C26:0-酰基肉碱作为脑型X-ALD疾病筛查标志物的用途的制作方法

本发明属于医学检测领域，具体涉及c26:0-酰基肉碱的新用途。

背景技术：

x连锁肾上腺脑白质营养不良(x-linkedadrenoleukodystrophy,x-ald)是一种最常见的过氧化物酶体病。该病是由于位于x染色体上的致病基因abcd1发生突变，导致患者细胞内的过氧化物酶体无法对饱和超长链脂肪酸(vlcfas)进行β氧化，致其在血液、脑、脊髓、肾上腺皮质等器官和组织内大量聚积，引起神经系统脱髓鞘和肾上腺皮质萎缩或发育不良等而致病。x-ald男性发病率大概为1/21000，女性发病率为1/14000。

x-ald临床表现复杂多样，最常见的表现形式有两种：儿童脑型ald和成年肾上腺脊髓神经病型ald，各占大约40％。①儿童脑型ald的临床表现最严重，患者基本都为男性，发病年龄通常为3～10岁之间，表现为进行性行为、认知和运动功能倒退，初期表现为注意力不集中、记忆及学习能力下降、视力及听力功能障碍、行走不稳等。部分患者伴有肾上腺功能不全的症状。大部分患儿病情进展迅速，逐渐出现肢体痉挛性瘫痪、共济失调，2～4年内发展到完全瘫痪，呈植物人状态或死亡。青少年和成年脑型ald病例发病的几率远远低于儿童脑型ald。②大部分男性x-ald患者在20～40岁之间病情都发展为肾上腺脊髓神经病型ald(amn型ald)，患者表现为进行性双下肢痉挛性瘫痪，括约肌功能障碍和性功能丧失，部分患者有肾上腺功能受损。还有一部分患者同时伴随有脑部神经受损，除上述症状外，这部分患者还有人格改变、认知功能倒退等症状且病情进展迅速。

女性患者基本都为杂合子携带者，随着年龄的增长，临床症状越来越明显，大部分在40～50岁之间表现为脊髓神经病型ald，主要临床表现为轻至中重度痉挛性瘫痪、括约肌功能障碍和深浅感觉异常，病情进展较缓慢。女性患者极少有脑部受累和肾上腺功能不全。

目前，x-ald尚无特别有效的药物治疗。对于已经有肾上腺功能不全症状的x-ald患者进行必要的肾上腺皮质激素替代治疗，能够起到对症治疗的效果，但无法改善神经系统的症状，也无法改变神经系统病变的进程；口服罗伦佐油(lorenzo’soil)及低脂饮食，能够将x-ald患者血浆中的vlcfas在4周内降到正常水平，但这种疗法对于脑型ald患者没有显著效果；同种异体造血干细胞移植或者骨髓移植是目前唯一能够阻止x-ald病情进展，改善疾病预后的治疗方法，主要对儿童脑型ald患者治疗有效，该方法需要在患者神经症状明显产生之前进行实施治疗才有效，时间窗口较短，在疾病早诊断早干预情况下，能够提高患儿的生存质量和延长寿命。因此早期诊断和筛查就非常重要，一些发达国家如美国多个州已经将x-ald纳入新生儿遗传疾病筛查列表中。

目前临床上应用的x-ald疾病的诊断方法主要是结合临床症状、生化代谢肾上腺功能检测、神经影像学及基因检测等方法。生化方法检测患儿血浆中vlcfas含量是否增高，该方法由于比较耗时无法对新生儿进行大规模早期筛查，该方法也会造成15-20％的女性携带者假阴性。2006年，美国科学家发现c26:0溶血卵磷脂酰胆碱(c26:0-lpc)可以作为生物标志物来筛查x-ald疾病，随后该方法得到进一步完善并在2015年左右开始在美国一些州得到临床应用。2016年，荷兰阿姆斯特丹大学斯蒂芬研究组在10例成年amn型ald病人血液中发现c26:0-酰基肉碱含量增加(plosone.11(4):e0154597)，但随后该研究组在新生儿样本研究中又认为c26:0-酰基肉碱不适合作为一个生物标记物用来筛查x-ald疾病(molgenetmetab.122:209-215)，作者在该论文的摘要部分有明确说明此结论。儿童脑型ald是目前唯一通过干细胞移植能够得到显著疗效的x-ald疾病亚型，这也是x-ald疾病能够被纳入早期筛查的重要原因之一。但到目前为止，关于x-ald早期筛查的研究并没有专门针对脑型ald病例。为了能够对脑型ald，尤其是儿童脑型ald有更精准的筛查和诊断，我们需要对脑型ald疾病进行更有效的筛查和诊断。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种脑型x-ald的早期筛查试剂盒，以便于为今后的脑型x-ald诊断和治疗提供指导。

为此，本发明公开了c26:0-酰基肉碱在制备脑型x-ald早期筛查试剂盒中的用途。更优选为制备儿童脑型x-ald检测试剂盒中的用途。

c22:0-酰基肉碱和c26∶0-酰基肉碱在制备脑型x-ald早期筛查试剂盒中的用途。更优选为制备儿童脑型x-ald检测试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还公开了一种儿童脑型x-ald的早期筛查检测方法，包括下列步骤：

采集检测患者血液，制备成待检血片；

待检血片经串联质谱检测，定量c22:0-酰基肉碱和c26∶0-酰基肉碱；

如果c26:0-酰基肉碱浓度超过0.03μm或者c26:0/c22:0-酰基肉碱的浓度比值超过3.18，则可以判定疑似脑型ald疾病，需要进一步确诊；

进一步地，所述脑型x-ald为儿童脑型x-ald。

本发明首次发现c26:0-酰基肉碱在制备脑型x-ald筛查检测试剂盒中用途，同时对7例患者和3496例健康新生儿的血样进行超长链酰基肉碱和超长链溶血卵磷脂酰胆碱比较分析，结果发现c26∶0-酰基肉碱是理想的生物标志物用来筛查脑型ald病人，同时c26∶0/c22∶0-酰基肉碱比值也是较好的筛查指标，为脑型x-ald检测，尤其是儿童脑型x-ald进行早期筛查提供新的选择。

附图说明

图1正常对照样本和脑型ald病人样本串联质谱分析的离子强度对比。

图2超长链酰基肉碱和超长链溶血卵磷脂酰胆碱在正常样本和脑型ald病人样本中的分布比较。

具体实施方式

检测方法

样本来源上海市儿童医院新筛中心收集到7例脑型ald病人样本，病人年龄在2-8岁，都是男性，其中有4例都有视力下降或视力障碍，1例表现精神发育迟缓，所有病例都进行了mri检查，均显示有脑白质营养不良变化。我们得到5例病人具有vlcfas分析结果，另外2例病人因其它原因我们没有得到该分析结果。在5例结果中，c26∶0-vlcfa,c26∶0/c22∶0-vlcfa和c24∶0/c26∶0-vlcfa都超过正常值，其中有2例病人的c24∶0-vlcfa也超过正常值。7例病人的abcd1基因测序结果显示，该基因都发生错义突变或者移码突变。总之，这7例病人确诊为脑型ald病人。我们从上海市儿童医院新筛中心收集到3496例健康新生儿血样作为对照。所有血样都从受试者脚后跟采取，滴到schleicher&schuell903型滤纸上，每个受试者采集3个血斑(dbs)，室温晾干，封口保存在-20℃。

化学试剂甲醇、乙腈、甲酸和水都是色谱纯，购自thermofisher公司；分析纯草酸购自sigma-aldrich公司。同位素内标d3-c26∶0-肉碱和d4-c26∶0-lpc分别购自剑桥同位素实验室和avantipolarlipids公司，未标记的c26∶0-肉碱购自larodanfinechemicalsab公司。c26∶0-lpc质控品来自美国疾病控制与预防中心，c26∶0-肉碱质控品按照标准流程自己制备。

样品预处理dbs萃取溶液通过混合甲醇、草酸和水而得到。稳定同位素内标首先充分在1毫升dbs萃取液中，然后取适当的量加入到dbs萃取溶液中。我们取每个样本的1/8英寸(约3.2毫米)直径的dbs分别放置于96孔板的每个孔中，然后用移液器吸取125微升含有同位素内标的dbs萃取液加入到每个孔中，用薄膜把孔覆盖，放置到恒温(45℃)摇床(700±100rpm)上萃取30分钟，萃取液随后被转移到另外一个96孔板中，用铝箔覆盖，准备上机做串联质谱分析。

串联质谱分析我们使用watersxevotqd质谱仪在正电离模式下进行分析。自动进样器对每个样品吸取20微升，吸取的样品在四元泵的带动下，进入流动相，最后进入到电离腔。流动相的组成为：84％乙腈、16％水和0.1％甲酸。流动相的流速为：0-0.16分钟，0.24毫升每分钟；0.16-1.15分钟，0.009毫升每分钟；1.15-1.5分钟，0.6毫升每分钟，随后流速提高到0.12毫升每分钟直到下一次样品进样。喷雾电压设定为+3.5千伏。脱溶剂温度设定为350℃。去溶剂气体流速为800升每小时。碰撞气体和鞘气分别为氩气和氮气。加热的毛细管温度维持在120℃。多反应检测(mrm)模式收集数据。对超长链酰基肉碱的mrm参数为：测定的四种肉碱的子离子m/z都为85.0，c20∶0-肉碱的母离子m/z为456.5，c22∶0-肉碱的母离子m/z为484.5，c24∶0-肉碱的母离子m/z为512.5，c26∶0-肉碱的母离子m/z为540.5，d3-c26∶0-肉碱的母离子m/z为543.5。离子驻留时间为0.025秒，锥孔电压为75伏，碰撞能为35电子伏特。对超长链溶血磷脂酰胆碱的mrm参数为：测定的四种超长链溶血磷脂酰胆碱的子离子m/z为104.1，c20∶0-lpc的母离子m/z为552.4，c22∶0-lpc的母离子m/z为580.4，c24∶0-lpc的母离子m/z为608.4，c26∶0-lpc的母离子m/z为636.4，d4-c26∶0-lpc的母离子m/z为640.4。同样，离子驻留时间为0.025秒，锥孔电压为75伏，而碰撞能为33电子伏特。超长链酰基肉碱和超长链溶血磷脂酰胆碱的定量通过masslynx4.0软件里面的neolynx模块来完成。

由于c20∶0-、c22∶0-、c24∶0-和c26∶0-肉碱的分子结构和化学性质非常类似，所以它们使用同一个内标化合物d3-c26∶0-肉碱来定量，及使用同一个质控品，即含有c26∶0-肉碱的质控品来保证分析的稳定性。同样的道理，c20∶0-、c22∶0-、c24∶0-和c26∶0-lpc也使用同一个内标化合物d4-c26∶0-lpc及同一个包含c26∶0-lpc的质控品来定量及控制不同次分析之间的稳定性。结果

上海市儿童医院与上海骋鹏科技有限公司合作，对收集到的7例儿童脑型ald病人和3496例健康新生儿的血样进行超长链酰基肉碱和超长链溶血卵磷脂胆碱(超长链lpc)串联质谱定量分析，从质谱图(图1)上可以看出，脑型ald病人血样中c24∶0-酰基肉碱、c26∶0-酰基肉碱、c24∶0-lpc和c26∶0-lpc的浓度相对于正常组的样本显著升高。我们对这四种代谢物及c24∶0/c22∶0-酰基肉碱、c26∶0/c22∶0-酰基肉碱、c24∶0/c22∶0-lpc和c26∶0/c22∶0-lpc这四种代谢物浓度比值在正常人和脑型ald病人样本中的分布进行了比较研究。研究结果如图2和表1所示，从这两组图中，我们可以看到c26∶0-酰基肉碱及c26∶0/c22∶0-酰基肉碱能够非常清楚地把脑型ald病人与正常人分开，而其他代谢物浓度及比值都不能完全把脑型ald病人与正常人分开。我们取各自正常对照组的平均值加5倍标准偏差值作为检测阈值来筛查，结果如表2所示，c26∶0-酰基肉碱及c26∶0/c22∶0-酰基肉碱能够完全检出所有阳性病例，灵敏度为100％，而且能够保证假阳性率为0％。c24∶0-酰基肉碱及c24∶0/c22∶0-酰基肉碱分别能够检出5个和4个阳性病例，灵敏度分别为71.4％和57.1％，假阳性率为0％。c26∶0-lpc能够检出4个阳性病例，同时有8个假阳性，灵敏度和假阳性率分别为57.1％和0.229％。c26∶0/c22∶0-lpc和c24∶0-lpc都只能检出1个阳性病例，分别有4个和18个假阳性。c24∶0/c22∶0-lpc指标连1个阳性病例都没有检测出来，却有7个假阳性，灵敏度和假阳性率分别为0％和0.2％。综上所述，c26∶0-酰基肉碱和c26∶0/c22∶0-酰基肉碱对于筛查脑型ald病人是非常有临床应用价值的生物标志物。

表1超长链酰基肉碱和超长链lpc在正常对照和脑型ald病人中的统计分布

表2超长链酰基肉碱和超长链lpc在筛查脑型ald疾病的性能比较^*

^*注：检出阈值设定为mean+5sd。

荷兰阿姆斯特丹大学斯蒂芬研究组在对c26:0-酰基肉碱和c26:0-lpc作为筛查生物标志物进行正常-病例比较时，所采用的病例没有进行更精细分类；在其采用纽约州67个新生儿阳性病例时，其判断标准是新生儿血液c26:0-lpc浓度高于阈值0.24μm为阳性，没有经过进一步确诊，根据表1我们知道这个阈值会带来很多的假阳性，是不科学的。他们基于这些病例得出结论c26:0-酰基肉碱不适合作为x-ald病新生儿筛查生物标志物。而我们采用的7例儿童脑型ald病例是经过基因检测、生化分析vlcfas、脑mri及结合临床症状确认的脑型ald病例，因而我们的研究结果更为可靠，更正了该研究组在新生儿样本研究中认为c26:0-酰基肉碱不适合作为一个生物标记物用来筛查x-ald疾病(molgenetmetab.122:209-215)的错误结论。

需要指出的是，c26∶0-酰基肉碱和c26∶0/c22∶0-酰基肉碱只能用作筛查作用，而不能够对脑型ald疾病进行最终诊断，因为对于其它一些过氧化物酶体疾病如过氧化物酶体生物发生障碍、双功能蛋白缺乏症等，c26∶0-酰基肉碱的浓度也会升高。另外酰基肉碱在体内的浓度容易受到饮食差异的影响，如有研究表明，长期食用配方奶粉的婴儿体内的肉碱水平明显高于母乳喂养的婴儿。因此，在筛查出阳性结果之后，需要再根据疑似病人的症状结合其它检测方法如内分泌检查、影像学检查和基因检测，最后给出一个明确的诊断结果。采用c26∶0-酰基肉碱和c26∶0/c22∶0-酰基肉碱作为筛查标志物，另外一个好处是相对于超长链lpc，它们更容易整合到目前已经广泛用于临床的遗传代谢疾病筛查试剂盒中，因为这种试剂盒中已经包含了中、长链酰基肉碱的检测。

图1正常对照样本和脑型ald病人样本中超长链酰基肉碱与超长链lpc质谱离子强度对比。(a)超长链酰基肉碱和超长链lpc的分子结构式。(b)正常对照样本的质谱离子强度。(c)脑型ald病人样本的质谱离子强度。

图2超长链酰基肉碱和超长链lpc在正常样本和脑型ald病人样本中的分布比较。(a)c26∶0-酰基肉碱的分布；(b)c26∶0/c22∶0-酰基肉碱的分布；(c)c24∶0-酰基肉碱的分布；(d)c24∶0/c22∶0-酰基肉碱的分布；(e)c26∶0-lpc的分布；(f)c26∶0/c22∶0-lpc的分布；(g)c24∶0-lpc的分布；(h)c24∶0/c22∶0-lpc的分布。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。