一种检测烟用香精中16种多环芳烃的方法与流程

本发明涉及一种检测多环芳烃的方法，尤其是一种检测烟用香精中16种多环芳烃的方法。

背景技术：

多环芳烃（pahs）是由2~7个苯环组成的芳香族化合物，是环境中广泛存在的一类重要的持久性有机污染物，具有致畸和致突变性。许多国家都将其列入优先研究和控制的致突变性和致癌性重要环境污染物。环境中多环芳烃可通过大气沉降或根茎吸收等途径进入植物并在体内蓄积，进而通过食物链的传递对人类健康构成潜在威胁。2005年，fao/who下属食品添加剂联合专家委员会对pahs进行了风险评估，认为荧蒽、芘、苯并(a)芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(g,h,i)芘、二苯并(a,h)蒽和茚并(1,2,3-cd)芘具有致癌活性。目前世界各国对多环芳烃都有严格限制，美国环境保护署将16种多环芳烃列入优先控制污染物名单。我国对水、食用油、熏烤肉和粮食中的苯并芘也有严格限量规定，并相应制订了水质、食用油、食品中多环芳烃的测定标准。

多环芳烃的检测分析一般采用液相色谱法、气相色谱-质谱联用法，近年来也有使用三重四极杆质谱检测的报道。《gb5009.265-2016食品安全国家标准食品中多环芳烃的测定》中规定了液相色谱法和气相色谱-质谱法两种方法。

气相色谱-质谱法的定性能力强于液相色谱法，但对多环芳烃的定量能力不如液相色谱。标准中的液相色谱法采用荧光检测器检测，少数多环芳烃没有荧光效应或荧光效应微弱导致一些组分灵敏度较差。

已有文献对于多环芳烃的测定多见于水质、土壤、食品、烟气等，对于烟用香精中多环芳烃的测定鲜有报道。烟用香精是一类重要的烟用添加剂，许多烟用香精来自天然提取物。针对烟用香精含糖含水量高的特点，急需一种检测烟用香精中多种多环芳烃的方法。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提出一种检测烟用香精中16种多环芳烃的方法，该方法是采用正己烷超声提取，基质分散固相萃取净化，超高效液相色谱检测，进而建立了简便的烟用香精中16种多环芳烃的分析方法，以期为烟用香精的安全评价提供技术支撑。本发明的技术方案具体如下：

一种检测烟用香精中16种多环芳烃的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1）、样品处理

称取样品到离心管中，加入正己烷进行超声提取，然后离心，取上清液在定量浓缩仪上浓缩近干，加乙腈复溶，然后转移至基质分散固相萃取净化管，进行涡旋振荡，再离心，取上清液待分析；

步骤（2）、超高效液相色谱双波长分析

分析条件如下：

色谱柱：agilentzorbaxeclipsepah，2.1×100mm，1.8μm；流动相：a为水，b为乙腈；洗脱程序：0min60%a，11min0%a，14min0%a，15min60%a，16min60%a；流速：0.4ml/min；柱温：30℃；进样量：2μl；检测器波长：220nm和240nm。

相关标准中多环芳烃的测定推荐使用荧光检测器。荧光检测器灵敏度一般高于可变波长检测器，但灵敏度与组分性质有关，如多环芳烃中的萘荧光效应较低，苊烯没有荧光效应。由于16种多环芳烃的发射波长各不相同，因此标准方法在测定时必须设定波长程序使用7组激发波长和发射波长，操作相对繁琐。本发明分别在220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm处测定16种多环芳烃的响应，结果发现萘、苊、芴、1,2-苯并蒽、苯并(b)荧蒽、二苯蒽和1,12-苯并芘等7种多环芳烃在220nm波长下吸收最大，其次是240nm，其它波长较小；菲、蒽和苯并(k)荧蒽等3种多环芳烃在240nm波长下吸收最大，其次是220nm，其它波长较小；苊烯在230nm吸收最大，其次220nm，再次240nm；荧蒽在250nm吸收最大，其次220nm，再次240nm；芘和茚并(1,2,3-cd)芘在250nm吸收最大，其次240nm，再次220nm；屈260nm最大，其次220nm，再次240nm；苯并芘260nm最大，其次250nm,再次220nm。

测定多环芳烃时，一般使用非极性或弱极性有机溶剂或混合溶剂。由于烟用香料含水量较高，使用正己烷易于提取充分，减少水溶性干扰物，且易于分层浓缩。因此实验采用正己烷作为提取液。

烟用香精中一般不同程度地含有糖类物质和色素等，而目前广泛使用的基质分散固相萃取填料n-丙基-乙二胺(psa)，可通过弱阴离子交换或极性作用，能够有效除去样品中糖、色素、脂肪酸及其它有机酸，很好地净化样品。本发明采用了商品化的基质分散固相萃取净化管，样品处理方便快捷，处理效果好。

进一步地，所述的基质分散固相萃净化管包括25mgpsa粉末、50mgc18粉末和100mg无水硫酸镁。

进一步地，步骤（1）中，称取10g样品到50ml离心管中，加入12ml正己烷，超声提取30min，然后4000r/m离心5min，取上清液10ml在定量浓缩仪上浓缩近干，加乙腈复溶至1ml，然后转移至基质分散固相萃取净化管，2500r/m涡旋振荡2min，再10000r/m离心5min，取上清液进行分析。

进一步地，16种多环芳烃的线性范围介于0.02μg/ml~10μg/ml，相对标准偏差为1.2%~5.7%，定量限为0.3μg/kg~2μg/kg。

进一步地，多环芳烃包含萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、1,2-苯并蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并[a]芘、二苯蒽、1,12-苯并芘和茚并(1,2,3-cd)芘。

与现有技术相比，本发明的有益效果具体如下：

（1）本发明建立了烟用香精中萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、1,2-苯并蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并[a]芘、二苯蒽、1,12-苯并芘、茚并(1,2,3-cd)芘等16种多环芳烃含量的超高效液相色谱双波长分析方法。样品采用正己烷超声提取，基质分散固相萃取净化后，使用可变波长检测器在220nm和240nm处双波长检测。16种多环芳烃的线性范围介于0.002μg/ml~10μg/ml，3个水平加标平均回收率在84.1%~114%之间，相对标准偏差为1.2%~5.7%，定量限为0.3μg/kg~2μg/kg。该方法灵敏、准确，适用于烟用香精中16种多环芳烃的含量分析。

（2）本发明的样品处理方法为首创，不仅简单快速，而且使得后期分析时间短，仅16分钟，仅使用可变波长检测器双波长检测即可分析，且定量限优于现有的荧光检测器和气相色谱-质谱联用仪。

附图说明

图1是16种多环芳烃在220nm和240nm处的色谱图；

其中，1、萘；2、苊烯；3、苊；4、芴；5、菲；6、蒽；7、荧蒽；8、芘；9、1,2-苯并蒽；10、屈；11、苯并(b)荧蒽；12、苯并(k)荧蒽；13、苯并芘；14、二苯蒽；15、1,12-苯并芘；16、茚并(1,2,3-cd)芘。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

材料与试剂

正己烷、乙腈：美国fisher公司产品。

标准品：16种多环芳烃混合标准溶液购自sigma-aldrich公司，浓度1000μg/ml，包含萘（naphthalene）、苊烯（acenaphthylene）、苊（acenaphthene）、芴（fluorene）、菲（phenanthrene）、蒽（anthracene）、荧蒽（fluoranthene）、芘（pyrene）、1,2-苯并蒽（benzo[a]anthracene）、屈（chrysene）、苯并(b)荧蒽（benzo[b]fluoranthene）、苯并(k)荧蒽（benzo[k]fluoranthene）、苯并[a]芘（benzo[a]pyrene）、二苯蒽（dibenz[a,h]anthracene）、1,12-苯并芘（benzo[ghi]perylene）、茚并(1,2,3-cd)芘（indeno[1,2,3-cd]pyrene）等16种多环芳烃。

基质分散固相萃净化管：含25mgpsa粉末、50mgc18粉末、100mg无水硫酸镁，美国agilent公司产品。

仪器与设备

watersacquity超高效液相色谱仪（配备可变波长检测器，美国waters公司），talboys多管旋涡混合仪（美国talboys公司），jp-080超声波清洗机（40khz，深圳洁盟清洗设备有限公司），eppendorf5804台式离心机（德国eppendorf公司），horizondryvap定量浓缩仪（美国horizon公司）。

实施例1

本实施例的检测烟用香精中16种多环芳烃的方法，具体包括如下步骤：

步骤（1）、样品处理

称取10g样品到50ml离心管中，加入12ml正己烷，超声提取30min，然后4000r/m离心5min，取上清液10ml在定量浓缩仪上浓缩近干，加乙腈复溶至1ml，然后转移至基质分散固相萃取净化管，2500r/m涡旋振荡2min，再10000r/m离心5min，取上清液上机分析。

步骤（2）、超高效液相色谱双波长分析

分析条件如下：

色谱柱：agilentzorbaxeclipsepah（2.1×100mm，1.8μm）；流动相：a为水，b为乙腈；洗脱程序：0min60%a，11min0%a，14min0%a，15min60%a，16min60%a；流速：0.4ml/min；柱温：30℃；进样量：2μl。检测器波长：220nm和240nm。

萘、苊烯、苊、芴、荧蒽、1,2-苯并蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并芘、二苯蒽和1,12-苯并芘等11种多环芳烃选择220nm作为检测波长。菲、蒽、芘、苯并(k)荧蒽、茚并(1,2,3-cd)芘等5种多环芳烃选择240nm作为检测波长。结果如图1所示。

以乙腈配制系列浓度的16种多环芳烃标准溶液，将购买的混合标准溶液采用梯度稀释的方法，配制成0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.、5、10μg/ml系列浓度。

得到16种多环芳烃的线性范围介于0.002-10μg/ml，在3个加标水平上，16种多环芳烃的平均回收率介于84.1%~114%，相对标准偏差(rsd)在1.2%~5.7%，说明本方法对16种多环芳烃有较好的回收率和精密度，根据最小添加浓度的10倍相对标准偏差计算，本方法对16种多环芳烃的定量限为0.3~2μg/kg，能满足16种多环芳烃的含量分析要求。本实施例的方法的回收率、精密度与定量限如表1所示。

表1本实施例的方法的回收率、精密度与定量限

通过本实施例的方法抽样分析了20余份烟用香精料液，不同程度地检出芴、菲、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、二苯蒽等种类的多环芳烃。芴含量范围在0.11~0.38μg/g；菲含量范围在0.03~0.12μg/g；苯并(b)荧蒽含量范围在0.06~0.18μg/g；苯并(k)荧蒽含量范围在0.05~0.11μg/g；二苯蒽含量范围在0.11~0.15μg/g；茚并(1,2,3-cd)芘含量范围在0.08~0.16μg/g。其它多环芳烃未检出。

本实施例建立了烟用香精中16种多环芳烃的分析方法，该方法简便快捷，后期分析时间短，仅16分钟，适合烟用香精中16种多环芳烃的分析。本方法与gb5009.265-2016标准中的液相色谱法相比，苯并芘的定量限稍高于标准方法，其余组分的定量限与标准方法相同或优于标准方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。