一种双电极的电化学试条的测试方法与流程

本发明属于生物传感器技术领域，尤其涉及一种双电极的电化学试条的测试方法。

背景技术：

电化学生物传感器或一次性测试传感器如葡萄糖试条是众所周知的，并且已经用于确定来自生物样品特别是来自血液的各种分析物的浓度。准确测定体液中的分析物对于某些生理异常的诊断具有重要意义。特别地，重要的是糖尿病患者经常检查其体液中的葡萄糖水平以调节其日常饮食中的葡萄糖摄入量。这些测试的结果可用于确定胰岛素剂量或需要施用的其他药物。在一种类型的血糖测试系统中，糖尿病患者使用测试传感器或称为葡萄糖试条，与手持式仪器配合来测试血液样本。全世界数以百万计的糖尿病患者每日都会使用葡萄糖试条。

市场上有数百种品牌名称的葡萄糖试条，它们在传感器结构上非常相似：即，通道或腔室形成在大致u形的垫片之间，并且适于通过毛细作用从传感器的开口端接收血液，从传感器另一端的通气口排出空气。众所周知，血液样本含有各种内源性和外源性化合物，这些化合物可能产生电流信号，即背景电流信号，从而对分析物的测试产生干扰，是因为背景电流信号被叠加到分析物(例如葡萄糖)信号上。因此，为了消除干扰，现有技术中测试传感器的样本室通常包含三个电极：一个工作电极，其加载有酶，介体，稳定剂和其他成分；一个参比电极，其加载的化学成分与工作电极相似；一个空白电极，其加载了与工作电极相同的化学成分但不加酶。将电压同时施加到工作电极和空白电极之间一段时间。工作电极处的电流信号不仅表示来自分析物(例如葡萄糖)的信号，还表示来自各种干扰物(例如抗坏血酸，对乙酰氨基酚及其他物质)的信号，而空白电极处的电流信号表示来自各种干扰物，例如抗坏血酸，对乙酰氨基酚及其他物质。因此，通过从工作电极的电流信号中扣除空白电极的背景电流信号，可以获得与分析物(例如葡萄糖)浓度相关的电流信号，从而消除来自共存的干扰物如抗坏血酸，对乙酰氨基酚和其他物质的干扰。

为了减少血量，从而减少刺穿手指的疼痛，血液接收室应尽可能小。因此，非常希望测试传感器可以具有需要较少血量的小样本室，同时还不会影响测试传感器的性能。可以想象，通过减小腔室的长度，宽度或厚度，或者上述两个或三个的组合，可以减小腔室容积。但是，通过减小宽度存在一些限制。如果宽度太窄，许多使用者有视力问题或手颤抖的问题，使得患者或使用者不能容易地找到开口端。减小腔室的厚度也是麻烦的，这会使得毛细管作用的效果较差，会导致样本进样中填充不充分或不连续。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种双电极的电化学试条的测试方法，本发明中的电化学试条样本腔室小，测试结果精确。

本发明提供一种双电极的电化学试条的测试方法，所述电化学试条的流体样本室设置有第一电极和第二电极；所述第二电极装载有可与分析物反应的酶；

所述测试方法包括以下步骤：

a)将流体样本通入所述流体样本室，持续施加电压使第一电极和第二电极之间产生电压差、且第一电极处于高电位，采集预定时间段内的若干个背景电流信号；

b)然后反向施加电压，使第一电极和第二电极之间产生电压差、且第二电极处于高电位，采集工作电流信号；

c)将所述步骤a)得到的若干个背景电流信号与对应的时间进行曲线拟合，得到背景电流与时间的曲线函数；

d)从所述拟合后的背景电流曲线函数上获取与工作电流信号相对应时间点的背景电流信号，使用该对应时间点的工作电流信号扣除所述获取的背景电流信号，得到表示分析物浓度的电流信号。

优选的，所述第二电极位于流体样本室内靠近进样口的一端，所述第一电极位于流体样本室内远离进样口的一端；

或者，

所述第二电极位于流体样本室远离进样口的一端，所述第一电极位于流体样本室靠近进样口的一端。

优选的，所述步骤a)之后，将电压断开预定时间，然后再反向施加电压。

优选的，所述步骤a)中施加的电压与所述步骤b)中反向施加的电压相同。

优选的，所述步骤a)中产生的电压差与所述步骤b)中产生的电压差相同。

优选的，所述步骤b)具体为：

然后反向施加电压，使第一电极和第二电极之间产生电压差、且第二电极处于高电位，采集一个预定时间点的工作电流信号；

或者，所述步骤b)具体为：

然后持续反向施加电压，使第一电极和第二电极之间产生电压差、且第二电极处于高电位，采集预定时间段的多个个工作电流信号。

优选的，所述若干个背景电流信号采集的时间间隔相等。

优选的，所述多个工作电流信号采集的时间间隔相等。

优选的，所述步骤c)对背景电流信号进行曲线拟合的过程中，使用电流稳定之后的背景电流信号进行曲线拟合。

优选的，在电流稳定之后得到的背景电流信号中，去除因外界干扰导致的异常背景电流信号，再进行曲线拟合。

优选的，所述步骤c)中的曲线拟合的曲线函数为多项式曲线函数、指数曲线函数或对数曲线函数。

优选的，所述分析物包括葡萄糖，乳酸盐，尿酸，β-羟基丁酸，肌酸酐，肌酸，胆固醇，甘油三酯，血红蛋白，胆红素和酒精中的任一种。

优选的，所述流体样本为全血样品、血清样品、血浆样品、泪液，间质液或尿液。

本发明提供了一种双电极的电化学试条的测试方法，所述电化学试条的流体样本室设置有第一电极和第二电极，所述第一电极用作空白电极或参比电极；所述第二电极用作参比电极或工作电极；所述第二电极装载有可与分析物反应的酶；所述测试方法包括以下步骤：a)将流体样本通入所述流体样本室，持续施加电压使第一电极和第二电极之间产生电压差、且第一电极处于高电位，采集预订时间段内的若干个背景电流信号；b)然后反向施加电压，使第一电极和第二电极之间产生电压差、且第二电极处于高电位，采集工作电流信号；c)将所述步骤a)得到的若干个背景电流信号与时间进行曲线拟合，得到背景电流与时间的曲线函数；d)从所述拟合后的背景电流曲线函数上获取与工作电流信号相对应时间点的背景电流信号，使用该对应时间点的工作电流信号扣除所述获取的背景电流信号，得到表示分析物浓度的电流信号。

本申请中这种反向施加电压和曲线拟合技术使得具有较短流体室的测试传感器能够在仅设置两个电极的前提下，具备三个电极的功能。毫无疑问，具有两个电极的样本室可以比具有三个电极的样本室更短，样本室容积显著减小，因此减少了检测用血量，降低了患者刺穿手指取血的疼痛，提高了使用的舒适度。同时，本发明中的方法检测精确度高，双电极试条便等同于三电极试条一样，能够清除干扰物对检测结果的干扰。实验结果表明，本发明中的方法的测试结果均在10％的偏差范围内，而没有使用本申请中反向施加电压和曲线拟合技术的方法，测试结果偏差在10％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明中具有三电极功能的双电极电化学试条的传感室流体样本室的透视图，图1a为本发明一个实施例中传感器流体样本室的透视图，图1b为本发明另一个实施例中传感器流体样本室的透视图；

图2为本发明一个实施例中背景电流与时间的曲线；

图3为本发明中一个实施例中背景电流与时间的拟合曲线；

图4为本发明另一个实施例中背景电流与时间的拟合曲线；

图5为本发明中另一个实施例中背景电流与工作电流曲线。

具体实施方式

本发明提供一种双电极的电化学试条的测试方法，所述电化学试条的流体样本室设置有第一电极和第二电极，所述第一电极用作空白电极或参比电极；

所述第二电极用作参比电极或工作电极；所述第二电极装载有可与分析物反应的酶；

所述测试方法包括以下步骤：

a)将流体样本通入所述流体样本室，持续施加电压使第一电极和第二电极之间产生电压差、且第一电极处于高电位，采集预定时间段内的若干个背景电流信号；

b)然后反向施加电压，使第一电极和第二电极之间产生电压差、且第二电极处于高电位，采集工作电流信号；

c)将所述步骤a)得到的若干个背景电流信号与时间进行曲线拟合，得到背景电流与时间的曲线函数；

d)从所述拟合后的背景电流曲线函数上获取与工作电流信号相对应时间点的背景电流信号，使用该对应时间点的工作电流信号扣除所述获取的背景电流信号，得到表示分析物浓度的电流信号。

在本发明中，所述电化学试条具有流体样本室，所述流体样本室内设置有第一电极和第二电极，所述第一电极用作空白电极或参比电极；所述第二电极用作参比电极或工作电极；所述第二电极装载有可与分析物反应的酶；所述第一电极和第二电极除了是否装载有酶的区别之外，其他的装载物是相同的，比如，铁氰化钾，亚铁氰化钾等，稳定剂，粘合剂和其他成分。

在本发明中，所述可与分析物反应的酶因分析物的不同而不同，为本领域技术人员熟知的内容，在此不再赘述。比如，分析物为葡萄糖的话，可使用葡萄糖氧化酶，或者可以与葡萄糖反应的葡萄糖脱氢酶。

本发明中，第一电极可设置在流体样本室内远离进样口的一端，第二电极设置在流体样本室内靠近进样口的一端，如图1a所示，优选的，所述第一电极位于流体样本室内靠近进样口的一端；所述第一电极位于流体样本室内远离进样口的一端，如图1b所示。图1a为本发明一个实施例中的传感器流体样本室的透视图，图1b为本发明另一个实施例中传感器流体样本室的透视图；其中，r/w表示第二电极，即参比电极/工作电极，b/r表示第一电极，即空白电极/参比电极。优选采用图1b中的结构，这样流体样本如血液先通过工作电极，尤其是在流体样本较少甚至样本不足无法完全填充流体样本室的情况下，这样的电极位置设置更有利于获得准确的测试结果。

在本发明中，所述电化学试条优选包括依次接触的第一基层、第二基层、第一上层和第二上层；

所述第二上层具有半圆形或u型缺口，在所述第二基层和第二上层之间形成流体样本室空腔。

所述第一基层为导电涂层，作用于第一电极和第二电极；所述第二基层为胶带或绝缘印刷，用于设置第一电极和第二电极；所述第二上层具有靠近流体样本室的亲水表面和原理腔室的通气口。

本发明中的方法能够应用在分析物的检测中，所述分析物可以是葡萄糖，乳酸盐，尿酸，β-羟基丁酸，肌酸酐，肌酸，胆固醇，甘油三酯，血红蛋白，胆红素和酒精中的一种或几种；所述分析物的检测载体即样本可以为全血样品、血清样品、血浆样品、泪液，间质液或尿液。

本发明中的方法适用于上述多种分析物的检测，由于不同种类分析物的性质差异较大，相应的所使用的酶也不同，同时考虑到使用仪器的不同，因此，具体的使用方法中的参数，比如电压值、施压时间等，也有所不同，本发明在此以葡萄糖的检测为例进行说明。

将电压施加在第一电极和第二电极上，使第一电极和第二电极之间产生电压差，且第一电极处于高电位，例如，将电压0.4v施加到第一电极上，第二电极为0v电位一段时间，优选1s，更优选2s，并且记录若干个时间点的第一电极的电流，例如每100ms记录一次。此时，第一电极实际上用作空白电极，第二电极实际上用作参比电极。由于第一电极上没有酶，此处得到的电流信号为背景电流信号。

在第一电极上施加电压1～2s后，将电压断开0.01～0.1s，优选为100ms。

随即反向施加电压：将反向电压施加在第一电极和第二电极上，即，第一电极和第二电极之间产生电压差，且第二电极处于高电位，例如，将0.4v的电压施加到第二电极上3s，第一电极处为0v电位，记录若干个时间点的第二电极的电流，例如每100ms。此时，第一电极实际上用作参比电极，第二电极为负载酶的工作电极。第二电极处的电流表示主要与分析物浓度相关的工作电极信号。

得到上述电流信号之后，本发明将所述背景电流信号与时间进行曲线拟合，得到背景电流与时间的曲线函数。

通过上述方法得到的是0～2s时间段的背景电流信号和2～5s时间段的工作电流信号，通常，最终时间点(也就是5s这一时间点)的电流将用于分析物浓度的计算，因此，应该使用5s这个时间点的工作电流扣除5s这个时间点的背景电流，得到的电流代表分析物信号并与其浓度相关，可用于分析物浓度计算。但是，由于本发明两个电极充当三个电极的这种特殊的结构和反向施加电压的特殊测试方法，背景电流和工作电流是分开测试的，不是同时测试的，因此，背景电流仅仅测试并记录了0～2s这一时间段的，没有5s这一时间点的背景电流，无法直接进行扣除。因此，本发明将上述已经获得的0～2s这一时间段的若干个背景电流信号与时间进行曲线拟合，并将拟合后的曲线外推，延长至5s这一时间点，以推算获得5s这一时间点的背景电流信号。

在本发明中，所述曲线拟合的曲线函数为多项式曲线函数、指数曲线函数或对数曲线函数。本发明研究发现，在多种曲线拟合方法中，采用指数曲线函数进行拟合比其他方法能够得到更准确的结果，因此，在背景电流曲线的拟合中均采用指数曲线函数。

在背景电流信号中，初始阶段的较高电流是由充电电流引起的，这一初始阶段的电流不稳定且不可复制，这一时间段的背景电流信号在拟合过程中容易导致曲线拟合不良，即容易导致＜0.95的低回归系数，进一步导致5s时间点的背景电流计算错误，因此，本发明优选将初始阶段的若干个数据点忽略，即舍去初期电流不稳定阶段得到的背景电流信号，仅采用电流稳定后得到的背景电流信号与时间进行曲线拟合，以便获得更好的曲线拟合，针对上述测试葡萄糖的方法而言，背景电流的曲线拟合优选从0.5～1s开始进行拟合，即，0.5～1s之前的背景电流信号数据不参加曲线拟合，更优选为，曲线拟合从1s开始。

得到拟合的背景电流与时间的曲线函数之后，本发明从所述拟合后的背景电流曲线函数上获取与工作电流信号相对应时间点的背景电流信号，使用该对应时间点的工作电流信号扣除所述获取的背景电流信号，得到表示分析物浓度电流信号。

具体的，仍然以上述葡萄糖测试为例，即推算获得5s时间点处的背景电流信号，使用5s时间点处的工作电流信号扣除推算获得的5s时间点处的背景电流信号，即得到葡萄糖浓度电流信号。

具体的工作电流与背景电流的扣除的方法为本领域技术人员熟知的常用技术手段，在此不再赘述。

仍然以葡萄糖测试为例，按照上述测试方法得到的背景信号的电流与时间曲线如图2所示，图2为本发明一个实施例中背景电流与时间的曲线，从0.1到2s，开始每0.1秒记录一次信号数据。

按照指数函数对图2中的数据点进行忽略初始阶段等处理之后，对图2中的背景电流信号进行指数函数拟合，结果如图3所示，图3为本发明一个实施例中背景电流与时间的拟合曲线，图中还显示了曲线拟合方程y＝ax^b(1)，曲线方程(1)中的a等于1722.6，b等于-0.612，等式中的x和y分别代表时间(s)和电流(na)。回归系数0.9985也来自当前与时间(1到2s)的给定数据点，其显示了良好的曲线拟合。从曲线方程(1)可以容易地计算出给定时间的电流值，例如第5s。

在测试过程中，可能会有外界因素或其他的干扰，导致背景电流曲线中会有一些异常的数据点，比如，突然过高或过低的数据点，这些点应当从拟合中排除。例如图4，图4为本发明另一个实施例中的背景电流与时间的拟合曲线，图4a为本发明另一个实施例背景电流与时间的曲线，图4b为本发明另一个实施例背景电流与时间的拟合曲线。由于图4a中的电流曲线有驼峰出现，如果曲线拟合也从1到2s进行，并且得到的曲线拟合方程和回归系数显然不太好，可以从拟合曲线和回归系数(0.9248)看出。为避免这种情况发生，应从曲线拟合中排除更多数据点。图4b是在去除两个异常数据点(时间点1和1.1s)之后与图4a相同的背景信号的电流对时间(i-t)曲线。方程和回归系数来自当前与时间的剩余数据点(1.2到2s)。很明显，在去除异常数据点之后，实现了更好的曲线拟合(0.9972回归系数)。目前现有拟合软件均具有此类功能，在此不再赘述。

本发明中的测试方法和步骤均可由仪器自动编程和执行。

为了更加清楚、直观的说明从工作电流中扣除背景电流，本发明将背景电流曲线、计算或推导的背景电流曲线以及工作电流曲线集成在一个图中，如图5所示。图5是电流与时间(it)曲线：曲线a为从1～2s记录的背景信号；曲线b为从曲线a通过使用曲线拟合方程从2到5s外推背景信号；曲线c为在2～5s记录的工作电流信号。

本发明提供了一种双电极的电化学试条的测试方法，所述电化学试条的流体样本室设置有第一电极和第二电极，所述第一电极用作空白电极或参比电极；所述第二电极用作参比电极或工作电极；所述第二电极装载有可与分析物反应的酶；所述测试方法包括以下步骤：a)将流体样本通入所述流体样本室，持续施加电压使第一电极和第二电极之间产生电压差、且第一电极处于高电位，采集预订时间段内的若干个背景电流信号；b)然后反向施加电压，使第一电极和第二电极之间产生电压差、且第二电极处于高电位，采集工作电流信号；c)将所述步骤a)得到的若干个背景电流信号与时间进行曲线拟合，得到背景电流与时间的曲线函数；d)从所述拟合后的背景电流曲线函数上获取与工作电流信号相对应时间点的背景电流信号，使用该对应时间点的工作电流信号扣除所述获取的背景电流信号，得到表示分析物浓度的电流信号。

本申请中这种反向施加电压和曲线拟合技术使得具有较短流体室的测试传感器能够在仅设置两个电极的前提下，具备三个电极的功能。毫无疑问，具有两个电极的样本室可以比具有三个电极的样本室更短，样本室容积显著减小，因此减少了检测用血量，降低了患者刺穿手指取血的疼痛，提高了使用的舒适度。同时，本发明中的方法检测精确度高，双电极试条便等同于三电极试条一样，能够清除干扰物对检测结果的干扰。实验结果表明，本发明中的方法的测试结果均在10％的偏差范围内，而没有使用本申请中反向施加电压和曲线拟合技术的方法，测试结果偏差在10％以上。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种双电极的电化学试条的测试方法进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。

实施例

为了验证使用本发明的背景校正软件的测试传感器和仪器进行背景校正的反向施加电压和曲线拟合技术，针对几种具有临床意义的干扰物，包括对乙酰氨基酚，甲基多巴，抗坏血酸，谷胱甘肽，左旋多巴，胆红素和尿酸，进行了葡萄糖浓度的测试。

为了进行比较，对没有背景校正的方法也进行了测试。此处所说的没有背景校正的方法指的是：采用普通双电极试条，直接对二个电极施加电压构成电压差，使二个电极之间产生电流信号(工作电极上的电位相对处于高水平)。然后直接以该电流信号作为与浓度对应的电流信号，

采用新鲜静脉血液制备多组已知葡萄糖浓度的样本，样本中葡萄糖的具体浓度如表1葡萄糖浓度所示。每组样本中包含有四个样本，其中二个样本为葡萄糖高浓度水平(高浓度水平的葡萄糖浓度相同)，二个样本为葡萄糖低浓度水平(低浓度水平的葡萄糖浓度相同)，向每组样本中的一个高浓度水平样本和一个低浓度水平样本中分别添加一种干扰物，添加量如表1中干扰物浓度所示。同时对未添加干扰物的样本和已添加干扰物的样本进行葡萄糖浓度测试，没有采用本发明背景校正的结果如表1所示，而采用本发明背景校正的结果如表2所示。

表1背景校正前的测试结果

表2背景校正后的测试结果

由表1和表2可以看出，没有使用本发明反向施加电压和曲线拟合技术时，除了在高葡萄糖浓度下的抗坏血酸和胆红素二个干扰物以外，其他的干扰物都显示出对葡萄糖测量的严重干扰(>10％偏差)。然而，使用上述反向施加电压和曲线拟合技术显示出显着的优势，测试结果均在10％偏差范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。