一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法与流程

本发明属于植物制片技术领域，尤其涉及一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：甜菜的主要产品是糖。糖是人民生活不可缺少的营养物质，也是食品工业，饮料工业和医药工业的重要原料。除生产蔗糖外，甜菜及其副产品还有广泛开发利用前景。甜菜叶是甜菜的主要生长发育器官，主要起光合作用，叶柄组织切片观察表皮层结构紧密，叶柄维管柱结构清晰完整，木质部、形成层、韧皮部清晰可辩，导管和管胞被染成红色，为成熟的木质化的细胞。

石蜡切片技术因其具有经济、方便、适用、简便、易操作、设备要求不高、材料可长期保存等优点，该技术在组织学和病理学常规制片技术中成为最为广泛的应用，在植物的科学技术研究领域扮演着十分重要的角色。但是，石蜡切片制作过程经常存在切片不成带、弯曲、出现裂纹、皱缩、不粘片、脱落、薄厚不匀等诸多问题，在不同作物、同一种作物不同器官、同一器官不同发育阶段的每一环节所采取的方法都不同，在实际操作过程中均不能照搬实验指导或者文献资料，而需要进行反复摸索才可以制得一个理想的片子。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术的石蜡切片制作过程，经常存在切片不成带、弯曲、出现裂纹、皱缩、不粘片、脱落、薄厚不匀。

(2)现有技术中在不同作物、同一种作物不同器官、同一器官不同发育阶段的每一环节所采取的方法都不同，带来巨大的工作量，使得工作效率降低。

解决上述技术问题的方法和意义：切片刀口不锋利、蜡块与刀口平行角度不正确，是不能切成连续蜡带的主要原因。应注意刀口锋利度与蜡块的正确位置。蜡带上材料出现空洞是由于石蜡没有完全浸入材料应重新浸蜡。蜡带皱缩的原因是由于石蜡太软，融点较低或切片时温度过高所致。因此，在夏天切片宜用融点较高的石蜡。另外，切片过薄低于5微米需要低温否则也容易皱缩。切片较厚在12微米以上，如果石蜡太硬则易碎裂。蜡带弯曲是由于蜡块的上下两边修块不平行，而无法平展。蜡带出现裂纹或裂缝，是切片刀口某处有小口或切片刀已钝。应移动切片刀的位置。注意用毛笔刷去刀刃上的蜡屑。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法，

本发明是这样实现的，一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法，具体包括以下步骤：

步骤一：取材与固定：将材料进行分割，置于广口瓶，固定24h；

步骤二：脱水与透明：脱水2h，透明1.5h；

步骤三：染色：采用番红、固绿对染；染色在纯酒精：纯二甲苯比例为1:1透明过程中加入染色剂，进行染色；

步骤四：石蜡精炼：浸蜡用75℃恒温箱进行，分别标记为蜡杯ⅰ，蜡杯ⅱ，蜡杯ⅲ；

步骤五：包埋：采用半自动包埋机进行包埋，将材料放入包埋盒后摆好材料的位置，再将包埋盒放在碎冰机制成的冰块上，迅速冷却；

步骤六：修块、切片、粘片与脱蜡：将载玻片涂上一层粘片剂，滴一滴40℃左右的温水，将切好的蜡带用解剖针挑起放到上边，使切片展开，然后放到40℃烘箱或展片机上烘干，烘1h以上或更长时间；

步骤七：封片：湿封，先将加拿大树胶滴在组织的边缘位置，然后将盖玻片倾斜盖在胶液上，再将胶液压至组织上，让其自然风干。

进一步，步骤一中，分割材料，分割为3～5mm.固定于250毫升广口瓶，每瓶放置5～10个材料，固定24h。

进一步，步骤三中，染色剂量：1～2滴。

进一步，步骤四中，石蜡选用54～56，熔点53～57规格的石蜡进行包埋。

进一步，步骤六中，夏天高温季节切片之前，先将蜡块放入冰箱中冰冻处理，保持石蜡的硬度；当室内干燥时，增加室内湿度。

进一步，步骤六中，粘片剂为1:1体积比的鸡蛋清：甘油，如：100ml蛋清加100ml甘油，注意；蛋清应打成细沫状。配置好后的粘片剂过滤备用。

进一步，步骤六中，脱蜡，夏天高温时，每一步骤3～5min；冬季低温时，延长时间或提高室内温度。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明明确甜菜叶的内部组织结构，对取材与固定、脱水与透明、熔蜡、浸蜡与包埋，切片、粘片、染色、制片等关键环节进行了优化，节省时间提高制片效率和成功率。

与现有技术相比，本发明有以下优势：

(1)选择材料：用于制片的材料，应注意选材适当，为了获得理想的观察效果，应该选择正确、健康、标准的实验材料。如果为了观察特定结构，则可选要观察的特定的发育部位。实验标本不要损伤或者变干，取材应立即放入标本箱或盛有固定液的广口瓶中或用湿纸包裹带回实验室固定。

(2)材料固定；切取材料压力不能过大，以免压坏组织。为了使固定液迅速渗入材料，因此所截取的体积不宜过大，圆柱状的材料，直径超过1厘米应劈成半圆或1/4。材料处理好之后应该立即投入固定液中，固定液的选择根据材料的性质及制片的目的而定。要尽快杀死并固定材料。能否迅速透入与固定液的渗透力、浓度、温度、以及材料的致密程度有关。固定液的用量一般为固定材料的总体积的20倍。水分少的材料可减少用量，含水多的材料应该换一次固定液，保证固定液维持一定的浓度，这样可在最短的时间渗透材料。

(3)脱水：脱水的各级酒精用量约为材料体积的3-5倍，各级停留时间视材料性质、大小而定，一般为1-6小时。

(4)透明：透明时在1:1酒精：二甲苯中加入少许番红干粉，使材料便于着色，包埋在石蜡中容易看见，切片时容易掌握材料方向。透明过程中如果液体变浑浊则表示脱水不干净，应再次进行脱水透明。

(5)浸蜡：浸蜡是使石蜡慢慢溶于浸有材料的透明剂中，使石蜡完全代替透明剂进入材料组织中。为了避免石蜡与材料直接接触引起材料收缩，采用将石蜡溶化后在冷凝时搅拌使大量空气进入石蜡，然后切成小块藏于严密防尘的容器内，用时取适当数量浮于二甲苯上。浸蜡过程小心不要夹碎材料。

(6)包埋：包埋的过程要尽可能迅速，利用碎冰助凝。如果石蜡凝固太慢会发生结晶，结晶的石蜡是不能切片的。冷凝后用解剖刀或刀片将材料周围的多余的蜡修去。

(7)切片：切片不连续或蜡片卷曲蜡带不直等现象要注意及时纠正：

1)切片刀口不锋利、蜡块与刀口平行角度不正确，是不能切成连续蜡带的主要原因。应注意刀口锋利度与蜡块的正确位置。

2)蜡带上材料出现空洞是由于石蜡没有完全浸入材料应重新浸蜡。

3)蜡带皱缩，是由于石蜡太软融点较低或切片时温度过高。所以夏天切片宜用融点较高的石蜡，另外，切片过薄低于5微米需要低温否则也容易皱缩。切片较厚在12微米以上，如果石蜡太硬则易碎裂。

4)蜡带弯曲，是由于蜡块的上下两边修块不平行，而无法平展。

5)蜡带出现裂纹或裂缝，是切片刀口某处有小口或切片刀已钝。应移动切片刀的位置。注意用毛笔刷去刀刃上的蜡屑。

(8)粘片：蜡片切好后需要粘在载玻片上，这个步骤为粘片。在彻底清洗干净的载玻片是涂上一滴粘贴剂，用量绝对不能过多，用小指涂匀，再加几滴蒸馏水，用解剖针轻轻将蜡片放在液面上，将带有蜡片的载玻片放在展片台上。蜡片受热后慢慢伸展，完全申直后，用吸水纸吸去多余的水分，在展片台上烘干后，可在30度温箱中放置一昼夜，加速干燥。注意：1)蜡片背面比较平滑，而正面比较粗糙，因此应将背面和载玻片接触相粘贴，这样会比较牢固。2)载玻片应该保持清洁，否则在脱蜡时会发生材料脱落的现象。

(9)染色制片：切片干燥后需要经过脱蜡，脱蜡就是将包埋材料外面及渗透到组织中的石蜡溶解掉。溶蜡剂常用二甲苯，步骤是将切片放于二甲苯5-10分钟，待溶去石蜡后再转入1:1二甲苯：纯酒精中，然后从纯酒精再经过各级浓度酒精下降至染色剂溶液的浓度染色；石蜡切片染色过程如下：二甲苯(脱蜡)→二甲苯→1:1(二甲苯：纯酒精)→纯酒精→纯酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→蒸馏水→铁矾4％→蒸馏水→苏木精0.5％→蒸馏水→50％酒精→番红1％在50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→纯酒精→纯酒精→二甲苯(两次)。

本发明通过改进和优化达到事半功倍的效果。提高工作效率，建立简便的适合于多种植物不同器官的切片观察方法。实验方法可作为科学研究、实验教学、以及其他需要植物切片观察和鉴定的参考。

附图说明

图1是本发明实施例提供甜菜叶石蜡包埋制片的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的低倍镜4x16下的甜菜主叶脉切片示意图。

图3是本发明实施例提供的低倍镜4x16下的甜菜叶切片整体示意图。

图4是本发明实施例提供的40x16观察的甜菜叶示意图。

图5是本发明实施例提供的40x16观察的甜菜贮藏组织示意图。

图6是本发明实施例提供的40x16观察的甜菜叶柄维管柱形态特征示意图。

图7是本发明实施例提供的40x16观察的甜菜叶柄示意图。

图8是本发明实施例提供的10x16观察的甜菜叶柄的维管柱示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对甜菜叶的特点及石蜡包埋制片方法中经常存在的问题，通过大量摸索性试验，得到了适合甜菜叶柄的石蜡切片方法，同传统石蜡切片法相比，在固定、石蜡选择、石蜡精炼、脱水、透明、染色、包埋、切片、粘片、脱蜡、封片等方面进行了改进，提高了制片效率。

下面结合附图对本发明的制片方法作进一步详细说明；

本发明实施例提供甜菜叶石蜡包埋制片的方法，经过：固定→清洗→脱水→透明→浸蜡与包埋→切片→粘片→溶蜡→染色→脱水→封固。石蜡切片法的过程和先后顺序不能颠倒；将材料迅速杀死与固定，其目的在于尽量减少组织因死亡而引起的植物细胞内部变化。迅速杀死及固定细胞的作用，就是立刻停止原生质的各种活动，保持材料的新鲜度进行制片，对植物组织结构和植物细胞生物学等方面的研究非常重要，大多数的实验材料必须经过染色制片，才能观察到它的细微结构，通常需要制成永久切片进行保存。

如图1所示，本发明实施例提供甜菜叶石蜡包埋制片的方法，具体包括以下步骤：

s101：取材与固定：将材料进行分割，置于广口瓶，固定24h；

s102：脱水与透明：脱水2h，透明1.5h；

s103：染色：采用番红、固绿对染；染色在纯酒精：纯二甲苯比例为1:1透明过程中加入染色剂，进行染色；

s104：石蜡精炼：浸蜡用75℃恒温箱进行，分别标记为蜡杯ⅰ，蜡杯ⅱ，蜡杯ⅲ

s105：包埋：采用半自动包埋机进行包埋，将材料放入包埋盒后摆好材料的位置，再将包埋盒放在碎冰机制成的冰块上，迅速冷却；

s106：修块、切片、粘片与脱蜡：将载玻片涂上一层粘片剂，滴一滴40℃左右的温水，将切好的蜡带用解剖针挑起放到上边，使切片展开，然后放到40℃烘箱或展片机上烘干，烘1h以上或更长时间；

s107：封片：湿封，先将加拿大树胶滴在组织的边缘位置，然后将盖玻片倾斜盖在胶液上，再将胶液压至组织上，让其自然风干；

在本发明的优选实施例中，步骤s101中，本发明实施例提供的分割材料，分割为3～5mm.固定于250毫升广口瓶，每瓶放置5～10个材料，固定24h。

在本发明的优选实施例中，步骤s103中，本发明实施例提供的染色剂量：1～2滴。

在本发明的优选实施例中，步骤s104中，本发明实施例提供的，石蜡选用54～56，熔点53～57规格的石蜡进行包埋。

在本发明的优选实施例中，步骤s106中，本发明实施例提供的夏天高温季节切片之前，先将蜡块放入冰箱中冰冻处理，保持石蜡的硬度；当室内干燥时，增加室内湿度。

在本发明的优选实施例中，步骤s106中，本发明实施例提供的按照体积比粘片剂为1:1比例的鸡蛋清：甘油。

在本发明的优选实施例中，步骤s106中，本发明实施例提供的脱蜡，夏天高温时，每一步骤3～5min。冬季低温时，延长时间或提高室内温度。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步详细说明；

实施例1；

1、制片：

(1)脱水与透明：明确了脱水时间与透明时间的相关性，即脱水时间越长，透明时间就越短，本实验脱水2h，透明为1.5h。

(2)染色：传统染色方法是在70％酒精脱水时加入染色剂.但实际操作过程中，即使是放置一个晚上，已染色的材料也会在后续逐级高浓度的酒精中被冲洗掉，最后几乎全部脱色.本实验摸索出在1:1纯酒精：纯二甲苯中透明过程中加入染色剂效果最好。

(3)石蜡选择与精炼：实验对比了规格52～54，熔点51～55和规格54～56，熔点53～57两种石蜡的包埋效果，筛选出规格54～56，熔点53～57规格的效果较好。浸蜡用75℃恒温箱进行，分别标记为蜡杯ⅰ，蜡杯ⅱ，蜡杯ⅲ。多次熔蜡换杯不少于3次为宜。

(4)包埋：包埋过程中竖立材料甜菜叶是石蜡切片中难以操作的一步，实际操作过程中叶片存在难以竖立、组织与石蜡分离等现象。本实验采用半自动包埋方法，效果很好.

(5)切片、粘片和脱蜡：这几个环节与室内温度密切相关.夏天操作时容易出现组织压缩，切片皱褶不易展开之现象。本实验摸索出夏天高温季节切片之前，先将蜡块放入冰箱中冰冻一会，保持石蜡的硬度；同时，当夏季室内干燥，蜡片受静电影响卷片，不能形成蜡带时，在旁边放一盆温水增加室内湿度可切出较好的切片。

(6)展片：用加热展开的方法，即在粘片时，在载玻片上涂上薄薄的一层粘片剂再滴一滴蒸馏水在载玻片上，取切片，浮置在水滴上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，以材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入30～40℃温箱中约24h烘干。

(7)脱蜡：一般脱蜡、染色、脱水透明过程所用的溶液在重复用过3～4遍后，就要更换溶液。如果有水分进入二甲苯，二甲苯溶液就会出现白色浑浊甚至出现水珠状的悬浮物质，经过染色的载玻片逐级放入其他溶液缸中的时候，也会导致其他缸中的溶液变色.一般，观察其颜色变化的深浅来断定是否该进行溶液换置。

(8)封片：通常封片前切片在空气中放置时间太长，二甲苯挥发，不仅使封片剂难以进入组织间隙，而且切片中易出现类似色素样的点状结晶和像核一样的黑色圆斑。封片用的是中性加拿大树胶，先将胶液滴在组织的边缘位置，然后将清洗干净的盖玻片的倾斜盖在胶液上，再缓慢地将胶液轻轻压至组织上，最好选用稀一点的加拿大树胶封片。封好片贴上标签自然风干。

2、甜菜叶及叶柄石蜡制片观察

利用石蜡切片技术获得了甜菜叶及叶柄完整组织切片，番红固绿染色，效果清晰、染色均匀，实验结果如图所示。甜菜叶是甜菜的主要生长发育器官，主要起光合作用，叶柄组织切片观察表皮层结构紧密，叶柄维管柱结构清晰完整，木质部、形成层、韧皮部清晰可辩，导管和管胞被染成红色，为成熟的木质化的细胞。叶的组织切片完整，主要观察到了栅栏组织、海绵组织、晶体细胞和上表皮和下表皮细胞。叶的表皮细胞只有一层，叶柄的表皮层有4-5层细胞。贮藏组织发达，为不规则的薄壁细胞组成。

如图2所示，低倍镜4x16观察的甜菜主叶脉切片示意图。

如图3所示，低倍镜4x16观察甜菜叶切片整体示意图。

如图4所示，甜菜叶，上下表皮细胞各一层，有栅栏组织、海绵组织、贮藏细胞和晶体细胞，晶体为黄色含量比较多，可能与含糖量有关。观察倍数40x16。

如图5所示，观察倍数40x16，获得的甜菜贮藏组织为不规则的薄壁细胞组成示意图。

如图6所示，观察倍数40x16。甜菜叶柄，维管柱形态特征明显：木质部(导管；管胞)、形成层、韧皮部和薄壁细胞形态特征清晰。

如图7所示，甜菜叶柄，表皮层细胞由4-5层排列致密的细胞构成，细胞形态规则，观察倍数40x16。

如图8所示，观察倍数10x16，甜菜叶柄的维管柱的木质部、形成层、韧皮部特征明显，

3、结果

(1)本试验对甜菜叶基本组织结构进行观察的同时，实现了甜菜叶的石蜡包埋技术方法。

(2)甜菜叶由外到内由上表皮、皮层、维管束、下表皮组成，表皮细胞近似长方形，排列紧密。上表皮细胞排列致密，有栅栏组织和疏松的海绵组织，针对甜菜叶的结构特性，在传统石蜡包埋的基础上，在固定、石蜡选择、石蜡精炼、脱水、透明、染色、包埋、切片、粘片、脱蜡、封片等方面进行了改进，提高了制片效率。

(3)具体改进方法为：脱水2h、透明1.5h；染色是在1:1纯酒精：纯二甲苯中透明过程中加入染色剂；石蜡选择规格为54～56，熔点53～57的；浸蜡用75℃恒温箱进行多次熔蜡、连续换3次换蜡杯；采用半自动包埋方法，用半自动包埋机。迅速将已经摆好的材料叶片竖立起来；如果在夏天高温季节切片，先将蜡块放入冰箱中冰冻一会，保持石蜡的硬度；同时，当室内干燥时，在旁边放一盆温水增加室内湿度；粘片为自制粘片剂，将切好的蜡带轻轻放到涂有粘片剂的滴一滴40℃左右的温水的载玻片上，使切片展开，并放到40℃烘机上烘干，一般需要烘0.5h以上或更长时间；脱蜡的时间长短与气温有关。夏天高温时，时间可以短一点，每一步骤3～5min；气温较低的冬天时，要延长时间，甚至提高室温，否则蜡不容易被脱去，从而影响后续的步骤；溶液换置一般脱蜡、染色、脱水透明过程所用的溶液在重复用过3～4遍后，就要更换溶液.如果有水分进入二甲苯，二甲苯溶液就会出现白色浑浊甚至出现水珠状的悬浮物质，经过染色的载玻片逐级放入其他溶液缸的时候，也会导致其他缸中的溶液变色。一般以溶液颜色变化的深浅来断定是否该置换溶液。封片，将加拿大树胶滴在组织的边缘位置，然后将清洗干净的盖玻片倾斜盖在胶液上，再缓慢地将胶液轻轻压至组织上，最好选用稀一点的胶液。封好片贴上标签自然风干。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。