一种敏感电极、其制备方法以及使用它的生物传感器及其应用与流程

本发明属于生物传感器领域，涉及一种敏感电极、其制备方法以及使用它的生物传感器及其应用。

背景技术：

皮质醇是动物体内重要的应激激素，被称为“压力荷尔蒙”，主要通过机体hpa轴(下丘脑-垂体-肾上腺轴)进行分泌调节。其变化水平可以表征机体的应激反应系统的适应性，如在人员任务训练等活动中，皮质醇的动态性变化能评估参与者的心理应激响应水平。

传统对皮质醇的检测一般是通过抗体识别探针来实现其浓度的测定，也有方案提出基于适配体等作为探针，然而，这类基于亲和力的分析测定技术存在着许多限制其商业化的挑战。且一般是基于“一次性检测”。难以实现对皮质醇的持续监测。

cn105606679a公开了一种基于稳定氧化锆和znnb2o6为敏感电极的高灵敏乙醇传感器及制备方法，属于气体传感器技术领域，其主要用于大气环境的检测。传感器依次由带有pt加热电极的al2o3陶瓷板、ysz基板、pt参考电极和ninb2o6敏感电极组成。参考电极和敏感电极彼此分立且对称地制备在ysz基板上表面的两端，ysz基板下表面与带有pt加热电极的al2o3陶瓷板粘结在一起。该发明制备的传感器主要用于大气环境的检测，并未公开可以用于皮质醇的检测。

cn107576624a公开了一种唾液中皮质醇的检测方法，包括样品的处理、样品的准备、浓缩、稀释、显色和测定步骤，测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后用离心机离心，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤；该发明提供的皮质醇的检测方法为一次性检测，不能用于实时监测。

cn104048940a提供了一种生猪血液中皮质醇含量的近红外快速检测方法，包括步骤：1)采集血液样品，离心后对血清进行近红外光谱数据信息采集；同时用试剂盒检测皮质醇；2)将近红外光谱数据信息与试剂盒测得的皮质醇化学测定值一一对应建立样品集，确定针对生猪血液皮质醇的最佳近红外光谱数据信息预处理方法和最佳预测模型；3)利用最佳近红外光谱数据信息预处理方法和最佳预测模型，对待测生猪血液样品的皮质醇进行检测。该方法具有检测时间短、检测速度快、省时、省人力的优点，但是无法进行实时监测。

因此，开发一种可实时监测皮质醇的检测方法非常有必要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种敏感电极、其制备方法以及使用它的生物传感器及其应用，所述生物传感器可用于实时监测皮质醇的浓度，从而评估人体应激系统的连续性变化规律。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的目的之一在于提供一种敏感电极，所述敏感电极包括电极和沉淀在电极表面的氧化物以及包载在氧化物表面的金属卟啉配合物。

本发明所述的敏感电极具有较好的灵敏度和传感效果，对电流的变化具有较好的响应性，通过构建电流和浓度的关系，可以用于检测浓度的变化。

在本发明中，所述氧化物为二氧化钛。

本发明中氧化物为二氧化钛，二氧化钛作为典型的过度金属氧化物，具有较高的介电常数和光电转换效率，可以增加电极的传感效果和灵敏度；若用其他氧化物去替代二氧化钛，会影响传导效果和灵敏度，造成检测结果不准确。

在本发明中，所述金属卟啉配合物包括卟啉铜、卟啉铁或卟啉钌中任意一种或至少两种的组合。

本发明选用的金属卟啉配合物是一种很好的生物激发催化剂，其中卟啉是一类高度共轭的杂环大环有机化合物，卟啉的大环结构能与多种金属元素结合形成稳定的金属卟啉，具有良好的电催化、光催化和生化性能，利于金属卟啉络合物催化皮质醇酮基还原为羟基的反应，可直接检测皮质醇的浓度，通过皮质醇氧化还原过程中会产生电荷的变化，从而检测浓度的变化；将金属卟啉配合物换为其他金属化合物，则无法催化皮质醇发生还原反应，则无法监测到电流信号，从而不能准确的检测皮质醇浓度。

在本发明中，所述电极包括碳电极或石墨烯修饰的碳电极。

本发明选用碳电极或石墨烯修饰的碳电极具有较好的传导性能。

本发明的目的之二在于提供一种敏感电极的制备方法，

(1)将电极浸泡在酸和钛源的混合液中，反应，得到二氧化钛沉淀的电极；

(2)将步骤(1)制备得到的二氧化钛沉淀的电极浸泡在金属卟啉配合物溶液中，干燥，得到敏感电极。

本发明制备敏感电极的制备方法简单，工艺条件温和，原料易得，价格低廉，可应用于工业生产。

本发明制备的敏感电极不会消解电极底物，可增加电极的长效性。

在本发明中，步骤(1)所述酸为盐酸。

在本发明中，所述钛源为四异丙醇钛溶液。

在本发明中，所述酸和钛源的体积比为8:1-12:1，例如8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、10.5:1、11:1、11.5:1、12:1等。

在本发明中，步骤(1)所述盐酸的浓度为36％-38％，例如36％、36.2％、36.5％、36.7％、37％、37.2％、37.5％、37.8％、38％等。

在本发明中，使用前对步骤(1)所述电极进行预先清洗以及干燥。

本发明在制备过程中预先对电极进行清洗，可以避免电极上的杂质或者沉积物对电极灵敏度和电导率的影响。

在本发明中，所述清洗包括依次用丙酮、去离子水以及乙醇清洗。

在本发明中，所述清洗为超声清洗。

在本发明中，所述清洗时间为20-60min，例如20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min等。

在本发明中，所述干燥包括用氮气吹干。

本发明所述干燥采用氮气吹干，一方面氮气为惰性气体，不会和电极上的物质反应，不会损伤电极，另一方面通过气体流动带走挥发的溶剂，避免了在高温条件下干燥，会对电极灵敏度产生一定的影响。

在本发明中，步骤(1)所述反应是在高压釜中进行。

在本发明中，所述高压釜的压力为15-25mpa，例如15mpa、16mpa、17mpa、18mpa、19mpa、20mpa、21mpa、22mpa、23mpa、24mpa、25mpa等。

在本发明中，步骤(1)所述反应的温度为160-200℃，例如160℃、165℃、170℃、175℃、180℃、185℃、190℃、195℃、200℃等。

在本发明中，步骤(1)所述反应的时间为8-16h，例如8h、8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h、11.5h、12h、12.5h、13h、13.5h、14h、14.5h、15h、15.5h、16h等。

在本发明中，步骤(1)还包括将得到二氧化钛沉淀的电极进行清洗以及干燥。

本发明中对得到的二氧化钛电极进行清洗以及干燥，一方面可以去除二氧化钛电极表面的杂质，另一方面便于储存。

在本发明中，所述清洗包括先用乙醇清洗，再用双蒸馏水清洗。

在本发明中，所述乙醇清洗的次数为3-5次，例如3次、4次或5次。

在本发明中，所述双蒸馏水清洗的次数为3-5次，例如3次、4次或5次。

本发明选用双蒸馏水进行清洗，进一步避免了二氧化钛电极表面杂质的影响。

在本发明中，所述干燥时间为1-5h，例如1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h等。

在本发明中，步骤(2)所述金属卟啉配合物溶液的浓度为0.5-2g/l，例如0.5g/l、0.8g/l、1g/l、1.2g/l、1.5g/l、1.8g/l、2g/l等。

在本发明中，所述金属卟啉配合物溶液的制备包括：称取0.5-2mg金属卟啉配合物溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺中，得到浓度为0.5-2g/l的金属卟啉配合物溶液。

在本发明中，步骤(2)所述干燥时间为1-5h，例如1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h等。

作为本发明的优选方案，所述敏感电极的制备方法包括：

(1)将碳电极或石墨烯修饰的碳电极依次用丙酮、去离子水以及乙醇进行超声清洗，清洗时间分别为20-60min，而后用氮气吹干，得到电极；

(2)将浓度为36％-38％的盐酸和四异丙醇钛溶液按体积比为8:1-12:1混合得到混合液，然后将步骤(1)得到的电极浸泡在混合液中，在压力为15-25mpa的高压釜中160-200℃反应8-16h，而后用乙醇和双蒸馏水分别清洗3-5次，干燥1-5h，得到二氧化钛沉淀的电极；

(3)将步骤(2)制备得到的二氧化钛沉淀的电极浸泡在浓度为0.5-2g/l的金属卟啉配合物溶液中，干燥1-5h，得到敏感电极。

本发明的目的之三在于提供一种生物传感器，所述生物传感器包括对电极、参比电极以及工作电极，其中工作电极为目的之一所述的敏感电极。

本发明制备的生物传感器具有监测灵敏度高和准确性强的优点，具有广泛的应用范围。

本发明的目的之四在于提供一种如目的之三所述的生物传感器在皮质醇进行实时监测中的应用。

本发明制备的生物传感器具有较好的生物激发催化作用，可以催化皮质醇的氧化还原反应，皮质醇在第3和第20位含有酮基不饱和酮甾体，其中羰基在催化作用下可以被还原为羟基，皮质醇在进行还原反应时会产生电流的变化，利用电化学原理，将皮质醇的浓度变化与电信号联系起来，通过电流的变化，从而可以实时监测皮质醇浓度的变化。

在本发明中，所述生物传感器用于实时监测汗液或唾液中的皮质醇。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明通过在电极上沉淀和包载二氧化钛和金属卟啉配合物，可以增加敏感电极的传感效果、检测灵敏度以及催化活性；制备的敏感电极不会消解电极底物，可以增加敏感电极的长效性；敏感电极的制备方法简单，原料易得，价格低廉，可用于工业化生产；以制备的敏感电极为工作电极应用于生物传感器中，通过将化学信号转化为电信号，可用于对皮质醇进行实时监测，从而评估人体应激系统的连续性变化规律。

附图说明

图1是在本发明实施例1制备的生物传感器催化作用下皮质醇发生的化学反应。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供一种敏感电极，所述敏感电极所述敏感电极包括电极和沉淀在电极表面的氧化物以及包载在氧化物表面的金属卟啉配合物，其中氧化物为二氧化钛，金属卟啉配合物为卟啉铁，电极为碳电极。

所述敏感电极的制备方法包括：

(1)将碳电极依次用丙酮、去离子水以及乙醇进行超声清洗，清洗时间分别为40min，而后用氮气吹干，得到电极；

(2)将浓度为36％-38％的盐酸和四异丙醇钛溶液按体积比为10:1混合得到混合液，即盐酸的体积为5ml，四异丙醇钛溶液为0.5ml，然后将步骤(1)得到的电极浸泡在混合液中，在压力为20mpa的高压釜中180℃反应12h，而后用乙醇和双蒸馏水分别清洗3次，干燥2h，得到二氧化钛沉淀的电极；

(3)称取1mg卟啉铁溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺中，得到浓度为1g/l的卟啉铁溶液，而后将步骤(2)制备得到的二氧化钛沉淀的电极浸泡在卟啉铁溶液中，干燥2h，得到敏感电极。

将上述制备的敏感电极、对电极和参比电极组合，制备得到生物传感器。

本实施例制备的生物传感器配合可穿戴技术和通信技术，通过检测电流的变化，将电信号转化为化学信号，可实时监测体内皮质醇的变化。

图1为在本实施例制备的生物传感器的催化活性下皮质醇发生的化学反应，如图1所示，皮质醇中存在羰基不饱和键，在生物传感器敏感电极的催化作用下，羰基得电子易被还原为羟基，会引起传感器中电流的变化，通过电流的变化，可得出皮质醇的变化，进而可以评估人体应激系统的连续性变化。

实施例2

本实施例提供一种敏感电极，所述敏感电极所述敏感电极包括电极和沉淀在电极表面的氧化物以及包载在氧化物表面的金属卟啉配合物，其中氧化物为二氧化钛，金属卟啉配合物为卟啉铜，电极为石墨烯修饰的碳电极。

所述敏感电极的制备方法包括：

(1)将石墨烯修饰的碳电极依次用丙酮、去离子水以及乙醇进行超声清洗，清洗时间分别为20min，而后用氮气吹干，得到电极；

(2)将浓度为36％-38％的盐酸和四异丙醇钛溶液按体积比为8:1混合得到混合液，即盐酸的体积为4ml，四异丙醇钛溶液为0.5ml，然后将步骤(1)得到的电极浸泡在混合液中，在压力为15mpa的高压釜中160℃反应16h，而后用乙醇和双蒸馏水分别清洗5次，干燥5h，得到二氧化钛沉淀的电极；

(3)称取0.5mg卟啉铜溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺中，得到浓度为0.5g/l的卟啉铜溶液，而后将步骤(2)制备得到的二氧化钛沉淀的电极浸泡在卟啉铜中，干燥1h，得到敏感电极。

所述生物传感器的制备与实施例1相同。

本实施例制备的生物传感器配合可穿戴技术，可以持续的监测人或者其他动物的汗液、唾液等皮质醇的变化活动，评估人体应激系统的连续性变化规律。

实施例3

本实施例提供一种敏感电极，所述敏感电极所述敏感电极包括电极和沉淀在电极表面的氧化物以及包载在氧化物表面的金属卟啉配合物，其中氧化物为二氧化钛，金属卟啉配合物为卟啉钌，电极为石墨烯修饰的碳电极。

所述敏感电极的制备方法包括：

(1)将石墨烯修饰的碳电极依次用丙酮、去离子水以及乙醇进行超声清洗，清洗时间分别为60min，而后用氮气吹干，得到电极；

(2)将浓度为36％-38％的盐酸和四异丙醇钛溶液按体积比为12:1混合得到混合液，即盐酸的体积为6ml，四异丙醇钛溶液为0.5ml，然后将步骤(1)得到的电极浸泡在混合液中，在压力为25mpa的高压釜中200℃反应8h，而后用乙醇和双蒸馏水分别清洗4次，干燥1h，得到二氧化钛沉淀的电极；

(3)称取2mg卟啉铜溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺中，得到浓度为2g/l的卟啉铜溶液，而后将步骤(2)制备得到的二氧化钛沉淀的电极浸泡在卟啉铜中，干燥5h，得到敏感电极。

所述生物传感器的制备与实施例1相同。

本实施例制备的生物传感器配合可穿戴技术，可以持续的监测人或者其他动物的汗液、唾液等皮质醇的变化活动，评估人体应激系统的连续性变化规律。

实施例4

本实施例提供一种敏感电极，所述敏感电极所述敏感电极包括电极和沉淀在电极表面的氧化物以及包载在氧化物表面的金属卟啉配合物，其中氧化物为二氧化钛，金属卟啉配合物为卟啉钌，电极为碳电极。

所述敏感电极的制备方法包括：

(1)将石墨烯修饰的碳电极依次用丙酮、去离子水以及乙醇进行超声清洗，清洗时间分别为55min，而后用氮气吹干，得到电极；

(2)将浓度为36％-38％的盐酸和四异丙醇钛溶液按体积比为9:1混合得到混合液，即盐酸的体积为4.5ml，四异丙醇钛溶液为0.5ml，然后将步骤(1)得到的电极浸泡在混合液中，在高压釜中190℃反应10h，而后用乙醇和双蒸馏水分别清洗3次，干燥2h，得到二氧化钛沉淀的电极；

(3)称取0.8mg卟啉铜溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺中，得到浓度为0.8g/l的卟啉铜溶液，而后将步骤(2)制备得到的二氧化钛沉淀的电极浸泡在卟啉铜中，干燥3h，得到敏感电极。

所述生物传感器的制备与实施例1相同。

本实施例制备的生物传感器配合可穿戴技术，可以持续的监测人或者其他动物的汗液、唾液等皮质醇的变化活动，评估人体应激系统的连续性变化规律。

实施例5

本实施例提供一种敏感电极，所述敏感电极所述敏感电极包括电极和沉淀在电极表面的氧化物以及包载在氧化物表面的金属卟啉配合物，其中氧化物为二氧化钛，金属卟啉配合物为卟啉铁，电极为石墨烯修饰的碳电极。

所述敏感电极的制备方法包括：

(1)将石墨烯修饰的碳电极依次用丙酮、去离子水以及乙醇进行超声清洗，清洗时间分别为25min，而后用氮气吹干，得到电极；

(2)将浓度为36％-38％的盐酸和四异丙醇钛溶液按体积比为11:1混合得到混合液，即盐酸的体积为5.5ml，四异丙醇钛溶液为0.5ml，然后将步骤(1)得到的电极浸泡在混合液中，在高压釜中170℃反应14h，而后用乙醇和双蒸馏水分别清洗3次，干燥1h，得到二氧化钛沉淀的电极；

(3)称取1.4mg卟啉铜溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺中，得到浓度为1.4g/l的卟啉铜溶液，而后将步骤(2)制备得到的二氧化钛沉淀的电极浸泡在卟啉铜中，干燥4h，得到敏感电极。

所述生物传感器的制备与实施例1相同。

本实施例制备的生物传感器配合可穿戴技术，可以持续的监测人或者其他动物的汗液、唾液等皮质醇的变化活动，评估人体应激系统的连续性变化规律。

实施例6

与实施例的区别仅在于不包括对步骤(1)，即不包括对碳电极进行预清洗，其余原料及其制备方法均与实施例1相同。

所述生物传感器的制备与实施例1相同。

本实施例制备的生物传感器因为在制备敏感电极过程中未对碳电极进行预清洗，影响生物传感器的灵敏性，测得的皮质醇的浓度也不准确，从而影响评估效果。

实施例7

与实施例1的区别仅在于氧化物为氧化铝，其余原料及其制备方法均与实施例1相同。

所述生物传感器的制备与实施例1相同。

本实施例制备的生物传感器因为在制备敏感电极过程中采用氧化铝为氧化物，影响生物传感器的灵敏性，测得的皮质醇的浓度也不准确，从而影响评估效果。

对比例1

与实施例1的区别仅在于所述敏感电极不包括二氧化钛，其余原料及其制备方法均与实施例1相同。

所述生物传感器的制备与实施例1相同。

本对比例制备的生物传感器的传感效果较差，会传感器的灵敏度，无法用于准确的检测皮质醇的浓度。

对比例2

与实施例1的区别仅在于所述敏感电极不包括金属卟啉配合物，其余原料及其制备方法均与实施例1相同。

所述生物传感器的制备与实施例1相同。

本对比例制备的生物传感器不能催化皮质醇发生还原反应，则传导的电信号为零，因此无法准确的检测皮质醇的浓度。

对比例3

与实施例1的区别仅在于用二茂铁替代卟啉铁，其余原料及其制备方法均与实施例1相同。

所述生物传感器的制备与实施例1相同。

本对比例中虽然二茂铁也是一种较好的配合物，但是其制备的生物传感器不能催化皮质醇发生还原反应，则传导的电信号为零，因此无法准确的检测皮质醇的浓度。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。