一种同时测定党参药材中八种活性成分的HPLC方法与流程

本发明属于中药材及其制剂质量控制
技术领域：
,涉及同时测定党参药材中党参炔苷、烟酸、腺苷、丁香苷、琥珀酸、阿魏酸、苍术内酯iii和5-羟甲基糠醛八种活性成分。
背景技术：
：党参(codonopsisradix)是临床常用中药材，《中华人民共和国药典》2015版收载的党参主要有桔梗科植物党参、素花党参或川党参3种。具有健脾益肺，养血生津之功效，有着重要的临床应用。党参含有多种有效成分，主要包括多糖、聚乙炔类、生物碱类及有机酸类等。其中党参炔苷对乙醇造成的胃黏膜损伤有很好的保护作用,与党参补中益气的传统功效相符,为党参胃粘膜保护作用的活性成分；丁香苷具有抗疲劳、抗脑缺血、增强适应性等药理作用；腺苷是一种活性很强的物质,能够降低体外循环后肺缺血再灌注损伤,有效改善右心功能,对再灌注心脏具有保护作用,并有舒张血管、松弛支气管平滑肌、降低血压、减慢心率、抗凝血等作用,还能有效地阻止由血小板活化因子诱导的白细胞-内皮细胞黏附而参与消炎作用；烟酸为水溶性b族维生素，对于由低密度脂蛋白胆固醇增多和高密度脂蛋白胆固醇减少所导致的血脂异常有治疗效果，可以减少冠心病死亡率，减缓动脉粥样硬化进程，降低心血管疾病的发生率和死亡率；阿魏酸具有抑制血小板聚集、抑制血栓形成和缓解血管痉挛等药理作用；苍术内酯iii具有明显的抗炎活性；琥珀酸具有抗惊厥、镇静、降低体温、镇痛等作用。而党参中具有重要药理作用的多糖类成分在采收、炮制、储藏和运输过程中，较易产生己糖的降解产物5-羟甲基糠醛(5-hmf)，5-hmf可能对人体横纹肌及内脏产生损害，并具有一定的神经毒性，能与人体蛋白质结合产生积蓄中毒，所以对其含量进行控制具有重要意义。关于党参质量控制，我国2015版药典中，对于党参仅收载了显微鉴别方法和以党参炔苷为对照品的薄层定性鉴别方法，并没有相应的定量检测方法。药典中把党参炔苷作为党参的标志化合物，但有研究发现党参炔苷不仅存在于正品党参中，也存在代用品中，甚至在同科其它植物中也有检测到党参炔苷，单一的党参炔苷含量不足以说明党参药材的质量。目前关于党参成分含量测定的文献多集中在一两种成分的测定。故本发明采用hplc法同时测定党参药材中党参炔苷、烟酸、腺苷、丁香苷、琥珀酸、阿魏酸、苍术内酯iii七种有效成分及一种有害成分5-羟甲基糠醛的含量，本方法简便、快速、准确,对控制党参药材质量有重要的现实意义。技术实现要素：本发明的目的是提供同时测定党参中八种活性成分的含量测定方法,它们分别为党参炔苷、烟酸、腺苷、丁香苷、琥珀酸、阿魏酸、苍术内酯iii七个有效成分和一个有害成分5-羟甲基糠醛。本发明所提供的技术方案可以是：标准溶液制备：分别精密称取党参炔苷、烟酸、腺苷、丁香苷、阿魏酸、5-羟甲基糠醛、苍术内酯iii标准品各10mg，琥珀酸40mg，加适量甲醇溶解，分别于10ml容量瓶中定容至刻度，摇匀即得党参炔苷、烟酸、腺苷、丁香苷、琥珀酸、阿魏酸、5-羟甲基糠醛、苍术内酯iii浓度分别为1mg/ml，琥珀酸浓度为4mg/ml。分别作为标准储备液保存备用。样品处理:精密称取干燥党参药材1g，置于150ml锥形瓶后加入25ml甲醇，超声15min后取上清液用0.45μm滤膜过滤后，保存备用。采用高效液相色谱法进行测定,该高效液相色谱法的色谱条件如下：c18色谱柱，流动相组成为甲醇-0.01％磷酸水溶液，梯度洗脱程序：0-10min，10％甲醇；10-25min，10％-65％甲醇；25-40min，65％-80％甲醇。波长：0-5min，260nm；5-6.5min，210nm；6.5-36.5min，260nm；36.5-38min，220nm；38-40min，260nm。流速1ml/min。柱温：30℃。进样量10μl。本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果：1、本发明首次应用高效液相色谱紫外检测法,同时测定党参药材中党参炔苷、烟酸、腺苷、丁香苷、琥珀酸、阿魏酸、苍术内酯iii和5-羟甲基糠醛八种成分的含量。2、本发明操作简便,准确度高，分离快速,在较大浓度范围内线性关系良好，相关系数r大于0.9990。3、能准确、快速的测定党参药材中八种活性成分的含量，为党参药材及其制剂质量控制奠定一定的基础。附图说明图1为本发明实施例中八种活性成分的标准色谱图，该色谱图中对应的峰分别为：1烟酸、2琥珀酸、3腺苷、45-羟甲基糠醛、5丁香苷、6阿魏酸、7党参炔苷、8苍术内酯iii。图2为本发明实施例中党参药材中活性成分的色谱图。图3为本发明实施例中党参药材霉变后各成分的色谱图。具体实施方式为了进一步说明本发明及其优点,给出了下列特定的实施例,应理解这些实施例仅用于具体说明而不是作为本发明范围的限制。实施例：标准溶液制备：分别精密称取党参炔苷、烟酸、腺苷、丁香苷、琥珀酸、阿魏酸、5-羟甲基糠醛、苍术内酯iii标准品各10mg、9.9mg、10mg、10.3mg、40mg、10.7mg、9.5mg、10.1mg，加适量甲醇溶解，分别于10ml容量瓶中定容至刻度，摇匀即得党参炔苷、烟酸、腺苷、丁香苷、琥珀酸、阿魏酸、5-羟甲基糠醛、苍术内酯iii浓度分别为1mg/ml、0.99mg/ml、1mg/ml、0.103mg/ml、4mg/ml、0.107mg/ml、0.95mg/ml、0.101mg/ml。分别作为标准储备液保存备用。样品溶液的制备:精密称取干燥党参药材1g，置于150ml锥形瓶后加入25ml甲醇，超声15min后取上清液用0.45μm滤膜过滤后，保存备用。八种党参药材中活性成分含量测定标准曲线的建立：色谱条件为c18色谱柱。流动相组成为甲醇-0.01％磷酸水溶液，梯度洗脱程序：0-10min，10％甲醇；10-25min，10％-65％甲醇；25-40min，65％-80％甲醇。波长：0-5min，260nm；5-6.5min，210nm；6.5-36.5min，260nm；36.5-38min，220nm；38-40min，260nm。流速1ml/min。柱温：30℃。进样量10μl。分别精密吸取各标准储备溶液适量于5ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀即得混合标准溶液。系列混合标准溶液按此方法配制，建立标准曲线，计算每个活性成分线性回归方程。线性关系考察：分别将不同浓度的8种标准品溶液10μl进样，以峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标，计算每个活性成分回归方程见表一。表一八种活性成分线性回归方程及线性范围标准品名称回归方程r线性范围(μg/ml)烟酸y＝24.062x-7.7083r＝0.99991.32～30琥珀酸y＝0.3569x-4.4626r＝0.9990125～800党参炔苷y＝8.7177x+6.3545r＝0.99992.25～1005-羟甲基糠醛y＝22.389x-0.8906r＝0.99972.25～60腺苷y＝20.843x+2.7726r＝0.99951.05～25苍术内酯iiiy＝23.684x-2.1951r＝0.99991～30阿魏酸y＝13.773x-8.07r＝0.99951～60丁香苷y＝31.418x+2.2438r＝0.99990.9～20精密度考察：取混合对照品溶液,按以上色谱方法连续进样6次,测定峰面积。结果烟酸、琥珀酸、腺苷、5-羟甲基糠醛、丁香苷、阿魏酸、党参炔苷、苍术内酯iii的rsd分别为：0.83％、0.81％、1.04％、0.85％、2.87％、1.00％、1.44％、1.77％。符合精密度实验要求。稳定性考察：取混合对照品溶液,室温下放置0,2,4,6,8,12,24,48小时,按以上色谱条件分别进样10μl测定峰面积。结果峰面积基本不变，烟酸、琥珀酸、腺苷、5-羟甲基糠醛、丁香苷、阿魏酸、党参炔苷、苍术内酯iii的rsd分别为0.74％、2.81％、1.76％、4.75％、1.95％、1.13％、0.86％、1.13％，表明溶液在48h内基本稳定。重复性考察：按样品溶液的制备方法平行提取6份,按以上色谱方法进样分析,按外标法以峰面积计算含量，结果腺苷、丁香苷、党参炔苷、苍术内酯iii的平均含量分别为：142.71(μg/g)、25.63(μg/g)、404.71(μg/g)、110.58(μg/g)。rsd分别为4.13％、0.82％、1.46％和1.61％。检测限：烟酸、琥珀酸、腺苷、5-羟甲基糠醛、丁香苷、阿魏酸、党参炔苷、苍术内酯iii的检测限分别为0.08μg/ml、12.6μg/ml、0.36μg/ml、0.14μg/ml、0.012μg/ml、0.19μg/ml、0.01μg/ml、0.01μg/ml。回收率试验：精密量取已测知含量的党参提取物各2.5ml,共9份,分别置5ml容量瓶中,分别精密加入一定量的各标准溶液，加甲醇定容至刻度，摇匀，按上述色谱条件进样10μl，用外标法以峰面积计算回收率。各成分回收率均在95％～110％范围内。样品含量测定：取样品溶液，按上述色谱条件进样10μl，用外标法以峰面积计算含量，结果腺苷、丁香苷、党参炔苷、苍术内酯iii的平均含量分别为：142.71(μg/g)、25.63(μg/g)、404.71(μg/g)、110.58(μg/g)。rsd分别为4.13％、0.82％、1.46％和1.61％。烟酸、琥珀酸、5-羟甲基糠醛和阿魏酸未检出。本实验还对霉变之后的党参中腺苷、丁香苷、党参炔苷和苍术内酯iii含量进行了考察，结果见图3，各有效成分含量显著下降，为党参药材的质量控制提供进一步参考。当前第1页12