用于同时检测复合乳化剂中3种乳化剂的方法与流程

本发明涉及一种分析检测
技术领域：
，尤其涉及高效液相色谱分析检测，具体是指一种用于同时检测复合乳化剂中3种乳化剂的方法。
背景技术：
：乳化剂是一种具有亲水基团和亲油基团的表面活性剂，能够使原本不相溶的两相溶解在一起形成稳定均匀的乳状液。在饲料中添加乳化剂后，饲料中的油脂能与水互溶形成细密油滴，增加了脂肪酶的作用面积，大大加强了油脂的消化吸收能力。通常商品化的乳化剂产品并不是由单一的乳化剂组成，为更好的乳化性能，几种乳化剂按照合适的比率组成复合乳化剂。复合乳化剂是由超过2种表面活性剂组成的乳化剂，不同乳化剂之间相互配合，加强乳化剂对油脂的乳化能力。因此，如何有效的监控复合乳化剂的主成分和含量，已成为饲料公司、养殖户以及饲料添加剂公司的关注热点。目前，关于乳化剂的检测方法很多，最常见的有高效液相色谱、毛细管气相色谱法、紫化学滴定法、凝胶色谱法等，但这些检测方法大多是针对单一乳化剂进行测定，并且都是一些非常规检测器和色谱柱，例如elsd检测器、凝胶色谱柱等，检测灵敏度也有待提高。因此，当需要检测复合乳化剂中的乳化剂成分时，需要采用各自的前处理技术和分析方法，检测费时、费力，并且消耗资金大。也有采用高效液相色谱串联质谱法检测多种乳化剂的报道，但这种分析仪器造价高昂，不便于在我国饲料行业普遍推广。针对当下同时检测多种乳化剂物质时前样品前处理步骤繁杂、分析周期长、工作效率低、检测花费大以及设备不普及的情况，另外大部分都是单独检测某种乳化剂含量，且检测设备设施不普及检测费用高，本发明提供了一种用于同时检测复合乳化剂中3种乳化剂的检测方法。技术实现要素：本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种处理样品方式简单、分析速度快、灵敏度高、结果准确可靠、所用设备常见易得、适用于复合乳化剂中单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯和蔗糖脂肪酸酯含量的检测的方法。为了实现上述目的，本发明提供了一种用于同时检测复合乳化剂中3种乳化剂的方法，具体如下：所述的复合乳化剂中的3种乳化剂分别为吐温80、单硬脂酸甘油酯和蔗糖脂肪酸酯，所述的方法包括步骤：(1)、制备系列混合标准品工作溶液、制备待检测样品溶液；(2)、在预设色谱条件下，将步骤(1)中的系列混合标准品工作溶液注入高效液相色谱仪中，进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据各乳化剂所测峰面积的大小与相应浓度的对应关系绘制相应乳化剂的标准曲线；(3)、在步骤(2)中的预设色谱条件下，将步骤(1)中的待检测样品溶液注入高效液相色谱仪中进样分析，以保留时间定性，根据步骤(2)中所得的各乳化剂的标准曲线，定量计算所述的样品溶液中3种乳化剂的浓度和含量。较佳地，所述的步骤(1)中的系列混合标准品工作溶液中的吐温80具有1.00mg/ml、2.00mg/ml、3.00mg/ml、5.00mg/ml、10.00mg/ml的浓度梯度，所述的系列混合标准品工作溶液中的单硬脂酸甘油酯具有4.00mg/ml、8.00mg/ml、12.00mg/ml、20.00mg/ml、40.00mg/ml的浓度梯度，所述的系列混合标准品工作溶液中的蔗糖脂肪酸酯具有10.00mg/ml、20.00mg/ml、30.00mg/ml、50.00mg/ml、100.00mg/ml的浓度梯度。较佳地，所述的步骤(1)中制备系列混合标准品工作溶液具体包括步骤：(1-1)制备混合标准品储备液：分别称取精确至0.0001g的0.5g吐温80标准品、精确至0.0001g的2.0g单硬脂酸甘油酯标准品、精确至0.0001g的5.0g蔗糖脂肪酸酯标准品于50.00ml容量瓶中，用四氢呋喃完全溶解，并用四氢呋喃定容至刻度，所述的混合标准品储备液中3种乳化剂的浓度分别为10.00mg/ml、40.00mg/ml、100.00mg/ml；(1-2)制备系列混合标准品工作溶液：分别准确量取1.00ml、2.00ml、3.00ml、5.00ml、10.00ml所述的混合标准品储备液至10ml容量瓶中，用四氢呋喃定容，混匀，现配现用。较佳地，所述的步骤(1)中制备待检测样品溶液的前处理方法为：采用四氢呋喃为溶剂溶解，使待检测样品中难溶于水的组分单硬脂酸甘油酯和蔗糖脂肪酸酯充分溶解，用四氢呋喃稀释成相应浓度的溶液，用0.45μm的有机微孔滤膜过滤，收集滤液，作为待检测样品溶液。较佳地，所述的步骤(1)中制备待检测样品溶液具体包括：(1-3)、称取精确到0.0001g的蔗糖脂肪酸酯样品5.0g，于50.00ml的容量瓶中，用四氢呋喃溶解，摇晃2min，静置10min，以保证充分溶解，继续加入四氢呋喃至刻度，加盖，摇匀，取部分上清液过0.45μm有机相滤膜后作为样液；(1-4)、称取精确到0.0001g的吐温80和单硬脂酸甘油酯样品1.0g，于50.00ml的容量瓶中，用四氢呋喃溶解，摇晃2min，静置10min，以保证充分溶解，继续加入四氢呋喃至刻度，加盖，摇匀，取部分上清液过0.45μm有机相滤膜后作为样液。较佳地，所述的方法中的预设色谱条件具体为：色谱柱：反相c18，规格250mm×4.6mm，5μm；流动相：流动相a：甲醇；流动相b：水；梯度洗脱程序如下：时间流动相a流动相b0min80205min80205.1min1000色谱柱温度：30±1℃；流速：1.0ml/min；运行时间：15min，后运行时间：10min；进样体积：10μl。较佳地，所述的方法中使用的检测器为紫外检测器，紫外检测波长为220nm。较佳地，所述的步骤(2)中吐温80的标准曲线的线性回归方程为：y＝356.81x+15.68，吐温80的保留时间为10.7min；单硬脂酸甘油酯的标准曲线的线性回归方程为：y＝16.92x+53.22，单硬脂酸甘油酯的保留时间为11.7min；蔗糖脂肪酸酯的标准曲线的线性回归方程为：y＝6.4173x+2.1988，蔗糖脂肪酸酯的保留时间为13.4min。较佳地，所述的步骤(2)中所得到的各乳化剂的标准曲线的线性回归方程相关系数大于0.999。本发明的用于同时检测复合乳化剂中3种乳化剂的方法的有益效果为：1)能够对复合乳化剂进行定性和定量，为复合乳化剂成分和含量的准确判定和快速检测提供科学依据；2)使用的分析仪器为高效液相色谱仪—紫外检测器，相对于高效液相色谱串联质谱仪-elsd检测器等造价高昂的仪器，更加普及，更利于检测方法的应用；3)使用的色谱柱为常用的c18反相色谱柱，相对于凝胶色谱柱等不常用且价格昂贵的色谱柱，更加普及和利于检测；4)操作简单，检测结果准确可靠、重复性好，25分钟内即可完成3种乳化剂含量的检测，检测效率高；5)待检测样品的前处理采用四氢呋喃溶解，确保难溶于水的组分的充分溶解，更能保证检测结果的准确性。附图说明图1为本发明的检测方法中混合标准品工作溶液的高效液相色谱图。图2为本发明的检测方法中待检测样品1的高效液相色谱图。图3为本发明的检测方法中待检测样品2的高效液相色谱图。图4为本发明的检测方法中待检测样品3的高效液相色谱图。具体实施方式为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。1、试剂和材料甲醇：色谱纯；四氢呋喃：分析纯；聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯(吐温80)标准品：纯度≥98％；单硬脂酸甘油酯标准品：纯度≥98％；蔗糖脂肪酸酯标准品：纯度≥98％。待检测样品1、待检测样品2、待检测样品3分别取自上海某公司的3种饲用复合乳化剂产品。2、仪器和设备实验室常用仪器设备；分析天平：感量0.0001g；有机相微孔滤膜：孔径0.45μm；高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器或紫外检测器；进样瓶：1.5ml。3、溶液的配制混合标准品储备液的配制：分别称取0.5g(精确至0.0001g)聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯、2.0g(精确至0.0001g)单硬脂酸甘油酯、5.0g(精确至0.0001g)蔗糖脂肪酸酯标准品于50.00ml容量瓶中，用四氢呋喃完全溶解，且用四氢呋喃定容至刻度；该混合标准品储备液中3种乳化剂的浓度分别为10.00mg/ml、40.00mg/ml、100.00mg/ml；该溶液于4℃条件下储藏，保存期3个月。混合标准品工作溶液的配制：分别准确量取1.00ml、2.00ml、3.00ml、5.00ml、10.00ml混合标准配储备液至10ml容量瓶中，用四氢呋喃定容，混匀，此为混合标准品工作溶液。该系列混合标准品工作液中，聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯的浓度梯度为1.00mg/ml、2.00mg/ml、3.00mg/ml、5.00mg/ml、10.00mg/ml；单硬脂酸甘油酯的浓度梯度为4.00mg/ml、8.00mg/ml、12.00mg/ml、20.00mg/ml、40.00mg/ml；蔗糖脂肪酸酯的浓度梯度为10.00mg/ml、20.00mg/ml、30.00mg/ml、50.00mg/ml、100.00mg/ml；其中，该混合标准品工作溶液现配现用。待检测样品的配制：待检测样品的前处理方法为：用四氢呋喃溶解，使样品中难溶于水的组分单硬脂酸甘油酯和蔗糖脂肪酸酯充分溶解，用四氢呋喃稀释成相应浓度的溶液，用0.45μm的有机微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品溶液；根据该前处理方法分别配制待检测样品1溶液、待检测样品2溶液、待检测样品3溶液。其中，样品1、样品2为市场上已有的两种复合乳化剂，样品3为已知浓度的复合乳化剂。样品1、样品2中除了含有本发明要检测的蔗糖脂肪酸酯、吐温80和单甘酯外，还含有一些其他组分的乳化剂，样品1和样品2的设置主要用于对比说明在其他组分干扰的情况下也能准确的检测出组分含量，进一步确定本发明方法的准确性；样品3中仅含有需要检测的3中乳化剂，以证明本发明方法可以同时检测这三种组分的含量。其中，为响应蔗糖脂肪酸酯的待检测样品的配制为：称取待检测样品5.0g(精确到0.0001g)于50.00ml的容量瓶中，用四氢呋喃溶解，摇晃2min，静置10min，以保证样品充分溶解。继续加入四氢呋喃至刻度，加盖，摇匀。取部分上清液过0.45μm有机相滤膜后作为样液，供hplc测定使用；为响应聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯(吐温80)和单硬脂酸甘油酯的待检测样品的配制为：称取待检测样品1.0g(精确到0.0001g)于50.00ml的容量瓶中，用四氢呋喃溶解，摇晃2min，静置10min，以保证样品充分溶解。继续加入四氢呋喃至刻度，加盖，摇匀。取部分上清液过0.45μm有机相滤膜后作为样液，供hplc测定使用。4、预设色谱条件色谱柱：zorbaxeclipseplus反相c18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：流动相a：甲醇；流动相b：水；梯度洗脱程序如下：时间ab0min80205min80205.1min1000流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；色谱柱温度：30±1℃；运行时间：15min，后运行时间：10min；进样体积：10μl。5、绘制标准曲线分别取系列混合标准品工作溶液，按照预设色谱条件进行色谱分析测定；以各乳化剂的峰面积对其所相应的质量浓度进行线性回归，各线性回归方程所对应的曲线即为相应乳化剂的标准曲线。所述的混合标准品工作溶液的高效液相色谱图如图1所示，在图1所示的色谱图中从左至右分别为吐温80、单甘酯、蔗糖脂肪酸酯，保留时间依次为10.7min、11.7min、13.4min；所述的3种乳化剂对应的线性回归方程及相关系数r2见表1，方程中y即为相应乳化剂所对应的峰面积，x即为乳化剂的质量浓度。表16、测定待检测样品在相同的色谱条件下，分别精密量取待检测样品1溶液、待检测样品2溶液、待检测样品3溶液10μl，注入液相色谱仪，进行梯度洗脱和检测，以表1中的混合标准品工作溶液作多点校准，用色谱峰面积分值定量。其中的定量计算公式为：式中，x为：待检测样品溶液中聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯(吐温80)、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯的含量，以质量分数表示；c为：由标准曲线得出的待检测样品溶液中聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯(吐温80)、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯的浓度，mg/ml；v为：待检测样品溶液总体积，ml；m为：待检测样品的质量，g。待检测样品1溶液、待检测样品2溶液、待检测样品3溶液的高效液相色谱图分别见图2、图3、图4。待检测样品1、2、3中的3种乳化剂检测结果见表2。表27、本发明检测方法的验证(1)重复性精密量取待检测样品3溶液注入液相色谱仪检测，连续检测5次，计算各乳化剂测得含量的相对标准偏差(rsd)，结果见表3。表3(2)准确度在样品1中，通过加入不同量的各乳化剂原料，配成6个已知样，进行样品1中乳化剂的加标回收实验，在相同的色谱操作条件下，定量分析、计算，测得各个乳化剂原料的回收率如表4所示。表4备注：聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯(吐温80)、单硬脂酸甘油酯(单甘酯)、蔗糖脂肪酸酯(蔗糖酯)采用了本发明的用于同时检测复合乳化剂中3种乳化剂的方法，1)能够对复合乳化剂进行定性和定量，为复合乳化剂成分和含量的准确判定和快速检测提供科学依据；2)使用的分析仪器为高效液相色谱仪—紫外检测器，相对于高效液相色谱串联质谱仪-elsd检测器等造价高昂的仪器，更加普及，更利于检测方法的应用；3)使用的色谱柱为常用的c18反相色谱柱，相对于凝胶色谱柱等不常用且价格昂贵的色谱柱，更加普及和利于检测；4)操作简单，检测结果准确可靠、重复性好，25分钟内即可完成3种乳化剂含量的检测，检测效率高；5)待检测样品的前处理采用四氢呋喃溶解，确保难溶于水的组分的充分溶解，更能保证检测结果的准确性。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。当前第1页12