一种中链甘油三酯中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量检测方法与流程

本发明涉及一种中链甘油三酯中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量检测方法，属于药用原料与食品检测领域。

背景技术：

中链甘油三酯(medium－chaintriglycerides，mct)，又名中链油，是由椰子cocosnucifeml.的胚乳硬干部分或由油棕elaeisguineensisjacq.的干胚乳提取的脂肪油分离出的脂肪酸-辛癸酸混合酸，与甘油酯化而成的饱和脂肪酸的甘油三酯混合物。一般认为，典型的mct是指饱和辛酸甘油三酯或饱和癸酸甘油三酯或饱和辛酸-癸酸混合的甘油三酯，属于一种天然油酯的改性产品。国内外多年来应用证明其为一种安全可靠的产品，可作为乳化剂、润滑剂和稳定剂广泛应用，作为药品、食品、保健品及化妆品等生产的原辅料。目前在药品生产中应用的中链甘油三酯，被用做中/长链脂肪乳注射液的生产原料。

以中碳链脂肪酸(mcfa)和甘油为原料，通过化学或酶催化工艺制备医用中链甘油三酯，其中甘油二酯是其中一种主要副产物。甘油二酯(diacylglycerol，dg)是一类甘油三酯(triacylglycerol，tg)中一个脂肪酸被烃基取代的结构脂质，是天然植物油脂中的微量成分，主要存在1,3-dg和1,2-dg两种同分异构体，其含量常小于5％，是公认安全的食品成分，同时也是一种多功能添加剂，在食品、医药、化工等行业有着广阔的应用前景。为了获得满足医用注射脂肪乳要求的中链结构酯原料，就需要对副产物甘油二酯进行控制。

目前国内外专利、文献中，尚未有关于中链甘油三酯中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯绝对量测定方法的报道。目前，最常用的甘油二酯分析方法有薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)和气相色谱法(gc)等几种。tlc法的缺点是精度不高，gc法的缺点是需要高温柱、响应值波动大、重现性差等，hplc法最适合分析甘油二酯含量。hplc法根据检测器种类大体上hplc-uv、hplc-elsd等多种方法。hplc-uv明显的缺点是紫外检测器对脂肪酸双键数非常敏感，因此饱和度不同的物质可以产生差异巨大的响应值，在做油脂的定量分析方面可行性差。hplc-elsd法属质量型检测方法，是最适合、最通用的酯类分析方法，具有分辩率高、速度快、灵敏度高、色谱柱可反复使用等优点。

中链甘油三酯中含甘油二酯总量不超过2％，因为成分复杂而且含量低，用高效液相进行测定会受甘油三酯主成分峰的干扰影响，甘油二酯也存在着同分异构体，所以要把色谱峰进行完全分离后，再进行辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的绝对量测定难度非常大。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种中链甘油三酯中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量检测方法，本发明的检测方法实用性强、操作简便、结果准确、重现性好，为中链甘油三酯的质量标准制订及制备工艺筛选提供数据支持和参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种中链甘油三酯中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取中链甘油三酯，加入甲醇溶解并稀释，摇匀，得到供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：取辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯对照品，加入甲醇溶解并稀释，得到辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的混合对照品溶液；

(3)含量测定：精密量取供试品溶液和混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法分别以峰面积计算供试品中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，中链甘油三酯与甲醇的质量体积比为200mg：10ml。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，精密称取辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯对照品，加入甲醇溶解并稀释，制成每1ml甲醇含辛酸甘油二酯分别为70μg、150μg、210μg、300μg、450μg，含癸酸甘油二酯分别为30μg、60μg、90μg、120μg、180μg的混合对照品溶液。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，液相色谱条件为：

色谱柱：c18色谱柱；

检测器：蒸发光散射检测器；

流动相：以体积比为8:2的乙腈-水混合溶剂为流动相a，以体积比为1:1的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相b进行梯度洗脱；所述流动相梯度洗脱的条件为：0～10min，流动相中a(76％)，流动相中b(24％)；10～30min，流动相中a(76％→30％)，流动相中b(24％→70％)；30～40min，流动相中a(30％)，流动相中b(70％)；40～50min，流动相中a(30％→76％)，流动相中b(70％→24％)；50～60min，流动相中a(76％)，流动相中b(24％)；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

分别精密量取供试品溶液和混合对照品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，测定。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，外标法的具体操作为：精密量取不同浓度的混合对照品溶液20μl注入液相色谱仪，测得不同浓度混合对照品溶液的峰面积，以混合对照品溶液峰面积对数值为纵坐标，以相对应混合对照品溶液浓度对数为横坐标作标准曲线，分别计算得线性回归方程；另精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，测得供试品中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的峰面积，分别用回归方程计算辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量。

辛酸甘油二酯有1,3-辛酸甘油二酯、1,2-辛酸甘油二酯两个同分异构体，所以1,3-辛酸甘油二酯、1,2-辛酸甘油二酯的含量计算时，同时采用辛酸甘油二酯作为对照品，辛酸甘油二酯含量为两者之和。同理，癸酸甘油二酯有1,3-癸酸甘油二酯、1,2-癸酸甘油二酯两个同分异构体，所以1,3-癸酸甘油二酯、1,2-癸酸甘油二酯的含量计算时，同时采用癸酸甘油二酯作为对照品，癸酸甘油二酯含量为两者之和。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述c18色谱柱的规格为250mm×4.6mm，5μm。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述检测器的漂移管温度为72℃，载气流速为2.0ml/min，增益值为4，模式为分流模式。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述辛酸甘油二酯的含量为1,3-辛酸甘油二酯、1,2-辛酸甘油二酯的含量之和，均采用混合对照品溶液中辛酸甘油二酯作为对照；所述癸酸甘油二酯的含量为1,3-癸酸甘油二酯、1,2-癸酸甘油二酯的含量之和，均采用混合对照品溶液中癸酸甘油二酯作为对照。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明建立了一种简便、准确可靠的测定方法，采用液相色谱分离技术，蒸发光散射检测器检测，利用液相外标法计算中链甘油三酯中甘油二酯成分的含量，供试品直接用甲醇溶解，不需经过水解、氧化酶、衍生化、酯化等步骤，即可利用液相测定并计算其辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯成分的含量；

(2)本发明的液相色谱系统分离效果好，供试品的甘油二酯成分色谱峰峰形良好，各色谱峰之间分离度优，均达基线分离，故该检测方法能准确有效地测定中链甘油三酯样品中甘油二酯成分的含量；

(3)本发明的测定方法实用性强，操作简便、结果准确、重现性好，为中链甘油三酯的质量标准制订及制备工艺筛选提供数据支持和参考，保证甘油二酯测定的科学性和先进性。

附图说明

图1为本发明辛酸甘油二酯对照品溶液hplc图谱。

图2为本发明癸酸甘油二酯对照品溶液hplc图谱。

图3为本发明中链甘油三酯的分离成分1,3-辛酸甘油二酯hplc图谱。

图4为本发明中链甘油三酯的分离成分1,2-辛酸甘油二酯hplc图谱。

图5为本发明中链甘油三酯的分离成分1,3-癸酸甘油二酯hplc图谱。

图6为本发明中链甘油三酯的分离成分1,2-癸酸甘油二酯hplc图谱。

图7为本发明中链甘油三酯供试品hplc图谱。

图8为本发明中链甘油三酯供试品hplc图谱(0～20min放大图)。

图9为本发明中链甘油三酯重复性测定混合对照品溶液的hplc图谱(0～20min放大图)。

图10为本发明中链甘油三酯重复性测定供试品hplc图谱(0～20min放大图)。

图11为本发明中链甘油三酯稳定性0小时性测定供试品hplc图谱(0～20min放大图)。

图12为本发明中链甘油三酯稳定性24小时性测定供试品hplc图谱(0～20min放大图)。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明检测方法的专属性试验

本发明中链甘油三酯中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量检测方法的一种实施例，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取250mg中链甘油三酯，加入10ml甲醇溶解并稀释，摇匀，得到中链甘油三酯样品溶液；分别取中链甘油三酯结构确证分离出来的1,3-辛酸甘油二酯(mtg-dg-1)、1,2-辛酸甘油二酯(mtg-dg-2)、1,3-癸酸甘油二酯(mtg-dg-5)、1,2-癸酸甘油二酯(mtg-dg-6)10mg，加入10ml甲醇溶解并稀释，摇匀，得到甘油二酯供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：取辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯均分别为10mg、10mg，溶于1ml甲醇中，制得辛酸甘油二酯对照品溶液和癸酸甘油二酯对照品溶液；

(3)测定：

液相色谱条件为：

色谱柱：c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；

检测器：蒸发光散射检测器(漂移管温度为72℃，载气流速为2.0ml/min，增益值为4，模式为分流模式)；

流动相：以体积比为8:2的乙腈-水混合溶剂为流动相a，以体积比为1:1的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相b进行梯度洗脱；所述流动相梯度洗脱的条件为：0～10min，流动相中a(76％)，流动相中b(24％)；10～30min，流动相中a(76％→30％)，流动相中b(24％→70％)；30～40min，流动相中a(30％)，流动相中b(70％)；40～50min，流动相中a(30％→76％)，流动相中b(70％→24％)；50～60min，流动相中a(76％)，流动相中b(24％)；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

精密量取不同浓度的辛酸甘油二酯对照品溶液和癸酸甘油二酯对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

测定辛酸甘油二酯对照品溶液、癸酸甘油二酯对照品溶液，中链甘油三酯结构确证分离出来的1,3-辛酸甘油二酯(mtg-dg-1)、1,2-辛酸甘油二酯(mtg-dg-2)、1,3-癸酸甘油二酯(mtg-dg-5)、1,2-癸酸甘油二酯(mtg-dg-6)，以及供试品溶液中的1,3-辛酸甘油二酯、1,2-辛酸甘油二酯、1,3-癸酸甘油二酯、1,2-癸酸甘油二酯，结果如表1所示。辛酸甘油二酯对照品溶液hplc图谱、癸酸甘油二酯对照品溶液hplc图谱、中链甘油三酯的分离成分1,3-辛酸甘油二酯hplc图谱、中链甘油三酯的分离成分1,2-辛酸甘油二酯hplc图谱、中链甘油三酯的分离成分1,3-癸酸甘油二酯hplc图谱、中链甘油三酯的分离成分1,2-癸酸甘油二酯hplc图谱、中链甘油三酯供试品hplc图谱分别如图1～7所示，中链甘油三酯供试品hplc图谱的0～20min放大图如图8所示。

表1中链甘油三酯的分离结果

由表1可知，本发明的色谱条件下测定辛酸甘油二酯、癸酸甘油二酯对照品与中链甘油三酯中分离出来的辛酸甘油二酯、癸酸甘油二酯成分出峰时间相对应(含1,3-辛酸甘油二酯、1,2-辛酸甘油二酯、1,3-癸酸甘油二酯、1,2-癸酸甘油二酯)，与中链甘油三酯供试品中的辛酸甘油二酯、癸酸甘油二酯成分出峰时间相对应。1,3-辛酸甘油二酯、1,2-辛酸甘油二酯为同分异构体，所以1,3-辛酸甘油二酯、1,2-辛酸甘油二酯的含量计算时，同时采用辛酸甘油二酯作为对照品，辛酸甘油二酯含量为两者之和；同理，1,3-癸酸甘油二酯、1,2-癸酸甘油二酯为同分异构体，所以1,3-癸酸甘油二酯、1,2-癸酸甘油二酯的含量计算时，同时采用癸酸甘油二酯作为对照品，癸酸甘油二酯含量为两者之和。由结果可知各成分峰分离度、理论塔板数符合要求，说明方法专属性好，所以可以采用外标法计算辛酸甘油二酯、癸酸甘油二酯的含量。

实施例2

本发明检测方法的线性性试验

本发明中链甘油三酯中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量检测方法的一种实施例，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取200mg中链甘油三酯，加入10ml甲醇溶解并稀释，摇匀，得到供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯对照品，加入甲醇溶解并稀释，制成每1ml甲醇含辛酸甘油二酯分别为70μg、150μg、210μg、300μg、450μg，含癸酸甘油二酯分别为30μg、60μg、90μg、120μg、180μg的混合对照品溶液；

(3)测定：

液相色谱条件为：

色谱柱：c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；

检测器：蒸发光散射检测器(漂移管温度为72℃，载气流速为2.0ml/min，增益值为4，模式为分流模式)；

流动相：以体积比为8:2的乙腈-水混合溶剂为流动相a，以体积比为1:1的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相b进行梯度洗脱；所述流动相梯度洗脱的条件为：0～10min，流动相中a(76％)，流动相中b(24％)；10～30min，流动相中a(76％→30％)，流动相中b(24％→70％)；30～40min，流动相中a(30％)，流动相中b(70％)；40～50min，流动相中a(30％→76％)，流动相中b(70％→24％)；50～60min，流动相中a(76％)，流动相中b(24％)；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

精密量取不同浓度的混合对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，测得不同浓度混合对照品溶液的峰面积，以混合对照品溶液峰面积对数值为纵坐标，以相对应混合对照品溶液浓度对数为横坐标作标准曲线，分别计算得线性回归方程；结果见表2，从结果可知，辛酸甘油二酯的标准曲线方程：y＝2.0467x+5.7424，相关系数r²＝0.9984，表明该方法在0.07285mg/ml～0.4371mg/ml浓度范围内呈良好线性；以癸酸甘油二酯峰面积对数值为纵坐标，以相对应标准溶液浓度对数为横坐标作标准曲线，结果见表2，从结果可知，癸酸甘油二酯的标准曲线方程：y＝1.3592x+5.5447，相关系数r²＝0.9990，表明该方法在0.03025mg/ml～0.1815mg/ml浓度范围内呈良好线性。

表2线性关系试验结果

实施例3

本发明检测方法的重复性试验

本发明中链甘油三酯中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量检测方法的一种实施例，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取6份同一批号中链甘油三酯200mg，加入10ml甲醇溶解并稀释，摇匀，得到供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯对照品，加入甲醇溶解并稀释，制成每1ml甲醇含辛酸甘油二酯分别为70μg、150μg、210μg、300μg、450μg，含癸酸甘油二酯分别为30μg、60μg、90μg、120μg、180μg的混合对照品溶液；

(3)测定：

液相色谱条件为：

色谱柱：c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；

检测器：蒸发光散射检测器(漂移管温度为72℃，载气流速为2.0ml/min，增益值为4，模式为分流模式)；

流动相：以体积比为8:2的乙腈-水混合溶剂为流动相a，以体积比为1:1的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相b进行梯度洗脱；所述流动相梯度洗脱的条件为：0～10min，流动相中a(76％)，流动相中b(24％)；10～30min，流动相中a(76％→30％)，流动相中b(24％→70％)；30～40min，流动相中a(30％)，流动相中b(70％)；40～50min，流动相中a(30％→76％)，流动相中b(70％→24％)；50～60min，流动相中a(76％)，流动相中b(24％)；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

精密量取不同浓度的混合对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，测得不同浓度混合对照品溶液的峰面积，以混合对照品溶液峰面积对数值为纵坐标，以相对应混合对照品溶液浓度对数为横坐标作标准曲线，分别计算得线性回归方程；另精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，测得供试品中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的峰面积，分别用回归方程计算6批辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量。

中链甘油三酯重复性测定混合对照品溶液的hplc图谱的0～20min放大图如图9所示，供试品hplc图谱的0～20min放大图如图10所示。

辛酸甘油二酯的含量重复性结果如表3所示，癸酸甘油二酯的含量重复性结果如表4所示。由表3和表4可知，本方法测定中链甘油三酸酯中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量重复性好。

表3辛酸甘油二酯的含量重复性结果

表4癸酸甘油二酯的含量重复性结果

实施例4

本发明检测方法的稳定性试验

本发明中链甘油三酯中辛酸甘油二酯和癸酸甘油二酯的含量检测方法的一种实施例，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取1份中链甘油三酯200mg，加入10ml甲醇溶解并稀释，摇匀，得到供试品溶液；

(2)测定：

液相色谱条件为：

色谱柱：c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；

检测器：蒸发光散射检测器(漂移管温度为72℃，载气流速为2.0ml/min，增益值为4，模式为分流模式)；

流动相：以体积比为8:2的乙腈-水混合溶剂为流动相a，以体积比为1:1的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相b进行梯度洗脱；所述流动相梯度洗脱的条件为：0～10min，流动相中a(76％)，流动相中b(24％)；10～30min，流动相中a(76％→30％)，流动相中b(24％→70％)；30～40min，流动相中a(30％)，流动相中b(70％)；40～50min，流动相中a(30％→76％)，流动相中b(70％→24％)；50～60min，流动相中a(76％)，流动相中b(24％)；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

精密量取同一份供试品溶液，分别在0小时，2小时，4小时，8时，12小时，24小时分别精密吸取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，测定各组分峰面积，分别计算24小时内辛酸甘油二酯峰和癸酸甘油二酯面积的rsd为分别为2.5％和2.9％，结果见表5，说明样品溶液在24h内相对稳定。中链甘油三酯稳定性0小时性测定供试品hplc图谱的0～20min放大图如图11所示，中链甘油三酯稳定性24小时性测定供试品hplc图谱的0～20min放大图如图12所示。

表5癸酸甘油二酯的含量重复性结果

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。