一种轻型脑外伤的血清分子诊断标记物及应用的制作方法

本发明属于基因与生物技术领域，具体地说，涉及一种轻型脑外伤的血清分子诊断标记物及应用。

背景技术：

脑外伤指由于外物造成的、头脑部肉眼可见的伤，一般可引起严重的后果。不同区域的脑损害可引起不同的症状，局灶性症状包括运动、感觉、言语、视觉、听觉异常等症状。而弥散性脑损害常影响记忆、睡眠或导致意识模糊和昏迷。随着现代工业和交通的发展，颅脑创伤的发生率居高不下，成为威胁人类，特别青壮年人群生命与健康的主要伤病。根据美国疾病控制和预防中心报告，每年大约有170万美国人遭遇颅脑创伤，其中75％-90％是轻型创伤性脑损伤。

尽管根据患者有受伤经过、全身及神经系统体检发现各种表现即可明确诊断中重度脑外伤，但轻型脑外伤由于急性症状，例如短时意识丧失、创伤后失忆、定向障碍等，经休息后迅速缓解，并且神经影像学上缺乏损伤的客观证据，因此难以明确诊断。

目前，轻型脑外伤的诊断依据是：格拉斯哥昏迷评分(gcs)13-15分、昏迷小于20分钟。然而患者昏迷史有时不能获得，如婴幼儿、智力障碍的老人、多发性创伤；或昏迷史不可靠，如醉酒、娱乐药物、镇静剂等；或患者有意慌报昏迷史。为了明确轻型脑外伤诊断及有效的预后预测，需要一种实用而客观的方法。

研究表明，一些血清生物标志物对轻型脑外伤的诊断能提供有价值的参考，生物标志物可能是轻型脑外伤明确诊断的有用的辅助检查指标，是临床检查和神经影像学检查的有价值的补充。对于脑外伤患者，使用新的生物标志物，可以提供快速、权威、无创、准确的实验指标，指导分诊、预测预后，促进治疗的进一步改进，为早期治疗干预提供可能性。生物标志物是生理或病理过程中特定的客观指标，可通过体液，如脑脊液和血液测定，tbi的生物标志物是指tbi导致脑细胞损伤破坏、解体，神经元或神经胶质细胞释放特异性蛋白进入体液(脑脊液和血液)，其水平与创伤引发的病理生理机制及损伤的严重程度相关。

脑外伤的生物标志物，特别是轻型脑外伤生物标志物的确定，面临着一些挑战，新的生物标志物作为一种有用的临床辅助检查，应具备以下3个基本特点：第一，高度的脑特异性，准确性和伤后体液中快速出现；第二，分析方法可靠并可重复测定，合理的成本和较短的检测时间，以及检测的高灵敏度；第三，能提供诊断和预后信息，有助于临床医生的观察、治疗与预后预测。

蛋白组学研究是即基因组学研究后的生命科学发展的一个大方向之一。蛋白质的结构和功能最终直接影响着生命活动的变化，基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化，而真正发挥功能的蛋白要经过转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等许多步骤和调控才能形成，因而对蛋白质的直接研究才能真实的解释各种生命现象。但是研究蛋白质的手段和方法还没有很大的发展，所以寻找有效、快捷的蛋白分析技术成为了至关重要的一个环节。蛋白芯片技术的出现给蛋白组学研究带来新思路。蛋白组学研究中一个主要的内容就是要研究在不同生理状态或病理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，它也是蛋白芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经用在研究的各个领域里。

酶免疫测定是将酶催化作用的高效性和抗原抗体反应的特异性相结合的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体后形成的酶标记物，既保留抗原或抗体的免疫活性，又保留酶的催化活性。当酶标记物与待测标本中相应的抗原或抗体相互作用时。可形成酶标记抗原抗体复合物。利用复合物上标记的酶催化底物显色，其颜色的深浅与待检标本中抗原抗体的量相关。该方法敏感度可达到ng/ml～pg/ml水平。

酶联免疫吸附实验(elisa)是酶免疫测定中应用最广的技术，可用于定性或定量检测抗原。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种轻型脑外伤的血清分子诊断标记物及应用，旨在解决临床轻型脑外伤缺乏有效的诊断及预后预测方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种轻型脑外伤的血清分子诊断标记物，包括ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9或icam-2中的一种或几种。

可选地，ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9和icam-2的氨基酸序列如seqidno.1-seqidno.8所示。

本发明还公开了一种上述的轻型脑外伤的血清分子诊断标记物在制备轻型脑外伤诊断产品中的应用。

可选地，所述诊断产品包含检测所述一种或多种标志物的试剂，所述试剂通过检测受试者血清中所述一种或多种标志物的浓度来判断受试者是否患有轻型脑外伤。

可选地，所述试剂是基于基因芯片检测或pcr检测所述一种或多种标志物浓度时所需的试剂。

可选地，所述标志物ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9、icam-2中的一种或几种在轻型脑外伤组织中表达与非轻型脑外伤组织中表达相比显著增高。

可选地，所述诊断产品是试剂盒、芯片或检测平台。

本发明还公开了一种轻型脑外伤诊断试剂盒，该试剂盒用于检测轻型脑外伤中的ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9、icam-2中的一种或几种。

可选地，该试剂盒包括ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9和icam-2八种蛋白的特异性抗体。

本发明还公开了一种轻型脑外伤诊断蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9和icam-2八种蛋白的特异性抗体。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)测定了tbi患者血清中的蛋白表达谱，发现ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9和icam-2表达差异显著；并且应用elisa试验进一步验证了上述发现。

2)本发明提供了有效的疾病血清标记物检测方法，并发现ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9和icam-2等八种蛋白组成的分子诊断体系可作为轻型颅脑外伤患者的血清诊断标记物。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明蛋白芯片检测到的差异表达蛋白热图；其中，a和b分别代表差异表达上调蛋白中不同表达水平的蛋白质，共有107个；

图2是本发明另一组蛋白芯片检测到的差异表达蛋白热图；其中，a和b分别代表差异表达下调蛋白中不同表达水平的蛋白质，共有65个；

图3是本发明蛋白芯片检测到的差异表达蛋白质中表达上调最显著的前十位和表达下调最显著的前十位；其中，a代表表达上调最显著的前十位，分别是follistatin-like1,beta-ngf,lefty-a,mmp-20,eg-vegf/pk1,decorin,pref-1,hai-2,mcp-4/ccl13和il-22；b代表表达下调最显著的前十位，分别是i-309,saa,notch-1,s100a8/a9,d-dimer,il-31,nt-4,crp,mmp-9和scg3；

图4是本发明差异表达蛋白go分析；

图5是本发明蛋白芯片结果中表达下调的蛋白质的生物信息学(蛋白互作)分析；

图6是本发明另一组蛋白芯片结果中表达下调的蛋白质的生物信息学(蛋白互作)分析；

图7是本发明另一组蛋白芯片结果中所有差异表达的蛋白质的生物信息学(蛋白互作)分析；

图8是本发明kegg通路分析；其中，a代表上调蛋白的kegg通路分析；b代表下调蛋白的kegg通路分析；

图9是本发明elisa检测结果；其中，a代表crp，b代表icam-2、c代表mmp-9、d代表hgf、e代表igf-2、f代表ngf、g代表nt-3，h代表npy。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1轻型脑外伤患者血清诊断标记物

轻型脑外伤患者血清诊断标记物包括ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9和icam-2八种蛋白，其氨基酸序列分别如seqidno.1-seqidno.8所示。

1.实验方法

①收集昆明医科大学第一附属医院接受tbi治疗的23例患者血清(19～81岁，tbi后第3天作为tbi组)和22例健康献血者的血清(18～81岁，作为对照组)。

②随机抽取3例tbi组和3例对照组标本进行蛋白芯片检测差异表达蛋白。

③对显著的差异表达蛋白进行生物信息学分析。

④应用elisa试验进一步验证了tbi患者血清中ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9和icam-2水平的升高。

2.实验结果

①蛋白芯片检测结果表明，差异表达显著的蛋白有172个，其中107个蛋白质表达上调，65个蛋白质表达下调(图1-图3)。

②差异表达蛋白go分析表明，这些差异表达的蛋白的生物学过程主要参与细胞过程的调控、信号转导、细胞通讯、对刺激的反应、免疫系统过程和多细胞生物的发育(图4)，如图4所示，上调的蛋白质参与了212个生物过程，前10个生物学过程分别是单个生物体的细胞过程(38种蛋白质)，单个生物体的信号(33种蛋白质)，细胞通讯(33种蛋白质)，对刺激的反应(32种蛋白质)，多细胞生物发育(31种蛋白质)，信号转导(31种蛋白质)，细胞对刺激的反应(31种蛋白质)，单个多细胞生物过程(30蛋白质)，代谢过程的调节(30种蛋白质)，以及生物过程的积极调节(29种蛋白质)(图4a-a)。

此外，下调的蛋白质参与了59个生物学过程，前10个生物学过程分别是对生物的积极调节过程(23种蛋白质)，对细胞过程的负调控(19种蛋白质)，生物学过程的负调控(19种蛋白质)，信号的调节(18种蛋白质)，细胞通信调节(18种蛋白质)，细胞过程的正调控(18种蛋白质)，信号转导的调节(17种蛋白质)，对刺激反应的调节刺激(17种蛋白质)，免疫系统过程(16种蛋白质)和细胞代谢过程的正调节(16种蛋白质)(图4b-a)。

在这go分析的三种类型中，细胞成分与基因产物的激活有关。在这项发明中，我们发现上调蛋白主要表达在细胞外区域和细胞外区域部分中，除此之外，还包括细胞外空间、细胞质膜有界囊腔、细胞表面、浆膜部分、分泌颗粒腔和膜面(图4a-b)。类似地，下调节蛋白的细胞成分包括细胞外区域，细胞外空间，细胞外区域部分，囊泡膜有界小泡，细胞质膜有界囊胞外囊胞外，分泌颗粒，胞质小泡，细胞质膜有界小泡，分泌颗粒腔，胞质小泡部分和内成囊泡腔(图4b-b)。

分子功能的特征是取决于一种基因产物的生化活性。上调蛋白质的分子功能主要是参与受体结合，蛋白质结合，细胞因子活性，生长因子活性，化学趋化物活性，细胞因子受体结合，趋化因子受体活性和bmp结合(图4a-c),而表达下调的蛋白质的分子功能主要是参与受体结合,蛋白质结合,脂蛋白粒子结合和白细胞介素-6受体的结合(图4b-c)。

③生物信息学(蛋白互作)分析表明，ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9和icam-2之间有较紧密的功能联系(图5-图7)。

如图5所示，与上调蛋白有明显相互作用关系的ppi网络包括58个节点和82条边。其中，最优组合得分的前5对是nrg2-erbb3(0.991)，ctnnb1-cdh5(0.988)，nrg2-erbb4(0.984)，ccl7-ccr2(0.978)和ccl7-ccr1(0.959)。括号内的值是组合的分数值。

如图6所示，与下调蛋白有明显相互作用关系的ppi网络包括51个节点和74条边，其中，最优组合得分的前5对是gcg-gast(0.99)、epo-kitlg(0.982)、smad5-smad4(0.968)、gcg-vipr2(0.951)和igf2-pappa(0.948)。括号内的值是组合的分数值。

如图7所示，所有deps的ppi网络包括109个节点和293条边。其中，得分最高的5对组合是tf-tfrc(0.999)、cck-gast(0.993)、ngr2-erbb3(0.991)、gcg-gast(0.99)和ctnnb1-cdh5(0.988)。括号内的值是组合的分数值。

此外，ngf、nt-3、igf-2、hgf、npy、crp、mmp-9和icam-2在蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)网络中也拥有很高的综合得分。

④kegg通路分析表明，上调的差异表达蛋白的显著富集通路为细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、pi3k-akt信号通路、肿瘤蛋白多糖通路、rapi信号通路、ras信号通路和jak-stat信号通路(图8a)。同时，下调的差异表达蛋白的富集通路有造血细胞谱系和notch信号通路(图8b)。

⑤elisa检测结果表明，与对照组比较，tbi组crp、icam-2、mmp-9、hgf、igf-2、ngf、nt-3和npy明显上调(p<0.05)(图9)。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

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