一种珊瑚脂质的提取方法与流程

本发明涉及珊瑚生理生态学研究技术领域，具体涉及一种珊瑚脂质的提取方法。

背景技术：

珊瑚礁生态系统是地球上生产力和多样性最高生态系统之一。但是近年来，随着人类对海洋的开发力度逐渐增加和气候变化，珊瑚礁生态系统出现显著的退化。为了研究人类活动和环境变化对珊瑚礁生态系统的具体影响，我们需要从各个不同的方面来认识和理解珊瑚的生理学响应机制。其中能量代谢的变化就是很重要的一部分，而珊瑚脂质作为能量储备的重要物质，脂质含量作为珊瑚生理健康状态的重要指示参数，显得格外重要。所以，提取珊瑚组织中的脂质从而对其变化进行研究则尤为重要。本发明提供了一种简便、高效的方法提取珊瑚中的脂质，优化了操作流程与试剂用量，阶段性地缩短了实验操作周期，对珊瑚的生理学研究和保护具有重要意义。

孙甜甜等人(南极磷虾脂质提取方法的比较，食品工业科技，2012,33(16):115-117)利用氯仿-甲醇、正己烷和95％乙醇三种不同溶剂及超临界co2技术提取南极磷虾脂质，对比发现氯仿-甲醇的提取率最高。脂质提取的floch法(即应用氯仿-甲醇来提取生物脂质方法，folchj,lees,mandstanleyghs.asimplemethodfortheisolationandpurificationoftotallipidesfromanimaltissues.j.biol.chem.1967，226:497-509)得到较广泛的应用，但该方法的提出针对的是普遍的生物组织，对于某些生物脂质的提取效果不好。本发明的对比例1实验结果中证明了该说法。本发明在此方法上做出改进，提出一种专门针对珊瑚脂质的提取方法。

郭少华等人(风信子鹿角珊瑚繁殖前后脂质与脂肪酸的变化，热带海洋学报，2014,33(1):74-80)中采用氯仿-甲醇混合液提取法提取珊瑚中的脂质，但该方法只是沿用rodrigues(physiologyandbiogeochemistryofbleachedandrecoveringcoralsfromhawaii.universityofpennsylvania,p.h.dthesis,2007,1-265.)的方法，没有通过实验寻找到最适合珊瑚的试剂用量，提取脂质时采用的是珊瑚湿样直接提取，本发明的对比例2实验结果显示，珊瑚湿样的脂质提取率较低，并且由于没有洗涤步骤，提取出的脂质纯度也不高。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种海洋生物珊瑚脂质的提取方法，该方法具有操作简便、阶段性操作时间短、提取效率高的优点，对珊瑚的研究和保护具有重要意义。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种珊瑚脂质的提取方法，包括以下步骤：

(1)将珊瑚和水混合，研磨成匀浆；

(2)往步骤(1)得到的匀浆中加入氯仿-甲醇混合液进行萃取，过滤，收集滤液；

(3)往步骤(2)得到的滤液中加入kcl溶液，然后进行分液操作保留有机相；

(4)往步骤(3)得到的有机相中加入甲醇-水混合液进行洗涤、分液，保留有机相；

(5)将步骤(4)得到的有机相在氮气真空环境中蒸发至干，然后用氯仿复溶后再次蒸干，得到脂质。

优选，所述步骤(1)中将珊瑚和水混合是按1g:2～5ml的比例将干燥的珊瑚样品和蒸馏水混合，所述的研磨是加入石英砂研磨，所述的研磨成匀浆，其匀浆置于棕色瓶中；所述步骤(2)的氯仿-甲醇混合液为氯仿和甲醇按2:1的体积比混合，所述氯仿-甲醇混合液的加入量为匀浆体积的4～12倍，所述的滤液用棕色瓶子收集；所述步骤(3)的kcl溶液的质量分数为0.88％，所述kcl溶液的加入量为氯仿-甲醇混合液体积的1/5；所述步骤(4)的甲醇-水混合液为甲醇和蒸馏水按1:1的体积比混合的混合液；所述步骤(5)将有机相在氮气真空环境中蒸发至干具体为：将有机相在39℃、氮气流速为5l/min、真空泵压力为0.05mpa的条件下蒸发至干。

优选，所述氯仿-甲醇混合液的加入量为匀浆体积的8倍。

优选，所述步骤(2)中的萃取，第一次萃取后的残渣再用氯仿-甲醇混合液洗涤，洗涤液和残渣再一起过滤，得到滤液，合并滤液。

优选，所述的过滤是用whatmanno.1滤纸过滤。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

相较单纯的氯仿/甲醇法，本发明用的实验仪器操作更简便，阶段性操作实验时间短，试剂易得而且相对安全，相对于floch法，本方法得到的脂质提取更充分、有效(见图2)。具体如下：①根据珊瑚组织的特点，本发明珊瑚脂质的提取方法，其优点在于步骤(2)中加入氯仿-甲醇混合液a(v氯仿：v甲醇＝2:1)，可以充分提取珊瑚脂质。②步骤(3)中向滤液中加入的kcl溶液的浓度为0.88％且体积为样液总溶剂体积的1/5，能够让混合匀浆充分洗涤分层，有效回收脂质。相较于floch法的离心环节，该操作流程有利于提高珊瑚脂质提取率。③步骤(5)在于充满氮气的真空环境中蒸发至干，要求氮气流速约为5l/min，真空泵的压力约为0.05mpa；可以快速有效的蒸干脂质(10min)。这一步骤精确了蒸干条件，阶段性缩短了实验周期。另外，本发明根据珊瑚组织的特点，采用研磨的方式来使组织颗粒变细，从而能够让有机溶剂和珊瑚组织充分混合而提高提取的效率。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的风信子鹿角珊瑚acroporahyacinthus的脂质提取数据百分比含量图。a为风信子鹿角珊瑚脂质百分比含量，b为6个站点的珊瑚样品中脂质平均含量。

图2为本发明对比例1采用folch法对6个站点的风信子鹿角珊瑚样品进行脂质提取的平均含量。

图3为用本发明方法对6个站点的风信子鹿角珊瑚湿样提取脂质的平均含量。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

称取丛生盔形珊瑚冻干样1.0035g置于研钵中，加入3ml蒸馏水和少量石英砂研磨5min后得到组织匀浆，将组织匀浆倒入小的棕色试剂瓶中。将24ml混合液a(v氯仿:v甲醇＝2:1)加入到匀浆中过夜萃取，然后往萃取液中再加入12ml的混合液a并通过whatmanno.1滤纸过滤，为了保证提取的充分性，混合液a分三次加入到萃取液中，最后一次将瓶内的残渣用剩余的混合液a冲洗并将洗液和残渣一起通过滤纸过滤，收集滤液。往滤液中加入7ml质量分数为0.88％的kcl溶液进行第一次分液操作。若分液过程中分液不明显，可加入少量甲醇。由于脂质溶于氯仿，而氯仿的密度大于kcl溶液，故溶有脂质的液体在下层(有机相)。分液操作时从分液漏斗下口放出有机相并保留该有机相液体进行后续的洗涤分液操作。向保留的有机相中加入甲醇-蒸馏水混合液b(v甲醇:v蒸馏水＝1:1)进行洗涤分液操作，保留洗涤后的有机相，共进行三次洗涤分液操作，每次消耗混合液b14ml。将装有洗涤后的有机相溶液的棕色瓶置于39℃的加热电热板上预温1min后向瓶内通入氮气蒸发18min后溶液完全蒸干，蒸发过程中氮气的流速控制在5l/min左右，真空泵的压力约为0.05mpa。蒸干后再次向瓶内加入2ml氯仿将脂质重新溶解，然后再次进行蒸发操作。最后恒温称重减去原瓶身重量得到丛生盔形珊瑚组织中脂质的重量。

实验例2

用生物钳取1.005g风信子鹿角珊瑚样置于研钵中，加入2ml蒸馏水和少量石英砂研磨5min后得到组织匀浆，将组织匀浆倒入小的棕色试剂瓶中。将24ml混合液a(v氯仿:v甲醇＝2:1)加入到匀浆中过夜萃取，然后往萃取液中再加入12ml的混合液a并通过whatmanno.1滤纸过滤，混合液a分三次加入到萃取液中，最后一次将瓶内的残渣用剩余的混合液a冲洗并将洗液和残渣一起通过滤纸过滤，收集滤液。往滤液中加入7ml质量分数为0.88％的kcl溶液然后分液，保留下层有机相。向保留的有机相中加入混合液b(v甲醇:v蒸馏水＝1:1)进行洗涤分液操作，保留洗涤后的有机相，共进行三次洗涤分液操作，每次消耗混合液b12ml。将最终得到的洗涤后的有机相溶液在39℃的氮气真空环境中蒸发20min至蒸干，蒸发过程中氮气的流速控制在5l/min左右，真空泵的压力约为0.05mpa。蒸干后再次向瓶内加入2ml氯仿将脂质重新溶解，然后再次进行蒸发操作。最后恒温称重减去原瓶身重量得到丛生盔形珊瑚组织中脂质的重量。经计算得出珊瑚样中的脂质含量如图1所示。根据图1a可知，风信子珊瑚的脂质含量在其总生物量中占约40％左右；根据图1b可知，6个站点(1ah-6ah)的珊瑚样脂质平均含量是在43％±4％，最高在54％左右，最低在33％左右。

实验例3

从三亚蜈支洲岛自然保护区南北两侧的3个实验站采样获得11个珊瑚样品，包括截顶蔷薇珊瑚、丛生盔形珊瑚和疣状杯形珊瑚三个珊瑚种类。具体操作步骤如下：

(1)将11个珊瑚样品置于-20℃冰箱中，冻干后取出用钳子从每个样品钳下大约1.5g的小样(每个样品做3个平行样)；

(2)用洗牙器清除其表面藻类并干燥24h后进行研磨，研磨时加入约3ml蒸馏水和少量石英砂研磨成匀浆液，然后将24ml混合液a(v氯仿:v甲醇＝2:1)加入到匀浆液中过夜萃取；

(3)向萃取液中加入15ml混合液a冲洗混合物并通过whatmanno.1滤纸过滤，收集滤液；

(4)往滤液中加入8ml质量分数为0.88％的kcl溶液，充分混合后分液。用分液漏斗分离水相和有机相，去除水相，保留下层有机相；

(5)再向有机相中加入混合液b(v甲醇:v蒸馏水＝1:1)，重复(4)中洗涤分液操作，保留洗涤后的有机相，洗涤分液操作重复三次，每次消耗混合液b16ml；

(6)将洗涤后的有机相溶液用棕色瓶收集后在39℃的氮气真空环境中蒸发18min直至蒸干，蒸发过程中氮气的流速控制在5l/min左右，真空泵的压力约为0.05mpa。蒸干后再次向瓶内加入3ml氯仿将脂质重新溶解，然后再次进行蒸发操作，蒸干之后将含有脂质的棕色瓶放入恒温干燥箱中干燥24h后带盖称量瓶子的重量，该重量减去瓶子(带盖)的原重量即为提取出的脂质的质量(均一化为单位表面积)。经计算得出这3种珊瑚组织的脂质重量如表1所示。从表1中可以看出，这3种珊瑚的脂质含量的范围在1～4mg/cm²之间，误差范围在0.1～0.3之间。

表1截顶蔷薇珊瑚、丛生盔形珊瑚和疣状杯形珊瑚的含量测定结果

注：表中数据均一化为单位表面积，即为mg/cm²。

对比例1

采用folch法进行珊瑚脂质的提取。

(1)将风信子鹿角珊瑚组织剪碎，称取1.005g；按照1g组织加入20ml溶剂的比例加入氯仿-甲醇(2:1，v/v)混合溶液，混匀15～20min后，于1500～2000r/min离心5min收集溶液；

(2)往步骤(1)的溶液加入0.2倍体积的水(即20ml溶液加4ml水)或质量分数为0.9％nacl溶液清洗，涡旋3～5秒，以2000rpm离心10min得到两相液面；吸取上清液，用于分析检测神经节苷脂类或小的极性分子，如果有必要(为移除标记分子)，用甲醇和水(1:1，v/v)清洗两相液交界面1～2次，注意不要冲洗到下层液体内；

(3)收集的下层液即氯仿层含有脂质，用氮气吹干氯仿即得脂质。

图1为风信子鹿角珊瑚的脂质含量百分比图以及我们用此发明方法和floch法提取的脂质含量图。此发明法提取的脂质含量平均为43％，而floch法提取的脂质含量平均为10％。对比可以发现，相比floch法，用此发明方法提取的脂质含量大大提高，约为floch法提取的4倍。

对比例2

用珊瑚湿样直接提取脂质。

(1)取珊瑚湿样1.0330g加入2ml蒸馏水研磨。再加入16ml氯仿-甲醇混合液(v氯仿：v甲醇＝2:1)萃取24h。

(2)将混合液通过whatmanno.1滤纸过滤，取滤液加入7ml0.88％kcl溶液然后分液。

(3)取下层溶液加入18ml甲醇-蒸馏水混合液(v甲醇：v蒸馏水＝1:1)洗涤分液，重复该操作3次。

(4)在39℃氮气中蒸干有机溶剂得到脂质。

图3为提取的脂质含量图，对比图1b可以发现，用珊瑚湿样提取的脂质含量有所降低。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。