一种基于DGT技术进行原位显色监测有效磷的方法与流程

本发明属于环境化学领域，更具体地说，涉及一种基于dgt技术进行原位显色监测有效磷的方法。

背景技术：

磷肥是支撑现代农业高速发展的重要支柱之一。世界磷肥使用量在1960至1995年的35年间增长了一倍。根据薄瀛等人在2016年4月第4期《磷肥与复肥》发表的文章中报道，我国的磷肥使用量在2006年后稳定在1100万～1200万t/a。因此开发可靠、稳定、高效的采样和测定技术来监测磷酸盐在环境中的行为及效应对农业与环境的可持续发展有着至关重要的作用。

梯度扩散薄膜技术(diffusivegradientsinthinfilms，dgt)是由英国兰卡斯特大学davidwilliams和张昊发明的一种原位、非破坏性的被动采样技术。自上世纪90年代以来由英国兰卡斯特大学davidwilliams和张昊发明以来，dgt技术在测定水体、土壤和沉积物中有效态的金属阳离子和含氧阴离子方面得到了广泛的应用，seanmason等人发现，dgt技术对土壤中磷酸盐的监测相较其它技术能够更好的预测小麦对磷肥的吸收，有助于精准施肥和农业可持续发展战略的实施。

显色技术是在环境监测中常用的、低成本、可靠的测量方法，硫、磷、铜等都可以通过显色法实现定量监测，dgt技术结合显色方法进行定量监测方法受到越来越多的关注，然而现有技术在dgt与显色法结合进行有效磷的监测方面存在预处理麻烦、等待时间长(>5天)的缺陷，较为繁琐的预处理步骤和较长的预处理时间使该技术无法原位分析，因此也不利于大规模应用。

经检索，现有技术存在相关的申请案，如中国专利号cn201310079043.9，公开日期为2014年9月17日的申请案公开了一种基于电脑成像密度计量(cid)技术测定磷含量的dgt方法，其将zro2磷固定膜组装成dgt装置放入磷介质中吸收磷后，将该膜放入85℃热水中热处理5天，促使薄膜吸收的磷被进一步被固定，将该固定膜再放入着色剂中进行着色，利用扫描仪对着色后的薄膜进行扫描，利用软件将扫描获得的图像颜色转成灰度，再根据建立的zro2膜对磷累积量与表面灰度的校正曲线，将得到的灰度转化成磷累积量；根据磷固定膜表面磷累积量通过fick第一扩散定律计算得到含磷介质中的磷含量。该申请案的方法采用cid技术，避免了常规方法中切片、提取等操作，可非常快速、简便地获得膜中磷积累量和含磷介质中的磷含量和空间分布等信息，然而该申请案的方法存在以下缺陷：其需要对采样后的吸附膜进行预处理：具体操作需要将膜放入85℃热水中热处理5天，促使薄膜吸收的磷被进一步被固定，才能该固定膜再放入着色剂中进行着色，预处理操作时间长，步骤繁琐。

中国专利号cn201510940840.0，公开日期为2016年5月4日的申请案公开了一种原位同步获取水体、土壤或沉积物中活性磷和溶解氧二维分布的方法，采用dgt-po功能复合膜组装成dgt装置，所述的dgt-po复合膜包括透明支撑体、荧光传感层和dgt固定层，第一步基于荧光分析原理，采用图像技术实时获取复合膜po层的do荧光强度图像，然后第二步将该复合膜处理后进行膜显色，并通过电脑成像密度计量技术获取dgt层的srp显色的图像，再根据所得到的图象对srp和do进行计量和检测。所述的方法采用一种改进的薄膜显色-电脑密度成像技术以及rgb三色比率定量技术，通过dgt、po双通道，同步实现对基质中活性磷、溶解氧进行原位监测。该申请案的方法需要将取出dgt-po复合膜后进行酸洗、膜加热等预处理，预处理后的dgt-po复合膜加入磷显色剂采用钼蓝比色法进行膜显色，因此不可避免的存在上述预处理繁琐，预处理等待时间长的缺陷。

基于现有技术的缺陷，亟需发明一种新的基于dgt技术进行原位显色监测有效磷的方法。

技术实现要素：

1.发明要解决的技术问题

针对现有技术中基于dgt技术进行显色监测有效磷的方法均存在预处理步骤繁琐，等待时间长等问题，本发明提供了一种操作简单、不需要预处理的基于dgt技术进行原位显色监测有效磷的方法。

2.技术方案

针对于现有技术的问题，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种基于dgt技术进行原位显色监测磷的方法，采用dgt装置采样，采样结束后dgt装置直接与显色剂接触显色，显色后的吸附膜采用cid装置定量分析，所述的dgt装置中的吸附膜采用metsorb材料制备。

作为本发明更进一步的改进，所述吸附膜的制备过程包括以下步骤：

1)将metsorb粉末与dgt交联剂、去离子水、丙烯酰胺单体水溶液均匀混合，得到混合溶液；

2)向步骤1)得到的混合溶液中依次加入过硫酸铵、temed，混合后注入两片玻璃板空隙中，静置处理，得到成型胶片；

作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)中metsorb粉末与dgt交联剂、去离子水、丙烯酰胺单体水溶液混合的时间为10～15分钟。

作为本发明更进一步的改进，所述步骤2)中混合液与过硫酸铵、temed混合时间为15～20s，在烘箱里静置时间为30分钟到1小时。

3)将所述成型胶片放置在去离子水中膨胀，得到吸附膜。

作为本发明更进一步的改进，所述dgt装置还包括扩散膜，所述扩散膜为pes滤膜。

作为本发明更进一步的改进，所述pes滤膜孔径为0.45μm，厚度为0.14mm。

作为本发明更进一步的改进，所述吸附膜底部放置ptfe薄片。

作为本发明更进一步的改进，所述的ptfe薄片厚度为0.04mm

作为本发明更进一步的改进，所述dgt装置与显色剂接触时间为25～30分钟。

作为本发明更进一步的改进，所述显色剂采用磷钼杂多酸法、磷钒杂多酸法、磷钼杂多蓝法、三元杂多蓝法、离子缔合物法配制。

作为本发明更进一步的改进，所述cid装置定量分析过程包括以下步骤：

1)清洗所述吸附膜、将清洗过的吸附膜放置于去离子水中，去除吸附膜多余的水分；

2)用cid装置对吸附膜进行扫描；

3)使用imagej软件将颜色转化成灰度，利用标准曲线定量计算。

作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)去离子水的温度为5～10℃。

作为本发明更进一步的改进，：所述步骤1)放置在去离子水中的时间为2～5分钟。

3.有益效果

采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下显著效果：

(1)本发明的基于dgt技术进行原位显色监测有效磷的方法，与中国专利号cn201310079043.9公开的申请案相比，本发明的方法在显色前无需在85℃的高温条件下对吸附膜进行120小时的加热处理，其将采样后的dgt装置直接与显色剂接触即可显色，并将显色稳定的dgt吸附膜在5～10℃的去离子水中放置2～5分钟即可采用cid技术定量分析，操作简单，省去了预处理步骤，大大缩短了处理时间，使dgt装置与显色结合进行有效磷的检测更有利于原位分析，进一步使该技术大规模应用。

(2)本发明的基于dgt技术进行原位显色监测有效磷的方法，利用metsorb材料制备吸附膜，一方面由于被吸附的磷酸盐可以直接与显色剂反应；另一方面由于metsorb材料制备的吸附膜为白色，不会对扫描成像造成干扰，因此在cid装置检测前无需对dgt吸附膜进行洗脱，利于直接在原位场地进行分析，无需将装置带回实验室，简化了操作步骤。

(3)本发明的基于dgt技术进行原位显色监测有效磷的方法，直接将pes滤膜作为扩散膜，与现有技术中使用水凝胶材料为扩散膜层相比，减小了扩散膜层的厚度，在一定程度上增加了磷的吸附量，从而达到更好的显色效果；如果需要长时间放置，还可以对扩散膜层的厚度进行调节，以满足不同处理条件下的要求；此外，本发明的dgt装置在吸附膜底部放置ptfe薄片作为吸附膜的支撑材料，可以避免吸附膜在后续处理过程中因为形变而导致颜色测定有误差，进一步达到较佳的显色效果。

(4)本发明的基于dgt技术进行原位显色监测有效磷的方法，与cn104048956a公开的申请案的方法相比，正磷酸盐吸附量与cid监测给出的灰度值之间的关系符合指数性增长，且在正磷酸盐吸附量低于3.2μg时，满足线性关系的公式，计算结果准确可靠，且将本发明的方法测定的有效磷的浓度值与epa方法365.2测定值相比，二者误差在5％以内，进行t检验二者无明显差异。

(5)本发明的基于dgt技术进行原位显色监测有效磷的方法，在溶液ph值为4～8的范围内，不受溶液ph值的影响；且在as的浓度低于1000μg/l的条件下该显色方法不受影响，因此本发明的方法满足大部分测量环境的要求，应用范围广。

附图说明

图1为吸附量与cid装置监测时灰度的关系；

图2为正磷酸盐在吸附膜上的吸附量与颜色的关系；

图3为测量值在不同ph值条件下的变化情况；

图4为测量值在含有不同as浓度环境中的变化情况。

具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，结合附图和实施例对本发明作详细描述。

实施例1

本实施例为本发明的基于dgt技术进行原位显色监测有效磷的方法中吸附膜的制备过程及dgt装置的组装。

吸附膜的制备过程包括以下步骤：

1)将2.0g的metsorb粉末(干重)与1.50gdgt交联剂(dgtgelcross-linker，购买自英国dgtresearchltd.公司)、4.75ml去离子水、3.75ml丙烯酰胺单体水溶液(40％w/v，购买自vwr，货号97064-522)放置在摇床(购买自赛洛杰克，型号sk-l80-pro)上，速度档为80的条件下均匀混合10分钟，得到混合液；

2)向步骤1)中的混合液依次快速加入过硫酸铵(10％w/v，购买自vwr，货号m133-100g)60μl、temed(购买自vwr，货号443083g)15μl，混合15～20s，快速注入两片玻璃板空隙中，并静置在45℃的烘箱里45分钟至1个小时。其中，玻璃板空隙厚度为0.25mm；

3)从烘箱取出后，将成型的胶片放置在500ml的去离子水中，24小时内重复换置4次500ml的去离子水，并让其在去离子水中自然膨胀至厚度为0.5mm的胶片。

现有技术中的dgt装置由过滤膜以、扩散膜和吸附膜以及固定这3层膜的塑料外壳组成，其中过滤膜主要用于避免待测环境中的颗粒物进入dgt装置，扩散膜能够让溶液态的离子自由扩散，现有技术中扩散层一般是水凝胶。

本发明去除了常规dgt装置使用的水凝胶扩散层，直接以孔径为0.45μm的pes滤膜(购买自vwr，货号为514-4156)作为扩散膜，该滤膜的厚度为0.14mm，减小了扩散膜层的厚度，因此在一定程度上可以增加磷的吸附量，从而达到更好的显色效果；如果需要长时间放置，还可以对扩散膜层的厚度进行调节，以满足不同处理条件下的要求。

为了避免吸附膜在后续处理过程中因为形变而导致颜色测定有误差，本发明在吸附膜底部放置ptfe薄片作为吸附膜的支撑材料，ptfe薄片厚度为0.04mm。

实施例2

本实施例基本同实施例1，不同之处在于：

步骤1)中metsorb粉末、dgt交联剂、去离子水和丙烯酰胺单体水溶液混合的时间为15分钟；步骤2)混合液与过硫酸铵、temed混合时间为20s，在烘箱里静置时间为1小时。

实施例3

本实施例基本同实施例1，不同之处在于：

步骤1)中metsorb粉末、dgt交联剂、去离子水和丙烯酰胺单体水溶液混合的时间为12分钟；步骤2)混合液与过硫酸铵、temed混合时间为18s，在烘箱里静置时间为50分钟。

实施例4

本实施例为采用本发明的方法对水体中的正磷酸盐进行测定，具体步骤为：

1)采样：将组装好的dgt装置放置在水面下5米的位置，在每个采样点靠近装置放置的位置且与探针中间采样层相同深度处，同步放置一颗提前设置好读取频率的纽扣温度计。所述的温度计购买自上海沃第森电子有限公司，型号为：ds1922l。

2)装置的回收：用去离子水冲洗dgt装置，去除装置表面可能存在的颗粒物，用滤纸或实验室用无屑纸巾小心地吸干装置表面的水分后封存在食品级自封袋中。如果不马上对装置进行分析，应该将dgt装置保存在4℃的环境下。

3)配制显色剂，该过程包括以下步骤：

3-1)将16g钼酸铵充分溶解到100ml的去离子水中，配置成溶液a；

3-2)再将0.28g的酒石酸锑钾充分溶解到100ml的去离子水中，配置成溶液b；

3-3)将3ml的溶液a和1ml的溶液b与10ml的0.25mol/l硫酸溶液充分混合配置成溶液c待用；

3-4)进行显色前，将1.76g的抗坏血酸充分溶解至100ml的去离子水，并取6ml该溶液与14ml溶液c混合后，用去离子水稀释至100ml，形成最终的显色剂，该显色剂内含有0.0226mol/lmoo4^2-和8.6mmol/l的vc^-，显色剂的ph稳定在0.5±0.02；

4)dgt显色，该过程包括以下步骤：

4-1)将上述dgt装置整体放入20ml的显色剂中，持续20分钟，如果dgt放置在4℃环境中保存，为了减少温度对显色的影响，须提前将dgt装置置于室温下20～30分钟；

4-2)将吸附膜从装置中取出，用低温去离子水小心清洗表面，将清洗过的吸附膜置于10℃去离子水中5分钟；

4-3)用滤纸吸走吸附膜表面多余的水分，用cid装置对着色稳定后的吸附膜进行扫描，利用imagej软件将颜色转化成灰度。

与中国专利号cn201310079043.9公开的申请案的方法相比，本发明的方法在显色前无需在85℃的高温条件下对吸附膜进行120小时的加热处理，通过将显色剂直接与采样后的dgt装置接触进行显色，再对显色的dgt吸附膜进行5分钟的去离子水处理，就可使用cid技术定量分析，大大节约了时间成本。

5)建立标准曲线进行定量计算，该过程包括以下步骤：

5-1)配制三组2l的0.01mol/l的nano3溶液(analar，vwr)，三组溶液中分别含有20μg/l、200μg/l和2000μg/l的磷酸二氢钾(analar，vwr)；溶液的配制需提前一天准备好，用磁力搅拌器进行12小时的搅拌，使空气中的二氧化碳与溶液中的达到平衡状态；

5-2)将dgt装置放入到上述溶液中，对溶液中的正磷酸盐进行富集，时间为4小时；实验开始前、2小时后、结束时，需要用水银温度计对溶液的温度进行测量记录；

5-3)取出dgt装置，用去离子水清洗dgt装置表面。每组将3个dgt装置与上述显色剂接触25分钟进行显色。

对比实验(常规洗脱加显色方法)：

另外3个dgt装置用常规的方法对吸附在吸附膜上的正磷酸盐进行监测，具体步骤为：

a)将装置中的吸附膜取出放置在5ml，0.25mol/l的硫酸溶液中进行24h提取。提取用的离心管应放置在摇床上振荡；b)将20g的钼酸铵溶解在500ml的去离子水中，形成溶液(1)；c)将0.28g的酒石酸锑钾溶解到100ml的去离子水中，形成溶液(2)；d)将10ml的去离子水、3ml的溶液(1)和1ml的溶液(2)充分混合，形成溶液(3)；e)将吸附膜从5ml的硫酸提取液中取出，将0.7ml的溶液(3)加入到5ml的硫酸提取液中，充分混合形成溶液(4)；1.76g的抗坏血酸加入到100ml的去离子水里，充分混合。将0.3ml的此混合液加入到5.7ml的溶液(4)中，迅速混匀并静置15分钟使颜色变化稳定。使用分光光度计测量，波长选择为801nm。

实验在3组2l的0.01mol/l的nano3溶液中进行(analar，vwr)溶液中分别含有20μg/l、200μg/l以及2000μg/l的磷酸二氢钾(analar，vwr)。溶液的配置需提前一天准备好，并用磁力搅拌器进行12小时的混合，使空气中的二氧化碳与溶液中的达到平衡状态。

搅拌12小时后，将dgt装置放入到溶液中，对溶液中的正磷酸盐进行富集，时间为4小时。同时，3个dgt用食品级的洁净塑料袋封装用于空白值的测量。实验结束时与其它dgt装置经相同的方法处理。

结果如图1、图2所示，图1为正磷酸盐吸附量与cid装置监测时灰度的关系；图2为正磷酸盐在吸附膜上的吸附量与颜色的关系。

图1中纵轴为正磷酸盐吸附量从0.3μg增加到65μg，对应的纵轴为cid监测给出的灰度值，数值从25增加到140；两者的关系符合指数性增长，且在正磷酸盐吸附量低于3.2μg时，满足公式1的线性关系。

公式1：y＝-145.7766e^-0.4130x+183.7675

公式1由metlab拟合而来，其中e为指数，y代表cid扫描的灰度值，x代表dgt吸附膜上的正磷酸盐的质量，上述公式根据y计算x，即由cid扫描的灰度值计算dgt吸附膜上的正磷酸盐的质量，计算结果准确可靠。

与现有技术中利用氧化铁作为吸附材料的dgt装置相比，在检测前无需对dgt吸附膜进行洗脱，利于直接在原位场地进行分析，无需将装置带回实验室，简化了操作步骤。

实施例5

本实施例基本同实施例4，不同之处在于：

dgt显色步骤中，dgt装置与显色剂接触时间为26分钟，显色后的吸附膜置于8℃的去离子水中放置7分钟。

实施例6

本实施例基本同实施例4，不同之处在于：

dgt显色步骤中，dgt装置与显色剂接触时间为30分钟，显色后的吸附膜置于5℃的去离子水中放置8分钟。

实施例7

本实施例为监测环境中的ph值对本发明方法的监测值影响。

实验溶液分为3组，基础溶液为含有20μg/l的磷酸二氢钾的0.01mol/l的nano3溶液。溶液的ph值通过对基础溶液用滴定法添加1mol/l的nahco3(analar,vwr)实现。

实验组分为三组，分别将ph值调节至4.0±0.2、6.0±0.2、8.0±0.2。每组溶液分别放置3个dgt装置作为平行样。

实验进行4小时，在dgt放置入溶液中后的2分钟内、2小时后，以及取出dgt装置前2分钟内需要分别对溶液的温度进行测定，并用所得温度的平均值进行溶液浓度的计算。计算公式如下所示(公式2)。

公式2：cdgt＝mδg/dat

其中cdgt(μg/l)为dgt装置预测的溶液浓度，m为用cid扫描法测得的吸附在吸附膜上的正磷酸盐的质量(μg)，△g为扩散膜的厚度，d为正磷酸盐在滤膜中的扩散系数(其单位及数值如表1所示)，a为dgt装置的采样面积(cm)，t为实验过程的平均温度(℃)。

表1正磷酸盐在滤膜中的扩散系数

其中m的值由实施例4中的公式1通过cid灰度值换算得到。本实验三组实验组的m值分别为：55.1±2.2(ph＝4)、58.2±3.5(ph＝6)和53.3±1.6(ph＝8。经公式2计算得到的预测浓度cdgt分别为：19.9±0.8(ph＝4)、21.0±1.3(ph＝6)、19.2±0.6(ph＝8)。溶液浓度经epa方法365.2测得的数值为cs＝20.2μg/l。cdgt与溶液浓度cs的误差均在5％以内，且t检验cdgt与cs均无明显差异(p<0.05)。图3为测量值在不同ph值条件下的变化情况。

本发明的一种基于dgt技术进行原位显色有效磷的方法可定量测量溶液中的正磷酸盐浓度，结果准确可靠，且在溶液ph值为4～8的范围内，不受溶液ph值的影响，应用范围广。

实施例8

本实施例为监测环境中含有较高浓度的as时，对本发明方法监测值的影响。由于as与p为同族元素，通常情况下较高浓度的as会影响p的显色。

本实施例的实验过程如下：

实验溶液分为3组，每组溶液as的浓度分别为：40μg/l、200μg/l、1000μg/l，基础溶液为含有200μg/l的磷酸二氢钾的0.01mol/l的nano3溶液。

通过对基础溶液用滴定法添加1mol/l的nahco3使溶液的ph值稳定在6。

每组实验分别放置3个dgt装置作为平行样。实验进行4小时，在dgt放置入溶液中后的2分钟内、2小时后，以及取出dgt装置前2分钟内需要分别对溶液的温度进行测定，并用所得温度的平均值进行溶液浓度的计算，实施例4中的公式1进行计算。

图4为测量值在含有不同as浓度环境中的变化情况。

根据计算结果，三个实验溶液组cdgt值分别为：197.9±10.8μg/l、193.3±9.8μg/l、205.9±5.1μg/l。由epa方法365.2测得的溶液浓度为196.5±3.9μg/l。cdgt与溶液浓度cs的误差均在5％以内，且t检验cdgt与cs均无明显差异(p<0.05)。

可见本发明的一种基于dgt技术进行原位显色有效磷的方法可定量测量溶液中的正磷酸盐浓度，在as的浓度低于1000μg/l时，测定不受影响。