一种烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分析方法与流程

本发明涉及一种烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分析方法，属于烟草化学成分的测定方法技术领域。

背景技术：

烟草中的降烟碱、假木贼碱与新烟草碱已经被广泛认为与烟草的品质密切相关，且也是高致癌物质-特有亚硝胺的前体物质。烤烟样品中降烟碱与新烟草碱占2-3％左右，假木贼碱占0.3％左右，是除烟碱以外最重要的生物碱。此外，降烟碱、假木贼碱和新烟草碱分别是亚硝基降烟碱(nnn)、亚硝基假木贼碱(nat)、亚硝基新烟草碱(nab)等烟草特有亚硝胺的直接前体物质，烟草特有亚硝胺是烟草和烟气中含量最丰富、致癌活性最强和最受关注的有害成分。

降烟碱、假木贼碱与新烟草碱3种生物碱都含有1个手性中心，存在一对对映异构体s-(-)-与r-(-)-。不同对映异构体的代谢机制和生理活性、毒性一般都有显著差异。很多证据表明降烟碱、新烟草碱与假木贼碱不同异构体之间具有不同的神经化学与行为效应，s-(-)-降烟碱的止痛效果远高于r-(-)-降烟碱，而其他副作用(运动失调、运动活动的变化、共济失调等)r-(-)-降烟碱远高于s-(-)-降烟碱。因此，对烟草中降烟碱、假木贼碱和新烟草碱的手性分析研究，对烟草生物碱的代谢、积累以及吸烟与健康研究等都具有重要意义。

目前还没有一套简单，快速、准确及分离能力高(rs＞1.5)的，同时分析烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱和新烟草碱手性的方法。建立一套简单，快速、准确及分离能力高(rs＞1.5)的方法对研究烟草生物碱的代谢、积累以及吸烟与健康等都具有重要意义。

现有文献调研表明：降烟碱、假木贼碱和新烟草碱的同时手性分离研究较少，也有少量研究对其中1种生物碱进行手性分离。armstrong等人采用三氟乙酰化进行衍生，用气相色谱-质谱进行分离检测，分离色谱柱为chiraldexb-dm手性色谱柱，采用不同的离子来监测进行定性与定量，该方法需要c18固相萃取柱对三种生物碱进行纯化与富集，前处理较为复杂，且3种物质的r/s手性分离也未完全，只能通过质谱的选择离子进行检测。刘百战等人采用多维气相色谱-质谱，建立了烟草中降烟碱、假木贼碱和新烟草碱的手性分析方法，开发了具有在线富集功能的大孔柱-毛细柱多维气相色谱系统。方法也采用了三氟乙酰化的衍生方法，且三种物质的r/s手性分离也未完全。此外，多维气相色谱需要特殊的仪器，难以实现实验室的常规分析。因此，有必要开发一套简单快速、准确度与灵敏度高，以及对手性s-(-)-与r-(-)-生物碱分离能力好(rs＞1.5)的同时分析烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱和新烟草碱手性的分析方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分析方法，该方法具有前处理简单快速，手性s-(-)-与r-(-)-基线分离(rs＞1.5)，色谱分析仪器与色谱柱常规，选择性及灵敏度高等特点，能对烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱和新烟草碱手性进行准确分析，可以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案是：一种烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分析方法，包括以下步骤：

a、烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的提取：将烟草样品粉碎过筛，称取烟草样品粉末于离心管中，加入二氯甲烷配制的内标溶液，以及氢氧化钠溶液，涡旋混匀，再加入提取溶剂涡旋提取，离心，取下层清液待用；

b、烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的衍生化：取a中下层清液作为提取液，加入二氯甲烷配制的衍生化试剂，涡旋混匀，再加入碱性催化剂后涡旋反应后，取下层清液于离心管中，氮吹仪下氮气吹干，用甲基叔丁基醚溶解，将其转移至有内插管的进样瓶中进行手性分析；

c、烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性色谱分析：采用气相色谱-氮磷检测器进行手性分析；

d、烟草及烟草制品中手性降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的定性及定量分析：采用r-新烟草碱，s-假木贼碱与s-降烟碱异构体与外消旋体相应的保留时间进行定性，内标法进行定量。

所述气相色谱-氮磷检测器的色谱柱为石英毛细管色谱柱，石英毛细管色谱柱的固定相为(35％-三氟丙基)-甲基聚硅氧烷。

所述二氯甲烷配制的内标溶液为4-苯基哌啶。

所述提取溶剂为二氯甲烷。

所述二氯甲烷配制的衍生化试剂为(1s)-(-)-莰烷酰氯。

所述碱性催化剂为氢氧化钠。

本发明的有益效果是：本发明建立了一种以碱性有机溶剂提取烟草中的降烟碱、假木贼碱与新烟草碱，再利用(1s)-(-)-莰烷酰氯的二氯甲烷溶液进行同时衍生与提取，提取的降烟碱、假木贼碱与新烟草碱直接利用气相色谱-氮磷检测器进行手性分离定性与定量的方法。与现有技术相比，本发明的优点是：1)前处理简单，提取只需要碱性有机溶剂涡旋提取，无需净化，直接用(1s)-(-)-莰烷酰氯的二氯甲烷溶液进行同时原位衍生化与提取；2)手性s-(-)-与r-(-)-降烟碱、假木贼碱与新烟草碱完全基线分离，rs都大于1.5；3)色谱分析仪器只需要简单的气相色谱-氮磷检测器，且分离无需手性柱，采用常规的rtx-200(类似固定相)能有效分离。4)采用氮磷检测器定性与定量，方法选择性好，灵敏度高。本发明具有简单快速、准确度与灵敏度高，以及对手性s-(-)-与r-(-)-生物碱分离能力好(rs＞1.5)的优点，能同时对烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性进行分析。

附图说明

图1是本发明中烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分析方法流程图；

图2中a为烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分离标样色谱图；b为烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分离烟草样品色谱图；c为r-新烟草碱，s-假木贼碱与s-降烟碱与外消旋体新烟草碱、假木贼碱与降烟碱的色谱重叠图。

具体实施方式

实施例1：降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分析

根据本发明一种烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分析方法，参考图1，包括如下步骤：

a、烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的提取：将烟草样品粉碎过80-100目筛后，称取200mg烟草样品粉末于50ml离心管中，加入50μl二氯甲烷配制的浓度为5.4mgml^-1的4-苯基哌啶内标溶液，以及1ml5％氢氧化钠溶液，涡旋混匀，再加入3ml的二氯甲烷2500rpm涡旋提取40min，4000rpm离心5min，取下层清液待用；

b、烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的衍生化：取400μla中下层清液作为提取液，加入200μl的二氯甲烷配制的80-120mgml^-1(1s)-(-)-莰烷酰氯，涡旋混匀，再加入0.1ml20％氢氧化钠后2500rpm涡旋反应40min，取下层清液100μl于1.5ml离心管中，氮吹仪下氮气吹干，用100μl甲基叔丁基醚溶解，将其转移至有150μl内插管的进样瓶中进行手性分析；

c、烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性色谱分析：采用气相色谱-氮磷检测器进行手性分析，色谱柱为固定相为(35％-三氟丙基)-甲基聚硅氧烷石英毛细管色谱柱，如db-200、vf-200与rtx-200等，长度为60m，内径0.25mm，膜厚0.5μm，载气：高纯氦气，恒流模式，载气流量：1.0mlmin^-1，进样口与检测器温度分别为270℃和280℃，进样量为1μl，不分流进样，检测器气体流量为干燥空气：60mlmin^-1，高纯氢气：2.3mlmin^-1和尾吹气高纯氦气15mlmin^-1，氢气延迟时间为15min；柱温升温程序为60℃保持1min，15℃min^-1升到230℃保持3min，再以2℃min^-1升到270℃保持10min，最后以5℃min^-1升到280℃保持25min，一共运行72.33min；

d、烟草及烟草制品中手性降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的定性及定量分析：采用r-新烟草碱，s-假木贼碱与s-降烟碱异构体与外消旋体相应的保留时间进行定性，定性结果如附图2所示，如利用rtx-200色谱柱进行手性分析，r-新烟草碱，s-假木贼碱与s-降烟碱保留时间分别为52.57min，54.76min，50.06min，通过色谱图重叠，相同保留时间即为该异构体；内标法进行定量，以4-苯基哌啶为内标，得到样品中该异构体与内标的峰面积比值，将比值代入线性回归方程计算该异构体的含量。

实施例2：本发明方法的线性、准确度、精密度与灵敏度验证

用二氯甲烷配制相应浓度的母液(外消旋体rs-降烟碱0.52mgml^-1，rs-新烟草碱0.72mgml^-1，rs-假木贼碱0.95mgml^-1)，分别各取2、5、10、25、50、100μl母液混合，在6个梯度的混合标准溶液中加入10μl5.4mgml^-1的4-苯基哌啶内标，最后将混合溶液用二氯甲烷定容到400μl，按照b中的方法进行衍生化与提取，再进行气相色谱-氮磷检测器分析，标准曲线以目标化合物峰面积与内标物峰面积的比为纵坐标(y，由于样品中内标加入量是标准曲线中内标加入量的5倍，需要将目标化合物峰面积与内标物峰面积的比值除以5为最终的y值)，目标化合物量与内标量(270μg)的比值为横坐标(x)进行回归分析，得到内标法回归方程及相关回归系数，将最低浓度的标准溶液按照信噪比(s/n＝3)为3计算方法的最低检测限(lod)，同时向烟草中添加两个浓度梯度的外消旋体rs-新烟草碱，rs-假木贼碱与rs-降烟碱后进行提取，按照公式回收率＝{[(添加样品的浓度-未添加的样品浓度)/添加的浓度]×100}，重复5次，计算平均回收率与相对标准偏差，从而对方法的准确度与精密度(rsd)进行评价，结果见表1。

表1烟草中的r/s降烟碱、r/s假木贼碱与r/s新烟草碱的回收率，精密度，线性及检测限

表1结果表明，相关回归系数r²均在0.9994以上，表明烟草中的r/s降烟碱、r/s假木贼碱与r/s新烟草碱，本发明方法的最低检测限在0.0041-0.0055μgml^-1，本发明方法表现出非常好的灵敏度。此外，本发明方法的回收率与精密度分别在97.1-99.5％和1.5-3.5％之间，以上结果达到了严格的定量要求。

实施例3：不同烟碱含量烟叶的降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分析

采用实施例1中的方法对烟碱含量不同的3种烤烟烟叶(相同品种)进行降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分析，测定结果见表2。结果表明，烟碱含量不同的3种烤烟烟叶(相同品种)中降烟碱、新烟草碱与假木贼碱的总量差异较大，但e.e.值(对映体过量百分数)差异较小。

表23种烤烟降烟碱、新烟草碱及假木贼碱总含量、对映体含量及对映体过量百分数值

注：e.e.值＝([r]-[s]/[r]+[s])*100％

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。