一种木蝴蝶配方颗粒中6种化学成分的含量测定方法与流程

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种木蝴蝶配方颗粒中6种化学成分的含量测定方法。

背景技术：

木蝴蝶(oroxylisemen)为紫葳科木蝴蝶属木蝴蝶oroxylumindicum(l)vent.的干燥成熟种子，又名千层纸、玉蝴蝶等，始载于《滇南本草》，具有几百年的药用历史。中医理论认为木蝴蝶性味苦、甘、凉，入肺、肝、胃经，有清肺利咽、疏肝和胃之功效，用于肺热咳嗽，喉痹，喑哑，肝胃气痛，常用于以咳嗽为主症的上呼吸道感染、急性支气管炎、慢性咽炎、肺炎后期等症。现代医学研究表明，木蝴蝶的主要药效成分为黄酮类物质，具有抗炎、抗氧化、抗癌、降糖、抑制病毒及肿瘤生长等多种药理作用。具有药理活性的化学成分为脂肪油、黄芩苷元-7-葡萄糖苷、黄芩苷、黄芩苷元、千层纸素a、木蝴蝶苷b、白杨素、白杨素-7-葡萄糖醛酸苷等黄酮类化合物。

液质联用技术(uplc-ms)是目前广泛应用的分析方法之一。它利用液相色谱的高效分离能力对分析物进行分离，再以质谱为检测器使待测化合物产生气态离子，再按质荷比(m/z)将离子分离，检测。uplc-uv-ms能充分发挥色谱的分离能力，并具有质谱的高分辨特性，可得到保留时间、紫外响应、荷质比响应这样的三维信息，适合分析中药多组分复杂体系。

现行对该药物的质量控制方法多是采用不同的色谱条件分别测定其中一种或两种成分的含量，存在操作繁琐，检测时间长，检测成本高等缺点。

木蝴蝶配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，目前并没有建立有效控制木蝴蝶配方颗粒的质量的方法，现有技术中也尚未发现采用液质联用技术同时测定木蝴蝶配方颗粒中6种成分的含量的文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种木蝴蝶配方颗粒中6种化学成分的含量测定方法，该方法采用uplc-ms/ms法，可以同时测定白杨素、白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷、黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷a、木蝴蝶苷b6种成份的种类和含量，以有效控制木蝴蝶配方颗粒的质量，保证产品的有效性和安全性。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种木蝴蝶配方颗粒中6种化学成分的含量测定方法，所述6种化学成分分别为白杨素、白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷、黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷a、木蝴蝶苷b，其特征在于，采用uplc-ms/ms法测定，具体包括以下步骤：

(1)色谱条件与系统适应性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.01％甲酸为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为276nm，流速为0.28ml/min，进样体积为1μl，柱温为30℃；

质谱条件：

电喷雾离子源esi⁺，喷雾电压为1.55kv；脱溶剂温度为597℃，离子源温度为148℃；脱溶剂气流为997l/hr；氮气流为1l/hr；质谱扫描采用多反应检测mrm扫描模式；监测离子及相关电压参数设定如下表所示：

(2)混合对照品溶液的制备：分别精密称取白杨素、黄芩素、白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷a、黄芩苷和木蝴蝶苷b对照品，加甲醇溶解定容至25ml，即得白杨素、黄芩素、白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷a、黄芩苷、木蝴蝶苷b浓度分别为12.594μg/ml、69.600μg/ml、32.286μg/ml、128.256μg/ml、31.512μg/ml、60.276μg/ml的混合对照品储备液，即得；

(3)供试品溶液制备：取木蝴蝶配方颗粒，研细，取0.1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入60-80％乙醇50-100ml，称定重量，超声处理15-30分钟，取出，放冷，用60-80％乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，依上述条件进行测定，按外标法计算，即得。

优选的，所述供试品溶液制备，具体为：取木蝴蝶配方颗粒，研细，取0.1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，功率为300w，频率为40khz，取出，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，即得。

优选的，所述木蝴蝶配方颗粒的制备方法为：取木蝴蝶饮片，以水为提取溶媒，加水煎煮两次，每次加投料量5～10倍量的水，煎煮0.5～2小时，合并滤液，滤过；滤液真空减压浓缩至相对密度为为1.02～1.10的清膏；取清膏进行喷雾干燥，得干浸膏粉，干浸膏粉干法制粒得粒度在16～40目的木蝴蝶配方颗粒。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明通过优化色谱条件、质谱条件及供试品的制备，采用uplc-ms/ms法同时测定木蝴蝶配方颗粒中6种化学成分的种类和含量，能有效简化这6种成分的含量测定的操作步骤，减少测定时间，提高了工作效率，实现了对木蝴蝶配方颗粒中黄酮类成分的定性和定量分析。

本发明的含量测定方法灵敏度高，具有很好的分离度，检测方法具有专属性，其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求，为木蝴蝶配方颗粒的质量控制提供快速、准确、可靠的测定方法。

附图说明

图1为对照品色谱图；

图2木蝴蝶配方颗粒色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

1材料和方法

1.1仪器

waters液质联用仪(液相部分acquityuplch-class、质谱部分watersxevotqdms)；百万分之一天平(mettlertoledo，xp26)、万分之一天平(mettlertoledo，me204e)，agilentsbc18色谱柱(2.1×100mm,1.8μm)，电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司，hws-28)，数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，kq500de)，超纯水系统(默克股份有限公司，milli-q-direct)。

1.2试剂

乙腈(德国merck公司，色谱纯)；乙醇(西陇科学股份有限公司，分析纯)；甲醇(西陇科学股份有限公司，分析纯)；磷酸(天津科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；甲酸(天津科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；水为实验室自制水。

1.3对照品

白杨素(批号：111701-200501)、木蝴蝶苷b(批号：111915-201603，含量：91.9％)、黄芩苷(批号：110715-201720，含量：93.5％)、黄芩素(批号：111595-201607，含量：98.5％)对照品购自中国食品药品检定研究院；白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷(批号：wkq17072702，含量：98％)对照品购自四川省维克奇生物科技有限公司；木蝴蝶苷a(批号：17021703，含量：98％)对照品购自成都普菲德生物技术有限公司。

1.4木蝴蝶配方颗粒的制备

取木蝴蝶饮片，以水为提取溶媒，加水煎煮两次，每次加投料量5～10倍量的水，煎煮0.5～2小时，合并滤液，滤过；滤液真空减压浓缩至相对密度为为1.02～1.10的清膏；取清膏进行喷雾干燥，得干浸膏粉，干浸膏粉干法制粒得粒度在16～40目的木蝴蝶配方颗粒。

实施例1：

一种木蝴蝶配方颗粒中6种化学成分的含量测定方法，所述6种化学成分分别为白杨素、白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷、黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷a、木蝴蝶苷b，采用uplc-ms/ms法测定，具体包括以下步骤：

(1)色谱条件与系统适应性试验：

以agilentsbc18柱(2.1×100mm,1.8μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.01％甲酸为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为276nm，流速为0.28ml/min，进样体积为1μl，柱温为30℃；

质谱条件：

电喷雾离子源(esi⁺)，喷雾电压为1.55kv；脱溶剂温度为597℃，离子源温度为148℃；脱溶剂气流为997l/hr；氮气流为1l/hr；质谱扫描采用多反应检测(mrm)扫描模式；监测离子及相关电压参数设定如下表所示：

备注：其中带有“*”为定量离子。

(2)混合对照品溶液的制备：分别精密称取白杨素、黄芩素、白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷a、黄芩苷和木蝴蝶苷b对照品，加甲醇溶解定容至25ml，即得白杨素、黄芩素、白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷a、黄芩苷、木蝴蝶苷b浓度分别为12.594μg/ml、69.600μg/ml、32.286μg/ml、128.256μg/ml、31.512μg/ml、60.276μg/ml的混合对照品储备液，即得；

(3)供试品溶液制备：取木蝴蝶配方颗粒，研细，取0.1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，依上述条件进行测定，按外标法计算，即得。

方法学考察：

1、色谱柱的选择

经比较发现，agilentsbc18柱(2.1×100mm,1.8μm)柱分离效果最好，峰型更好，因此，选择agilentsbc18柱(2.1×100mm,1.8μm)柱为色谱柱。

2、检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对样品进行全波长扫描，发现在276nm处基线稳定，各峰峰面积较高，因此，检测波长定为276nm。

3、流动相及洗脱条件的选择

要实现同时测定木蝴蝶配方颗粒中6种成分的含量测定，流动相的选择是关键技术。

本发明流动相及洗脱条件的选择采用如下方法进行比较：

流动相条件优化1：

以agilentsbc18柱(2.1×100mm,1.8μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.01％甲酸为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为276nm，流速为0.4ml/min，进样体积为1μl，柱温为30℃；

流动相条件优化2：

以agilentsbc18柱(2.1×100mm,1.8μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.01％甲酸为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为276nm，流速为0.35ml/min，进样体积为1μl，柱温为30℃；

流动相条件优化3：

以agilentsbc18柱(2.1×100mm,1.8μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.01％甲酸为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为276nm，流速为0.28ml/min，进样体积为1μl，柱温为30℃；

结果显示：优化条件1与优化条件2中峰2包含了其他色谱峰，峰纯度没有达到要求，且没有达到基线分离要求，而优化条件3中个各色谱峰满足基线分离要求，故选择优化条件3进行实验。

4、供试品溶液制备方法考察

本次实验分别考察了对不同提取溶剂、不同提取方式、不同提取时间及不同提取溶剂用量对木蝴蝶配方颗粒中化学成分含量的影响，通过测定各成分含量及总含量，确定最优条件，选择因素如下所示，结果如下表所示。

提取溶剂：选择甲醇、70％乙醇、乙醇；

提取方式：选择加热回流提取、超声处理提取；

提取时间：选择15min、30min、60min；

提取溶剂用量：料液比选择0.1g：15ml、0.1g：25ml、0.1g：50ml、0.1g：100ml。

表提取溶剂考察

表提取方式考察

表提取时间考察

表提取溶剂用量考察

由上述结果可以看出，用70％乙醇作为提取溶剂提取时，6个指标成分总含量最高，且各个成分含量较大，选择70％乙醇作为提取溶剂；采用超声处理和加热回流两种提取方式6个指标成分含量结果相差不大，考虑到操作的简便性，采用超声处理提取方式；采用不同提取时间提取，6个指标成分含量差异不大，当提取时间为30min时，各成分的含量较好，因此，选择超声处理30分钟；随着提取溶媒用量的增加，对各成分含量有所提高，提取溶剂用量为50ml已提取完全，为保证方法的耐用性及选择合适的进样浓度，提取溶剂用量选择50ml。

因此，确定以70％乙醇作为提取溶剂，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，0.1g:50ml作为料液比作为样品的制备方法。

5、方法学验证

5.1.1精密度精密吸取混合对照品溶液5.0ml于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成含白杨素、黄芩素、白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷a、黄芩苷、木蝴蝶苷b浓度分别为6.297、34.800、16.143、64.128、15.756、30.138μg/ml的对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，考察精密度，峰面积相对标准偏差(rsd)见表2，结果rsd<3％，表明仪器精密度良好。

5.1.2线性关系精密量取混合对照品溶液，按稀释倍数为1、1.2、1.5、2、3、6依次逐级稀释，定容，制得6个浓度梯度的系列混合对照品溶液，按照上述色谱和质谱条件测定，以峰面积对进样量浓度进行线性回归，绘制标准曲线，求得各成分回归方程、相关系数、线性范围，见表1，结果显示6个成分的线性关系良好。

表1木蝴蝶配方颗粒中6个成分的线性关系考察结果

5.1.3重复性取同一批木蝴蝶配方颗粒(批号：8016072)，按照供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，按照上述色谱和质谱条件进行平行测定，测得白杨素、黄芩素、白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷a、黄芩苷和木蝴蝶苷b的含量及相应的rsd，见表2，实验结果显示本方法重现性良好。

5.1.4稳定性精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12h后进样，测定峰面积，峰面积相对标准偏差(rsd)见表2，实验结果显示供试品溶液在12h内稳定性良好。

5.1.5加样回收率精密称取已知含量的木蝴蝶配方颗粒(批号：8016072)共6份，分别精密加入一定量的对照品溶液，按照供试品溶液的制备方法及质谱条件测定，计算白杨素、黄芩素、白杨素-7-o-β-d葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷a、黄芩苷和木蝴蝶苷b的回收率，见表2，结果表明加样回收率良好。

表2方法学验证结果汇总表

实施例2不同批号的木蝴蝶配方颗粒的含量测定

取不同批号的木蝴蝶配方颗粒，按照上述含量测定方法进行测定，测定其结果见表3：

表3样品含量测定结果(mg·g^-1，n＝2)