本发明涉及细胞观察
技术领域：
，具体涉及一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法。
背景技术：
：目前，观察血管干细胞、内皮前体细胞的方法主要为体内观察法：局部植入或静脉输入荧光标记(如gfp、cm-dil等标记)的细胞，于不同时间段，取待测靶血管进行观察；或植入/输入其他方式标记(如brdu)的细胞，于不同时间段，取血管标本，用组织化学、荧光免疫组织化学等方法观察、评价。这两种方法共同缺点有：①不能实时观察，观察时间点的选择有盲目性和随意性，观察点的取舍有随机性，从而影响评价的准确性；②了解细胞归巢、黏附动态变化、影响因素难度大，需投入较大的时间和成本。用超顺磁性氧化铁(造影剂)标记细胞磁共振成像可在体原位实时观察细胞附壁，但超顺磁性氧化铁有细胞毒性，如何解读观察结果仍存在争议。此外，还出现了体外观察方法，如专利zl201310156400.7公开了“一种观察血管干细胞附壁的方法”，包括以下步骤：1)取待观察的血管干细胞，用荧光染料进行标记后，备用；2)在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流5～10min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；其中，所述暴露出的中动脉为完整的中动脉或损伤的中动脉；3)将步骤1)得到的经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流1～4h后，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。该发明易于实施、操作简便、结果明确，证明了用离体耳中动脉观察荧光标记的血管干细胞附壁是可行的。但是，该专利中需要避光循环灌流的时间为1～4h，耗时较长，该方法推广应用尚存在一定的局限性。技术实现要素：鉴以此，本发明的目的是提供一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法，主要对灌流步骤进行改进，有效解决现有技术中灌流时间过长的问题。本发明的技术方案是：一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法，包括以下步骤：1)在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流3～5min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；2)将经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流3～5min后，改用灌流助液循环灌流5～8min，再继续用含有经荧光染料标记的血管干细胞的罐流液循环灌流3～5min，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察；3)结果判断：损伤的中动脉的受损部位观察到荧光，完整的中动脉未观察到荧光；其中，所述灌流液为含有0.1～0.2mmol/l麦冬多糖的任-洛液，所述灌流助液为含有5～10mmol/l的氯化钾、5～8mmol/l的氯化镁、0.1～0.2mmol/l麦冬多糖和0.5～1.5mmol/l柠檬酸钠的生理盐水。优选的，所述的血管干细胞为内皮前体细胞，内皮前体细胞粘附于损伤的中动脉的受损部位。优选的，所述灌流液为含有0.2mmol/l麦冬多糖的任-洛液。优选的，所述灌流助液为含有5mmol/l的氯化钾、5mmol/l的氯化镁、0.1mmol/l麦冬多糖和1.5mmol/l柠檬酸钠的生理盐水。优选的，灌流速度为2.0ml/min。优选的，加入灌流液中的经荧光染料标记的血管干细胞的量为1×103个细胞/ml灌流液。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明在现有技术的基础上，对灌流液进行优化，并在灌流过程中采用了灌流助剂，采用本发明方法，灌流时间降至11min，相比于现有技术的1h，灌流时间明显降低，整体缩短利用中动脉观察血管干细胞的时间，提高工作效率，且操作简便，易于推广应用。具体实施方式为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。本发明实施例中所述任-洛液为：成分含量nacl(g)9kcl(g)0.42cacl2(g)0.24nahco2(g)0.5kh2po4(g)0.5glucose(g)1.0蒸馏水加至(ml)1000本发明实施例中所用中动脉为兔耳中动脉，兔耳中动脉指耳背部外2/3段耳中动脉(长度随兔品系及年龄为4～10cm)。实施例1一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法1、方法1)晚期发育的内皮前体细胞(oecs)体外扩增及鉴定：在戊巴比妥钠麻醉下，抽取兔的两股骨的骨髓共6ml，从中分离出超过2×108单个核细胞(mncs)。将mncs接种于胶原蛋白ι包被的培养皿中用内皮细胞基础培养基(ebm-2)及添加剂(包括肝素、抗坏血酸、庆大霉素、两性霉素b、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、表皮生长因子等，均为clonetics公司产品)培养28天，获得4～5×107贴壁细胞。细胞呈鹅卵石状，可摄入低密度脂蛋白，能结合血凝素，cd144、caveolin-1表达阳性，cd14、cd45表达阴性，产生一氧化氮，具迁移能力，在基质matrigel-matrix存在时可形成管状结构；3)荧光染料标记：用cm-dil标记oecs，细胞在贴壁状态下2μg/mlcm-dilpbs溶液37℃孵育5min，4℃下15min，pbs洗两遍；4)先用灌流液，在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流3min，灌流液自兔耳中动脉流入，由兔耳静脉流出；5)离体兔耳灌流法观察自体oecs附壁：将经荧光染料标记的oecs加入灌流液中(1×103个细胞/ml灌流液)，在恒温恒压条件下，避光循环灌流3min后，改用灌流助液循环灌流5min，再继续用前述含有经荧光染料标记的血oecs的罐流液循环灌流3min，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。其中，所述灌流液为含有0.2mmol/l麦冬多糖的任-洛液，所述灌流助液为含有5mmol/l的氯化钾、5mmol/l的氯化镁、0.1mmol/l麦冬多糖和1.5mmol/l柠檬酸钠的生理盐水，灌流速度为2.0ml/min。实验设2组：①耳中动脉内皮完整组②耳中动脉内皮受损组2、结果与分析实验表明，cm-dil标记的自体oecs恒压灌流11min，荧光显微镜下，耳中动脉内皮受损段可看到极强的红色荧光，在其他部位未看到荧光，在内皮完整耳中动脉未看到荧光。实施例2一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法实施例2与实施例1的区别在于，4)先用灌流液，在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流3min，灌流液自兔耳中动脉流入，由兔耳静脉流出；5)离体兔耳灌流法观察自体oecs附壁：将经荧光染料标记的oecs加入灌流液中(1×103个细胞/ml灌流液)，在恒温恒压条件下，避光循环灌流5min后，改用灌流助液循环灌流8min，再继续用前述含有经荧光染料标记的血oecs的罐流液循环灌流5min，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。其中，所述灌流液为含有0.1mmol/l麦冬多糖的任-洛液，所述灌流助液为含有10mmol/l的氯化钾、8mmol/l的氯化镁、0.2mmol/l麦冬多糖和0.5mmol/l柠檬酸钠的生理盐水。实验设2组：①耳中动脉内皮完整组②耳中动脉内皮受损组2、结果与分析实验表明，cm-dil标记的自体oecs恒压灌流18min，荧光显微镜下，耳中动脉内皮受损段可看到极强的红色荧光，在其他部位未看到荧光，在内皮完整耳中动脉未看到荧光。对比例1采用专利zl201310156400.7公开的“一种观察血管干细胞附壁的方法”。实验结果与zl201310156400.7中所述相同。对比例2对比例2与实施例1的区别在于，未采用灌流助剂，即实施例1中的步骤5)改为：离体兔耳灌流法观察自体oecs附壁：将经荧光染料标记的oecs加入灌流液中(1×103个细胞/ml灌流液)，在恒温恒压条件下，避光循环灌流6min，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。实验结果显示，耳中动脉内皮受损段和内皮完整耳中动脉均未观察到荧光。对比例3对比例3与实施例1的区别在于，灌流液中未加入麦冬多糖。实验结果显示，耳中动脉内皮受损段和内皮完整耳中动脉均未观察到荧光。对比实施例1和实施例2可知，采用本发明方法，仅需恒压灌流11～18min，即可观察细胞附壁情况，相比对比例1的1h，极大的缩短了操作时间，而且本发明灌流液中的细胞浓度仅为1×103个细胞/ml灌流液，可见在较低细胞浓度下也并不影响观察结果。对比例实施例1与对比例2、对比例3的结果可知，采用灌流助剂和灌流液中加入麦冬多糖，可有效缩短灌流时间。在未采用灌流助剂和含有麦冬多糖的灌流液的前提下，可能由于灌流时间过短，耳中动脉内皮受损段未能观察到荧光。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12