低聚糖类成分的中药的原材料、饮片以及中药生产过程中的质量控制及质量监测。