用于细胞酯酶染色的试剂的制作方法
本发明涉及病理特殊染色领域，特别涉及细胞化学染色。更具体地，本发明涉及改进的细胞酯酶染色方法、试剂盒及其应用。
背景技术：
细胞化学染色以形态学为基础并结合化学或生物化学技术，是一门对细胞内各种化学成分、代谢产物作定位、定性和半定量检查的科学，可弥补单纯细胞形态学检查识别的不足。该技术临床上主要应用于血液、骨髓和组织切片，在组织细胞的识别、疾病的鉴别和诊断中发挥了重要作用。尤其是对于白血病的鉴别诊断，目前仅从细胞形态学上观察白血病的诊断正确率约50～70％，而结合细胞化学染色则可提高到90％以上。因此在临床上，细胞化学染色已发展成为诊断白血病必要且有力的手段，对于白血病的鉴别分类、治疗观察以及预后评判起着十分重要的的作用。
目前常用于临床血液特殊化学染色主要包含过氧化物酶染色，苏丹黑b染色、铁染色、糖原染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色，酸性磷酸酶染色等。在特殊化学染色中，其原理主要是通过不同化学反应，使被检测的化学物质最终形成稳定的有色沉淀。显示细胞中酶的方法主要有以下几种：1.金属沉淀法，该法一般应用于磷酸酶的显示，利用细胞中的酶水解底物β-甘油磷酸钠，释放出磷酸，磷酸与相应的金属阳离子如钙或铅结合而产生不溶性的金属磷酸盐沉淀；2.电子传递法，该法多用于氧化酶和脱氢酶的显示，根据氧化还原的原理，在酶的作用下使底物氧化，从底物释放出氢，传递给受氢体，受氢体接受氢而被还原为有色的不溶性双甲
不同血细胞中所含的酯酶成分不同，根据酯酶特异性高低分为特异性酯酶和非特异性酯酶。特异性酯酶就是氯乙酸as-d萘酚酯酶，非特异性酯酶则存在多种，包括酸性非特异性酯酶(酸性α-醋酸萘酚酯酶)、碱性非特异性酯酶(α-丁酸萘酚酯酶)和中性非特异性酯酶。目前用于显示血细胞中酯酶的方法均采用重氮偶联法，该方法学为1985年国际血液学标准化委员会(icsh)推荐法。其检测原理为：芳香胺化合物在强酸水溶液中，与亚硝酸作用生成重氮盐，而细胞内的酯酶在一定ph条件下水解基质液中的底物，释放出α-萘酚，后者再与重氮盐偶联形成有色沉淀，定位于酶活性所在的部位，沉淀物的显色深浅与酯酶活性成正比。
目前，传统使用的酯酶染色方法，试剂中的重氮盐溶液不稳定，很容易出现试剂失效，无法完成偶氮反应，导致染色失败。这样的试剂盒难以作为一个整体长期保存，为克服这种困难，一些市售试剂采用固体颗粒或粉末的形式进行分装，临用前现配现用。这种方法虽然延长了试剂的使用时间，但在操作时相对繁琐费时，给临床医师带来不便。
技术实现要素：
针对目前现有细胞酯酶染色方法存在的缺陷，本发明提供了一种改进的酯酶染色方法及试剂盒，其显著提高了重氮溶液的试剂稳定性，改善了酯酶染色的效果，使细胞染色对比明显，阴阳性染色对象区分度高，且试剂检测稳定性高，便于长期保存和运输。
在一个方面，本发明涉及一种用于细胞酯酶染色的重氮试剂，其包含试剂r1和试剂r2，其中试剂r1为包含强酸和芳香胺化合物的水溶液，试剂r2为包含亚硝酸盐和谷氨酸盐的水溶液。优选地，所述强酸可以是盐酸或硫酸。在一些优选实施方案中，所述芳香胺化合物可以是红色基b、大红色基g、橙色基gc、黄色基gc、盐酸付玫瑰苯胺等，最优选为盐酸付玫瑰苯胺(cas号：569-61-9，下文同)。在一些优选实施方案中，所述谷氨酸盐可以是谷氨酸钠、谷氨酸钾、谷氨酸钙或谷氨酸锌，优选为谷氨酸钠或谷氨酸钾。在一些实施方案中，所述细胞酯酶染色是血细胞酯酶染色或骨髓细胞酯酶染色。
在一些优选实施方案中，试剂r1中芳香胺化合物的摩尔浓度为60mm-190mm，优选为120mm；盐酸的摩尔浓度为1-4m，优选为2m。在一些优选实施方案中，试剂r2中亚硝酸盐的浓度为290mm-870mm，优选为580mm；谷氨酸钠的浓度为60mm-1770mm，优选为60mm-1180mm，更优选为295mm-1180mm。在一些实施方案中，试剂r1与试剂r2等比例混合。
在本发明的第二个方面，提供了一种细胞酯酶染色试剂盒，所述试剂盒包含：固定液、重氮试剂、缓冲液、酯酶底物溶液和复染液，其中所述重氮试剂包含试剂r1和试剂r2，其中试剂r1为包含强酸和芳香胺化合物的水溶液，试剂r2为包含亚硝酸盐和谷氨酸盐的水溶液。在一些实施方案中，所述强酸可以是盐酸或硫酸。在一些优选实施方案中，所述芳香胺化合物可以是红色基b、大红色基g、橙色基gc、黄色基gc、盐酸付玫瑰苯胺等，最优选为盐酸付玫瑰苯胺。在一些优选实施方案中，所述谷氨酸盐可以是谷氨酸钠、谷氨酸钾、谷氨酸钙或谷氨酸锌，优选为谷氨酸钠或谷氨酸钾。在一些实施方案中，所述细胞酯酶染色是血细胞酯酶染色或骨髓细胞酯酶染色。
在一些实施方案中，固定液是包含缓冲对、丙酮和甲醛的水溶液。在一些实施方案中，所述固定液中的缓冲对可以是磷酸盐缓冲对、柠檬酸盐缓冲对、甘氨酸-hcl缓冲对、或tris-hcl缓冲对，优选为磷酸盐缓冲对(例如磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠等)。在一些实施方案中，复染液是与细胞酯酶染色颜色不同的染料的溶液，例如水溶液或醇溶液。优选地，复染液中的染料可以是例如甲基绿、苏木素、光绿，最优选为甲基绿。在一些实施方案中，酯酶底物是指能在细胞中的酯酶催化作用下产生α-萘酚的物质。优选地，酯酶底物溶液的溶剂可以选自下组：n,n-二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基亚砜、乙二醇单甲醚；最优选地，所述溶液的溶剂是n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。进一步地，所述酯酶底物可以例如选自下组：氯醋酸as-d萘酚、酸性α-醋酸萘酚、α-丁酸萘酚、α-萘磷酸单钠盐、萘酚as-bi磷酸盐、萘酚as-tr磷酸盐、萘酚as-mx磷酸钠盐。因此，酯酶底物溶液可以是氯醋酸as-d萘酚溶液、酸性α-醋酸萘酚溶液、α-丁酸萘酚溶液，α-萘磷酸单钠盐溶液、萘酚as-bi磷酸盐溶液、萘酚as-tr磷酸盐溶液、或萘酚as-mx磷酸钠盐溶液。
在一些优选实施方案中，固定液中的甲醛：丙酮体积比为5：9，且甲醛的浓度为200-300ml/l，丙酮的浓度为360-540ml/l；优选地，甲醛的浓度为250ml/l，丙酮的浓度为450ml/l。在一些优选实施方案中，试剂r1中芳香胺化合物的摩尔浓度为60mm-190mm，优选为120mm；盐酸的摩尔浓度为1-3m，优选为2m。在一些优选实施方案中，试剂r2中亚硝酸盐的浓度为290mm-870mm，优选为580mm；谷氨酸钠的浓度为60mm-1770mm，优选为60mm-1180mm，更优选为295mm-1180mm。在一些实施方案中，试剂r1与试剂r2等比例混合。
在一些实施方案中，常用缓冲液均可用于本发明中，并可按照本领域公知的方法进行配制。例如，在一些实施方案中，缓冲液可以是tris-hcl缓冲液、巴比妥缓冲液、碳酸盐缓冲液(例如碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)、甘氨酸-hcl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液)、或磷酸盐缓冲液(例如磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液等)。在一些优选实施方案中，所述缓冲液包含缓冲对、防腐剂和表面活性剂的水溶液。在一些实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液，所述缓冲对是磷酸盐缓冲对；优选地，磷酸盐缓冲对为磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。缓冲对的选择及浓度是本领域公知常识，例如，在一个优选实施方案中，所述缓冲液中的磷酸氢二钠浓度可以是4-12g/l，磷酸二氢钾浓度可以是0.1-1.5g/l。在一些实施方案中，防腐剂可以是pc950(指防腐剂proclin950，其主要包含2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、mit(指甲基异噻唑啉酮)和叠氮化钠的一种或多种，优选为pc950。在一些实施方案中，表面活性剂可以是阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。例如，阳离子表面活性剂可以是十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵等；阴离子表面活性剂可以是十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠等；非离子表面活性剂可以包括曲拉通系列表面活性剂(例如曲拉通x-100、曲拉通x-114等)、tween系列表面活性剂(例如tween-20、tween-80等)、brij系列表面活性剂(例如brij-35、brij-52、brij-56、brij-58等)、皂素、泊洛沙姆系列表面活性剂(例如泊洛沙姆407、泊洛沙姆184、泊洛沙姆188等)。
例如，在本发明一个具体的示例中，所述细胞酯酶染色试剂盒组分可以配制如下：
在本发明的第三个方面，提供了一种细胞涂片的酯酶染色方法，其包括如下步骤：
(1)固定：对涂片添加固定液进行固定；
(2)酯酶染色：将重氮试剂的r1与r2混匀静置，加入缓冲液与酯酶底物溶液，孵育至染色反应完成；
(3)复染：用复染液对涂片进行复染；
其中，所述重氮试剂的r1为包含盐酸和芳香胺化合物的水溶液，r2为包含亚硝酸盐和谷氨酸盐的水溶液。
在一些优选实施方案中，所述芳香胺化合物可以是红色基b、大红色基g、橙色基gc、黄色基gc、盐酸付玫瑰苯胺等，最优选为盐酸付玫瑰苯胺。在一些优选实施方案中，所述谷氨酸盐可以是谷氨酸钠、谷氨酸钾、谷氨酸钙或谷氨酸锌，优选为谷氨酸钠或谷氨酸钾。在一些实施方案中，所述细胞涂片是血细胞涂片或骨髓细胞涂片。
在一些实施方案中，固定液是包含缓冲对、丙酮和甲醛的水溶液。在一些实施方案中，所述固定液中的缓冲对可以是磷酸盐缓冲对、柠檬酸盐缓冲对、甘氨酸-hcl缓冲对、或tris-hcl缓冲对，优选为磷酸盐缓冲对(例如磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠等)。在一些实施方案中，复染液是与细胞酯酶染色颜色不同的染料的溶液，例如水溶液或醇溶液。优选地，复染液中的染料可以是例如甲基绿、苏木素、光绿，最优选为甲基绿。在一些实施方案中，酯酶底物是指能在细胞中的酯酶催化作用下产生α-萘酚的物质。优选地，酯酶底物溶液的溶剂可以选自下组：n,n-二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基亚砜、乙二醇单甲醚；最优选地，所述溶液的溶剂是n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。进一步地，所述酯酶底物可以例如选自下组：氯醋酸as-d萘酚、酸性α-醋酸萘酚、α-丁酸萘酚、α-萘磷酸单钠盐、萘酚as-bi磷酸盐、萘酚as-tr磷酸盐、萘酚as-mx磷酸钠盐。因此，酯酶底物溶液可以是氯醋酸as-d萘酚溶液、酸性α-醋酸萘酚溶液、α-丁酸萘酚溶液，α-萘磷酸单钠盐溶液、萘酚as-bi磷酸盐溶液、萘酚as-tr磷酸盐溶液、或萘酚as-mx磷酸钠盐溶液。
在一些优选实施方案中，固定液中的甲醛：丙酮体积比为5：9，且甲醛的浓度为200-300ml/l，丙酮的浓度为360-540ml/l；优选地，甲醛的浓度为250ml/l，丙酮的浓度为450ml/l。在一些优选实施方案中，试剂r1中芳香胺化合物的摩尔浓度为60mm-190mm，优选为120mm；盐酸的摩尔浓度为1-3m，优选为2m。在一些优选实施方案中，试剂r2中亚硝酸盐的浓度为290mm-870mm，优选为580mm；谷氨酸钠的浓度为60mm-1770mm，优选为60mm-1180mm，更优选为295mm-1180mm。在一些实施方案中，试剂r1与试剂r2等比例混合。
在一些实施方案中，常用缓冲液均可用于本发明中，并可按照本领域公知的方法进行配制。例如，在一些实施方案中，缓冲液可以是tris-hcl缓冲液、巴比妥缓冲液、碳酸盐缓冲液(例如碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)、甘氨酸-hcl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液)、或磷酸盐缓冲液(例如磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液等)。在一些优选实施方案中，所述缓冲液包含缓冲对、防腐剂和表面活性剂的水溶液。在一些实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液，所述缓冲对是磷酸盐缓冲对；优选地，磷酸盐缓冲对为磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。缓冲对的选择及浓度是本领域公知常识，例如，在一个优选实施方案中，所述缓冲液中的磷酸氢二钠浓度可以是4-12g/l，磷酸二氢钾浓度可以是0.1-1.5g/l。在一些实施方案中，防腐剂可以是pc950(指防腐剂proclin950，其主要包含2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、mit(指甲基异噻唑啉酮)和叠氮化钠的一种或多种，优选为pc950。在一些实施方案中，表面活性剂可以是阳离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或非离子表面活性剂。例如，表面活性剂可以是曲拉通系列表面活性剂(例如曲拉通x-100、曲拉通x-114等)、tween系列表面活性剂(例如tween-20、tween-80等)、brij系列表面活性剂(例如brij-35、brij-52、brij-56、brij-58等)、皂素、泊洛沙姆系列表面活性剂(例如泊洛沙姆407、泊洛沙姆184、泊洛沙姆188等)中的一种或多种；最优选为曲拉通x-100。
在本发明的第四个方面，本发明涉及谷氨酸盐用于提高亚硝酸盐溶液稳定性的用途。在一些具体实施方案中，本发明涉及谷氨酸盐用于提高细胞酯酶染色的重氮试剂稳定性的用途。在一些优选实施方案中，所述谷氨酸盐可以是谷氨酸钠、谷氨酸钾、谷氨酸钙或谷氨酸锌，优选为谷氨酸钠或谷氨酸钾。在本发明上下文的一些实施方案中，所述酯酶是能够催化选自下组的底物反应产生α-萘酚的酯酶：氯醋酸as-d萘酚、酸性α-醋酸萘酚、α-丁酸萘酚、α-萘磷酸单钠盐、萘酚as-bi磷酸盐、萘酚as-tr磷酸盐、和萘酚as-mx磷酸钠盐。例如，所述酯酶可以是氯醋酸as-d萘酚酯酶、酸性α-醋酸萘酚酯酶、α-丁酸萘酚酯酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。在一些具体实施方案中，所述用途可以采用前述任一重氮试剂、试剂盒或染色方法来实施。
定义
本发明所用的术语“重氮试剂”，意指用于发生重氮化反应生成重氮盐的试剂，例如芳香胺化合物(如盐酸付玫瑰苯胺)和亚硝酸盐(如亚硝酸钠)，形成的重氮盐可进一步与α-萘酚反应生成有色沉淀。在一些非严谨语境下，所述“重氮试剂”可与术语“偶氮试剂”互换使用。
本发明所用的术语“缓冲对”是指由具有足够浓度及适当比例的共轭酸碱对组成，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的ph值相对稳定的物质。
本发明所用的术语“酯酶底物”是指，能够与细胞中的酯酶反应产生α-萘酚的物质，例如氯醋酸as-d萘酚(cas：35245-26-2)、酸性α-醋酸萘酚(cas号：830-81-9)、α-丁酸萘酚(cas号：3121-70-8)、α-萘磷酸单钠盐(cas：81012-89-7)、萘酚as-bi磷酸盐(cas号：1919-91-1)、萘酚as-tr磷酸盐(cas号：2616-72-0)、萘酚as-mx磷酸钠盐(cas：1596-56-1)等。
本发明所称的“酯酶染色”，意指以酯酶催化底物水解的产物与重氮盐偶联产生沉淀为原理，用重氮偶联法显示待检测样品(例如血细胞)中的酯酶，对胞质内酶进行定性及反应强度的判断。染色的样本可以是细胞涂片，例如血细胞涂片或骨髓涂片等。
附图说明
图1（图中a-c）示出了试剂r2中无稳定剂条件下的氯醋酸as-d萘酚酯酶染色测试结果。其中酯酶染色细胞以白色三角指出。
图2（图中a-c）示出了试剂r2中采用1％谷氨酸盐作为稳定剂条件下的氯醋酸as-d萘酚酯酶染色测试结果。其中酯酶染色细胞以白色三角指出。
图3（图中a-c）示出了试剂r2中采用5％谷氨酸盐作为稳定剂条件下的氯醋酸as-d萘酚酯酶染色测试结果。其中酯酶染色细胞以白色三角指出。
图4（图中a-c）示出了试剂r2中采用10％谷氨酸盐作为稳定剂条件下的氯醋酸as-d萘酚酯酶染色测试结果。其中酯酶染色细胞以白色三角指出。
图5（图中a-c）示出了试剂r2中采用20％谷氨酸盐作为稳定剂条件下的氯醋酸as-d萘酚酯酶染色测试结果。其中酯酶染色细胞以白色三角指出。
图6（图中a-c）示出了试剂r2中采用30％谷氨酸盐作为稳定剂条件下的氯醋酸as-d萘酚酯酶染色测试结果。其中酯酶染色细胞以白色三角指出。
图7（图中a-c）示出了试剂r2中无稳定剂条件下的酸性α-醋酸萘酚酯酶染色测试结果。其中酯酶染色细胞以白色三角指出。
图8（图中a-c）示出了试剂r2中采用10％谷氨酸盐作为稳定剂条件下的酸性α-醋酸萘酚酯酶染色测试结果。其中酯酶染色细胞以白色三角指出。
图9（图中a-c）示出了试剂r2中无稳定剂条件下的α-丁酸萘酚酯酶染色测试结果。其中酯酶染色细胞以白色三角指出。
图10（图中a-c）示出了试剂r2中采用10％谷氨酸盐作为稳定剂条件下的α-丁酸萘酚酯酶染色测试结果。其中酯酶染色细胞以白色三角指出。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
材料与步骤
1.实验材料
本发明实施例所用试剂均为市售常规试剂，例如盐酸付玫瑰苯胺(上海国药)、氯醋酸as-d萘酚(sigma)、酸性α-醋酸萘酚(sigma)、α-丁酸萘酚(sigma)、亚硝酸钠(广东光华)、谷氨酸钠(成都科隆)等。实施例中所用的血细胞涂片取自健康人受试者外周血。
2.实验步骤
若无另行说明，下文实施例1-10所用染色步骤均按照如下步骤进行：
1.样本固定：
干燥涂片，滴加固定液(用前恢复室温，并充分摇匀)，布满涂片固定约30-60秒，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干。
2.酯酶染色：实施例中涉及的三种酯酶染色步骤分别如下
(1)氯醋酸as-d萘酚工作液配制：20ul试剂r1+20ul试剂r2，混匀静置1分钟；加入2ml缓冲液，100ul氯醋酸as-d萘酚溶液；室温孵育15-20分钟，蒸馏水冲洗，待干。
(2)酸性α-乙酸萘酚工作液配制：50ul试剂r1+50ul试剂r2，混匀静置1分钟；加入1.5ml缓冲液，50ul酸性α-乙酸萘酚溶液；37℃孵育30分钟，蒸馏水冲洗，待干。
(3)α-丁酸萘酚溶液工作液配制：5ul试剂r1+5ul试剂r2，混匀静置1分钟；加入2ml缓冲液，100ulα-丁酸萘酚溶液；37℃孵育60分钟，蒸馏水冲洗，待干。
3.复染：
甲基绿复染1-2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1无稳定剂的酯酶染色测试
根据本领域公知的操作，为了降低时间成本的情况下验证试剂的长期稳定性，可以采用热加速的方法进行稳定性的验证。例如《体外诊断试剂稳定性研究概述》(张苏琳,吴莉；中国医疗器械信息,2017(23):24-25.)中的描述，一般认为，试剂在37℃放置3天相当于4℃放置半年，37℃放置7天相当于4℃放置1年，具体天数可因试剂不同而有所波动。在本实施例及下文实施例中，均采用了37℃热加速保存法来检验试剂稳定性。
各试剂的配制如下：
其中，重氮试剂r2配制后于37℃热加速条件下分别保存0天、7天和14天，然后用于染色。依照上文所述进行染色步骤后，观测不同保存天数的染色效果并进行对比，结果可参见图1a-c。
从图中可以看出，在37℃热加速0天(图1a)不添加谷氨酸钠作为稳定剂时，染色液能够将白细胞细胞浆中的氯醋酸as-d萘酚酯酶染成红色，且呈弥漫性或片状分布，表现为强阳性。同时经甲基绿复染后，细胞核呈绿色，整个细胞染色鲜艳，对比鲜明；在37℃热加速7天(图1b)不添加谷氨酸钠作为稳定剂时，可以看出在白细胞胞浆中仅见个别散在或点状颗粒样分布的淡红色弱阳性氯醋酸as-d萘酚酯酶，整个白细胞胞浆着色不明显，表现为弱阳性；在37℃热加速14天(图1c)不添加谷氨酸钠作为稳定剂时，可以看出在整个白细胞中，仅见被甲基绿复染呈绿色的细胞核，胞浆无阳性红色颗粒，表现为阴性。由此可见，在不添加任何稳定剂的情况下，亚硝酸钠溶液不稳定，易氧化分解，从而导致染色失败。
实施例21％谷氨酸盐稳定剂的酯酶染色测试
各试剂的配制如下：
其中，重氮试剂r2配制后于37℃热加速条件下分别保存0天、7天和14天，然后用于染色。依照上文所述进行染色步骤后，观测不同保存天数的染色效果并进行对比，结果可参见图2a-c。
从图中可以看出，在37℃热加速0天(图2a)添加1％谷氨酸钠作为稳定剂时，和不添加谷氨酸钠染色结果一致，能够将白细胞细胞浆中的氯醋酸as-d萘酚酯酶染成红色，且呈弥漫性或片状分布，表现出强阳性。同时经甲基绿复染后，细胞核呈绿色，整个细胞染色鲜艳，对比鲜明。这表明添加少量谷氨酸钠作为稳定剂时，不会影响亚硝酸钠溶液本身的染色效果；在37℃热加速7天(图2b)和14天(图2c)添加1％谷氨酸钠作为稳定剂时，可以看出在白细胞胞浆中可见部分弥漫或散在分布的红色或淡红色阳性氯醋酸as-d萘酚酯酶，与37℃热加速0天相比，阳性强度明显降低，染色效果变差。但与不添加谷氨酸钠稳定剂相比，添加1％谷氨酸钠稳定剂能够保证亚硝酸钠溶液在37℃热加速14天后依然能够将细胞浆中的阳性酯酶染色出来，虽强度有所降低，但是还是能够清楚的观察到胞浆中部分阳性氯醋酸as-d酯酶的表达和分布状况。由此可见，在添加少量的谷氨酸钠稳定剂时，能够防止亚硝酸钠溶液氧化降解，增强其稳定性，但由于添加剂量较少，稳定效果不明显。
实施例35％谷氨酸盐稳定剂的酯酶染色测试
各试剂的配制如下：
其中，重氮试剂r2配制后于37℃热加速条件下分别保存0天、7天和14天，然后用于染色。依照上文所述进行染色步骤后，观测不同保存天数的染色效果并进行对比，结果可参见图3a-c。
从图中可以看出，添加5％谷氨酸钠作为稳定剂时，染色液在37℃热加速0天(图3a)、7天(图3b)和14天(图3c)均能够将白细胞细胞浆中的氯醋酸as-d萘酚酯酶染成红色，且呈弥漫性或片状分布，表现为强阳性。同时经甲基绿复染后，细胞核呈绿色，整个细胞染色鲜艳，对比鲜明；与不添加谷氨酸钠37℃热加速0天相比，染色效果无明显差异。这表明添加5％的谷氨酸钠作为亚硝酸钠稳定剂时，能够很好的稳定亚硝酸钠溶液，防止其氧化分解，且不干扰染色效果，保证氯醋酸as-d萘酚酯酶定位准确，色泽鲜艳，对比明显。
实施例410％谷氨酸盐稳定剂的酯酶染色测试
各试剂的配制如下：
其中，重氮试剂r2配制后于37℃热加速条件下分别保存0天、7天和14天，然后用于染色。依照上文所述进行染色步骤后，观测不同保存天数的染色效果并进行对比，结果可参见图4a-c。
从图中可以看出，添加10％谷氨酸钠作为稳定剂时，染色液在37℃热加速0天(图4a)、7天(图4b)和14天(图4c)均能够将白细胞细胞浆中的氯醋酸as-d萘酚酯酶染成红色，且呈弥漫性或片状分布，表现为强阳性。同时经甲基绿复染后，细胞核呈绿色，整个细胞染色鲜艳，对比鲜明；与不添加谷氨酸钠37℃热加速0天相比，染色效果无明显差异。这表明添加10％的谷氨酸钠作为亚硝酸钠稳定剂时，能够很好的稳定亚硝酸钠溶液，防止其氧化分解，且不干扰染色效果，保证氯醋酸as-d萘酚酯酶定位准确，色泽鲜艳，对比明显。
实施例520％谷氨酸盐稳定剂的酯酶染色测试
各试剂的配制如下：
其中，重氮试剂r2配制后于37℃热加速条件下分别保存0天、7天和14天，然后用于染色。依照上文所述进行染色步骤后，观测不同保存天数的染色效果并进行对比，结果可参见图5a-c。
从图中可以看出，添加20％谷氨酸钠作为稳定剂时，染色液在37℃热加速0天(图5a)、7天(图5b)和14天(图5c)均能够将白细胞细胞浆中的氯醋酸as-d萘酚酯酶染成红色，且呈弥漫性或片状分布，表现为强阳性。同时经甲基绿复染后，细胞核呈绿色，整个细胞染色鲜艳，对比鲜明；与不添加谷氨酸钠37℃热加速0天相比，染色效果无明显差异。这表明添加20％的谷氨酸钠作为亚硝酸钠稳定剂时，能够很好的稳定亚硝酸钠溶液，防止其氧化分解，且不干扰染色效果，保证氯醋酸as-d萘酚酯酶定位准确，色泽鲜艳，对比明显。
实施例630％谷氨酸盐稳定剂的酯酶染色测试
各试剂的配制如下：
其中，重氮试剂r2配制后于37℃热加速条件下分别保存0天、7天和14天，然后用于染色。依照上文所述进行染色步骤后，观测不同保存天数的染色效果并进行对比，结果可参见图6a-c。
从图中可以看出，添加30％谷氨酸钠作为稳定剂时，染色液在37℃热加速0天(图6a)、7天(图6b)和14天(图6c)后，整个白细胞胞浆中无阳性红色颗粒，仅见被甲基绿复染成绿色的细胞核，表现为阴性。由此表明，当添加过量的谷氨酸钠作为稳定剂时，会影响亚硝酸钠的性质，导致染色失败。
实施例7无稳定剂的酯酶染色测试(酸性α-醋酸萘酚酯酶)
各试剂的配制如下：
其中，重氮试剂r2配制后于37℃热加速条件下分别保存0天、7天和14天，然后用于染色。依照上文所述进行染色步骤后，观测不同保存天数的染色效果并进行对比，结果可参见图7a-c。
从图中可以看出，在37℃热加速0天(图7a)不添加谷氨酸钠作为稳定剂时，染色液能够将白细胞细胞浆中的酸性α-醋酸萘酚酯酶染成红色或棕红色，且呈弥漫性或片状分布，表现为强阳性。同时经甲基绿复染后，细胞核呈绿色，整个细胞染色鲜艳，对比鲜明；在37℃热加速7天(图7b)不添加谷氨酸钠作为稳定剂时，可以看出在白细胞胞浆中仅见个别散在或点状颗粒样分布的淡红色或棕红色弱阳性酸性α-醋酸萘酚酯酶，整个白细胞胞浆着色不明显，表现为弱阳性；在37℃热加速14天(图7c)不添加谷氨酸钠作为稳定剂时，可以看出在整个白细胞中，仅见被甲基绿复染呈绿色的细胞核，胞浆无阳性红色颗粒，表现为阴性。由此可见，在不添加任何稳定剂的情况下，亚硝酸钠溶液不稳定，易氧化分解，从而导致染色失败。
实施例810％谷氨酸盐稳定剂的酯酶染色测试(酸性α-醋酸萘酚酯酶)
各试剂的配制如下：
其中，重氮试剂r2配制后于37℃热加速条件下分别保存0天、7天和14天，然后用于染色。依照上文所述进行染色步骤后，观测不同保存天数的染色效果并进行对比，结果可参见图8a-c。
从图中可以看出，添加10％谷氨酸钠作为稳定剂时，染色液在37℃热加速0天(图8a)、7天(图8b)和14天(图8c)后，均能够将白细胞细胞浆中的酸性α-醋酸萘酚酯酶染成红色，且呈弥漫性或片状分布，表现为强阳性。同时经甲基绿复染后，细胞核呈绿色，整个细胞染色鲜艳，对比鲜明；与不添加谷氨酸钠37℃热加速0天相比，染色效果无明显差异，表明添加10％的谷氨酸钠作为亚硝酸钠稳定剂时，能够很好的稳定亚硝酸钠溶液，防止其氧化分解，且不干扰染色效果，保证酸性α-醋酸萘酚酯酶定位准确，色泽鲜艳，对比明显。
实施例9无稳定剂的酯酶染色测试(α-丁酸萘酚酯酶)
各试剂的配制如下：
其中，重氮试剂r2配制后于37℃热加速条件下分别保存0天、7天和14天，然后用于染色。依照上文所述进行染色步骤后，观测不同保存天数的染色效果并进行对比，结果可参见图9a-c。
从图中可以看出，在37℃热加速0天(图9a)不添加谷氨酸钠作为稳定剂时，能够将白细胞细胞浆中的α-丁酸萘酚酯酶染成红色或棕红色，且呈弥漫性或片状分布，表现为强阳性。同时经甲基绿复染后，细胞核呈绿色，整个细胞染色鲜艳，对比鲜明；在37℃热加速7天(图9b)不添加谷氨酸钠作为稳定剂时，可以看出在白细胞胞浆中仅见个别散在或点状颗粒样分布的淡红色或棕红色弱阳性α-丁酸萘酚酯酶，整个白细胞胞浆着色不明显，表现为弱阳性；在37℃热加速14天(图9c)不添加谷氨酸钠作为稳定剂时，可以看出在整个白细胞中，仅见被甲基绿复染呈绿色的细胞核，胞浆无阳性红色颗粒，表现为阴性。由此可见，在不添加任何稳定剂的情况下，亚硝酸钠溶液不稳定，易氧化分解，从而导致染色失败。
实施例1010％谷氨酸盐稳定剂的酯酶染色测试(α-丁酸萘酚酯酶)
各试剂的配制如下：
其中，重氮试剂r2配制后于37℃热加速条件下分别保存0天、7天和14天，然后用于染色。依照上文所述进行染色步骤后，观测不同保存天数的染色效果并进行对比，结果可参见图10a-c。
从图中可以看出，添加10％谷氨酸钠作为稳定剂时，在37℃热加速0天(图10a)、7天(图10b)和14天(图10c)后，均能够将白细胞细胞浆中的α-丁酸萘酚酯酶染成红色，且呈弥漫性或片状分布，表现为强阳性。同时经甲基绿复染后，细胞核呈绿色，整个细胞染色鲜艳，对比鲜明；与不添加谷氨酸钠37℃热加速0天相比，染色效果无明显差异，表明添加10％的谷氨酸钠作为亚硝酸钠稳定剂时，能够很好的稳定亚硝酸钠溶液，防止其氧化分解，且不干扰染色效果，保证α-丁酸萘酚酯酶定位准确，色泽鲜艳，对比明显。
应该理解到，本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可在不悖离本发明主旨的情况下变化。还应理解本文所述的实施例仅仅是出于描述具体实施方案的目的，而非意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求限定。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
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