专利名称：一种肌内脂肪沉积fatp-1基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物分子育种的基因工程技术，特别是一种与猪肌内脂肪沉积相关的脂肪酸转运蛋白 I (fatty acid transport protein I, FATP-1)基因技术。
背景技术：
近年来，由于猪的选育工作中过度追求高瘦肉率，导致猪肉品质的严重下降。肌内脂肪(intramuscular fat, IMF)是影响肉品质的重要因素,与猪肉嫩度、风味及营养密切相关，目前已得到越来越多的认识和重视。肌内脂肪的沉积是一个复杂的生理生化过程，包括骨骼肌内甘油三酯的合成、分解及转运等过程。因此，骨骼肌内的甘油三酯代谢是肌内脂肪沉积的基础。脂肪酸转运蛋白1( fatty acid transport protein I, FATP-1)是长链脂肪酸的特异性转运蛋白，与骨骼肌内甘油三酯的积聚密切相关。Schaffer等(1994)通过表达克隆技术在小鼠3T3 LI脂肪细胞中首次发现FATP-I基因，其定位于质膜，引导外源性脂肪酸进入细胞，参与长链脂肪酸的摄入和酯化，对细胞内甘油三酯的合成具有重要作用。近来研究发现，FATP-I调控三羧酸循环活性及线粒体的代谢功能。FATP-I主要受过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)、激素(研究较多的是胰岛素)等多种细胞因子的调控，并与其他调节因子共同调节长链脂肪酸的转运。迄今为止，FATP-I基因已在鼠、人、牛、鸡等多物种中发现，是至今发现的脂肪酸转运蛋白家族六个成员中发现最早、研究最多的一个基因。FATP-I基因为71KDa，646个氨基酸的跨膜蛋白，主要在脂肪组织、心肌和骨骼肌表达。虽然FATP-I的结构、组织分布、功能及表达调控等的研究均取得了一系列的进展，但FATP-I对动物肉质的影响方面的报道还不是很多。进一步研究FATP-I的
遗传变异与肉质相关性及对脂肪沉积的影响等有着非常重要的意义猪是脂肪沉积型动物，其脂肪沉积能力在不同品种之间变化很大。我国一些肉质优良的地方猪种是最宝贵和稀缺的基因资源，这在优质猪肉的培育中有独特的利用价值。版纳微型猪是云南省优良的地方猪种，具有耐粗饲、适应性强、肉质优良、肌内脂肪丰富，肌纤维细密，肉质鲜嫩等优良特性。然而，目前对版纳微型猪的生长发育及肌内脂肪沉积的分子机制知之甚少。近年来，本课题组采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现FATP-I基因参与肌内脂肪细胞的脂类代谢过程，并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 FATP-I基因。因此，研究版纳微型猪FATP-I基因的序列与表达模式，分析其核苷酸和氨基酸序列结构特点，从分子水平了解版纳微型猪肌内脂肪沉积较多的特点，为进一步研究该基因的功能及为改善猪胴体脂肪性状及肉品质的育种工作提供理论基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种肌内脂肪沉积FATP-I基因，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现FATP-1基因 参与肌内脂肪细胞脂类代谢过程，并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 FATP-1基因。一种肌内脂肪沉积FATP-1基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内 月旨肪沉积相关的脂肪酸转运蛋白1 ( fatty acid transport protein 1，FATP-1)基因，基 因的⑶S序列全长为1941bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1。并且，⑶S核苷酸序列 编码646个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。对上述特征的肌内脂肪沉积FATP-1基因 设计引物，进行PCR扩增，检测FATP-1基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组 织表达谱，结果显示FATP-1基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明FATP-1基因在脂肪细 胞中调控脂肪沉积的功能。FATP-1是脂肪细胞的特征性基因，与肌肉组织中肌内脂肪沉积有关。本发明克 隆得到版纳微型猪FATP-1基因⑶S全序列，全长为1941bp，提交到Genbank，登录号为 JN713898。与Genbank提供的猪FATP-1基因相比较，发现有5个突变位点，分别位于第15、 441、747、930和1884位。编码的氨基酸有2个有义突变，分别位于第310和628位。推测该 氨基酸位点的突变可能导致版纳微型猪FATP-1蛋白质的分子量、等电点、二级结构、磷酸 化位点等特性都有所改变，而这些性质的改变可能与版纳微型猪肉品质优良的特点有关。FATP-1蛋白在物种间的同源性较高，通过进化树可以看出，猪与牛的亲缘性较近， 其次是人、小鼠、大鼠。猪FATP-1的氨基酸序列与牛、人、小鼠和大鼠的同源性分别为93%、 91%、87%和87%。FATP-1蛋白在不同物种间的高度保守性提示了该基因在各个物种中保持 相应不变的生理特点的分子基础。另外，FATP-1在脂肪组织中的高度表达，也证明了它在 肌内脂肪沉积方面具有重要作用。
图1是本发明的PCR扩增FATP-1基因图示。图2是本发明的FATP-1在不同组织中的表达水平柱图。图3是本发明的FATP-1基因酶切鉴定图。图4是本发明的进化树分析图。图5是本发明的FATP-1蛋白二级结构预测图。图6是本发明的FATP-1蛋白质磷酸化位点预测图。图7是本发明的FATP-1蛋白糖基化位点预测图。图8是本发明的FATP-1蛋白质疏水性分析图。图9是本发明的FATP-1蛋白质跨膜区预测图。图10是本发明的FATP-1蛋白的信号肽预测图。
具体实施例方式
一种肌内脂肪沉积FATP-1基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪 沉积相关的脂肪酸转运蛋白1 ( fatty acid transport protein 1，FATP-1)基因，其特征 在于基因的CDS序列全长为1941bp,其CDS核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1。并且，CDS核苷 酸序列编码646个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。对上述特征的肌内脂肪沉积FATP-1基因设计引物，进行PCR扩增，检测FATP-1基 因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示FATP-1基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明FATP-I基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。具体为
I、肌肉组织中总RNA的提取
采取50kg成年版纳微型猪肌肉组织立即放入液氮中保存备用。利用RNA提取试剂提取版纳微型猪肌肉组织总RNA，具体操作参照试剂盒说明进行。将提取的RNA反转录成 cDNA，_20°C保存，待用。2、PCR引物设计及PCR反应条件
根据 GenBank 中猪 FATP-1 序列信息(GenBank 登录号 NM_001083931),利用 Primer Premier 5.0设计引物，并合成。用于克隆的FATP-I基因的引物序列为
F :5’ - TAGGGACCTCTGTCTTAGCCTCACT -3’
R :5，- AGAAGAGGAGCGTCAGAGGAAGAAG -3，
用于荧光定量的FATP-I基因的引物序列为
F :5’ - TGGATGGGAAGGTTGGTG -3’
R:5’ - GAGGGTCCTGCTGGTTGAT -3’
内参18S rRNA的引物序列为
F :5’ -CTGCCTCCTTGGATGTG-3’
R :5’ -GCGGCTTTGGTGACTCTA-3’
FATP-I基因克隆的PCR反应条件为94°C预变性3min ;94°C变性O. 5min、62°C退火
O.5min、72°C延伸3min 35个循环；72°C后延伸IOmin进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定其亮度和特异性。通过PCR扩增，得到了长度为2037bp的片段。PCR扩增产物经I. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测后，确认扩增的产物的长度大小同于目的片段大小。荧光定量PCR的反应条件为94°C预变性3min;94 °C变性30 s，53°C退火30s、 72°C延伸30 8，39个循环；721后延伸7min进行扩增。数据处理的方法为，检测心、肝、 脾、肺、肾、肌肉、脂肪七个组织中FATP-I基因的相对表达量，实验数据以18S rRNA作为内参，采用双标准曲线法处理。结果显示，FATP-I在被检测的7个组织中都有表达，在脂肪中高量表达，在肺、脾、肝中大量表达，在肾和心中少量表达，在肌肉中微量表达。3、FATP-I基因的克隆及序列分析
按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒书说明书回收特异性条带，产物连接于pMD-18T载体，转化至ToplO感受态细胞，氨苄筛选挑取阳性克隆，分别接种于IOmL LB液体培养基中， 37°C振荡过夜，提取质粒经Ecor I和Hind III双酶切鉴定为阳性，进行测序。4、测序结果
⑶S全长1941bp，核苷酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. I所示，并提交到Genbank数据库，登录号为JN713898。CDS序列编码646个氨基酸，其氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2所示。5、测序结果与Genbank中提供的序列比对
登录http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪的核苷酸序列同 GeneBank中猪FATP-I基因(登录号为NM_001083931)的⑶S序列进行序列比对。发现⑶S 的核苷酸序列有5个突变位点，分别位于第15、441、747、930和1884位。因而导致氨基酸序列出现2个有义突变，即第310位的苏氨酸变为蛋氨酸和628位的酪氨酸变为半胱氨酸。 如说明书核苷酸和氨基酸序列表。6、FATP-I基因核苷酸与氨基酸序列同源性分析
登录 http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪 FATP-I 基因测序结果与牛(登录号为NM_001033625. 2 )、人(登录号为NM_198580. I )、小鼠(登录号为 NM_011977. 3)和大鼠(登录号为NM_053580. 2) FATP-I基因的核苷酸和氨基酸序列比对分析，结果显示版纳微型猪与牛、人、小鼠和大鼠的FATP-I基因的CDS序列同源性分别为 91%、88%、83%和83% ;CDS序列所编码氨基酸的同源性分别为93%、91%、87%和87%。如说明书核苷酸和氨基酸序列表。7、FATP-I基因的进化树分析
利用Meg4软件的邻近(Neighbor-joining)方法构建版纳微型猪(Genbank登录号 JN713898)、牛(登录号为NM_001033625. 2)、人(登录号为NM_198580. I)、小鼠(登录号为 NM_011977. 3)和大鼠(登录号为NM_053580. 2)FATP-I蛋白的系统进化树，结果显示版纳微型猪与牛的亲缘性较近，其次是人、小鼠、大鼠。8、FATP-I蛋白分子量、等电点预测分析
使用ExPASy的在线软件Compute pi/MW分析版纳微型猪FATP-I蛋白的等电点(pi) 为8. 62、理论分子量(pW)为71204. 2 Da。9、FATP-I蛋白质二级结构预测分析
登陆http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/,对版纳微型猪脂肪酸转运蛋白I蛋白质二级结构进行预测，共有218个螺旋、122个伸展链和306个卷曲结构。10、FATP-I蛋白质磷酸化位点预测
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,对猪 FATP-1 蛋白质憐酸化位点进行预测，结果显示，共有22个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点有10个、苏氨酸磷酸化位点有6个、酪氨酸磷酸化位点有6个。11、FATP-I蛋白质糖基化位点预测
登录 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/,对版纳微型猪 FAP-1 蛋白糖基化位点预测，结果显示FATP-I蛋白共有2个糖基化位点，分别在第330和518位。12、FATP-I蛋白质疏水性分析
登陆http://web. expasy. org/protscale/,对FATP-1蛋白质疏水性进行分析,结果显不为未水性蛋白。13、FATP-I蛋白质跨膜区预测
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/,对 FATP-1 蛋白质跨膜区进行分析， 结果显示13位至35位氨基酸为跨膜区，I至12位氨基酸在膜内，36至646位的氨基酸在膜外。14、FATP-I蛋白质信号肽的预测分析
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/,对 FATP-1 蛋白的信号肽进行预测。采用signalP-NN and signalP-HMM两种方法对信号肽可能存在的分割位点进行预测， 两种方法显示的结果一致，即FATP-I蛋白序列存在一个可能的信号肽结构，且分割位点在第31至32个氨基酸之间。
权利要求
1.一种肌内脂肪沉积FATP-I基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的脂肪酸转运蛋白I (fatty acid transport protein I, FATP-I)基因，其特征在于基因的⑶S序列全长为1941bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1，并且，⑶S核苷酸序列编码646个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。
2.根据权利要求I所述一种肌内脂肪沉积FATP-I基因，其特征在于对上述特征的肌内脂肪沉积FATP-I基因设计引物，进行PCR扩增，检测FATP-I基因在猪心、肝、脾、肺、肾、 肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示FATP-I基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明FATP-I基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。
全文摘要
本发明公开一种肌内脂肪沉积FATP-1基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的脂肪酸转运蛋白1(fattyacidtransportprotein1,FATP-1)基因，基因的CDS序列全长为1941bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。并且，CDS核苷酸序列编码646个氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。检测FATP-1基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示FATP-1基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明FATP-1基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。
文档编号C12Q1/68GK102604958SQ20111033911
公开日2012年7月25日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者冷俊楠, 刘维全, 朱宝利, 潘洪彬, 王静, 赵素梅, 高士争, 黄英 申请人:云南农业大学