本发明涉及一种抗体检测方法，尤其涉及一种检测抗肾小球基底膜抗体的方法。
背景技术：
抗gbm抗体阳性病人占自身免疫性肾炎的5%，在肾小球性肾炎、咳血综合征患者中有80%的阳性检出率，半月体形成性肾小球肾炎患者中有20%～70%的阳性检出率，也可在增殖性肾炎中检出。抗肾小球基底膜抗体是由肾小球毛细血管内外透明层及中间致密层构成的网状结构，以糖蛋白为主体。检测gbm抗体的最常用方法是以肾脏组织为抗原的iif法（间接免疫荧光法），其荧光特点是在肾小球基底膜处显示典型的花瓣状、或斑点状、颗粒状着染。iif法可出现假阳性结果。如何提供一种检测准确度高的检测方法是现有技术急需解决的技术问题。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种定性检测抗肾小球基底膜抗体的方法，以解决现有技术中存在的技术问题。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种检测抗肾小球基底膜抗体的方法，包括如下步骤：
a)抗原纯化：纯化处理抗肾小球基底膜抗原，将纯化后的抗原置于ph=6.0-7.2的缓冲溶液中，在适宜环境中静置30分钟以上，获取纯化后的抗原；
b)抗原前处理：将步骤a中纯化后的抗原置于前处理液中，将其置于适宜的温度中处理至少两小时；
c)抗原包被：用包被缓冲液稀释抗肾小球基底膜抗原至1-10ug/ml，以每孔50-100ul加入酶标板中，至于适宜环境中孵化至少30分钟，然后洗板；
d)封闭：以每孔150-200μl的量加入封闭液，然后至于适宜温度下封闭0.5-4h小时，然后洗板；
e)酶标抗体：将酶标抗体进行稀释后，与待检血清进行1∶10-20稀释后，每孔加入50-100μl，在适宜温度下静置，然后洗板；
f)显色：每孔加入显色液，然后每孔加入终止液终止反应。
优选的，所述前处理液由以下按重量份数配比组成：磷酸氢二钠1-5份、牛血清白蛋白2-8份、吐温-201.5-4份、苯磺酰胺1-6份、柠檬酸钠15-26份。
优选的，所述前处理液由以下按重量份数配比组成：磷酸氢二钠3份、牛血清白蛋白6份、吐温-203份、苯磺酰胺4份、柠檬酸钠20份。
优选的，所述包被缓冲液选自50mmph=9.6的碳酸盐缓冲液、20mm，ph=8.5的tris-hcl缓冲液或者10mmph=7.2的pbs缓冲液。
优选的，所述包被缓冲液选自由na2co3和nahco3配置而成的50mmph=9.6的碳酸盐缓冲液。
优选的，所述抗肾小球基底膜抗原可以是纯化的天然抗原、重组抗原、人工合成多肽或小分子化合物。
本发明的有益效果是：
本发明提供的方法证明抗肾小球基底膜抗体经过纯化处理后，再用前处理液处理，测试结果显示诊断的灵敏度和特异性均显著提升。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明技术方案作进一步的详细描述，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
本发明提供的检测抗肾小球基底膜抗体的方法，包括如下步骤：
a)抗原纯化：纯化处理抗肾小球基底膜抗原，将纯化后的抗原置于ph=6.8的缓冲溶液中，在370c环境中静置80分钟，经离心处理后获取纯化后的抗原；
b)抗原前处理：将步骤a中纯化后的抗原置于前处理液中，将其置于370c环境中处理至3小时；
c)抗原包被：用ph=8.5的20mmtris-hcl包被液稀释抗肾小球基底膜抗原至1-10ug/ml，以每孔50-100ul加入酶标板中，至于适宜环境中孵化至少30分钟，然后，用含0.05％吐温-20的pbs作为洗涤液进行洗涤，酶标板中200ul/孔，震荡洗涤3-5次，每次3min，甩干；
d)封闭：以10%小牛血清作为封闭液，以每孔150-200μl的量加入，然后至于370c温度下封闭2小时，然后洗板；
e)酶标抗体：将酶标抗体进行1：260稀释后，与待检血清进行1∶15稀释后，每孔加入80μl，在370c下静置，然后洗板；
f)显色：每孔加入30μltmb显色液，避光显色20分钟，然后每孔加入2mh2so4终止液终止反应。
前处理液：
所述前处理液由以下按重量份数配比组成：磷酸氢二钠3份、牛血清白蛋白6份、吐温-203份、苯磺酰胺4份、柠檬酸钠20份。
前处理液的配置：
a)将磷酸氢二钠加入去离子水中，在20℃下以150rpm的搅拌速度搅拌5小时，再加入柠檬酸钠，存放于5℃保存30分钟；
b)将牛血清白蛋白以190rpm的搅拌速度加入步骤a得到的溶液中，待溶液澄清后加入吐温-20,继续搅拌至其完全分散；
c)再向b中加入苯磺酰胺将以60rpm的搅拌速度搅拌100分钟，再以0.45μm滤膜过滤后加入吐温与pbs，即可制得前处理液。
抗原纯化：
a)将6ml抗肾小球基底膜抗原与0.01mpbs在离心管内等体积混合，向其中加入8ml饱和硫酸铵溶液，边滴加边摇匀，然后置于60c静置过夜；
b)将步骤a中的物质在离心机内离心，10000r/min离心15分钟，除上清。
c)将步骤b中离心后的沉淀用2ml0.01mpbs溶解，然后缓慢加入3ml饱和硫酸铵溶液，边滴加边摇匀，然后置于6摄氏度静置2小时；
d)将步骤c中的物质在离心机内离心，10000r/min离心15分钟，除上清;
e)将步骤d中离心后的沉淀用1ml0.01mpbs溶解,转移到md14000透析袋内，用0.01mpbs进行透析，每次两小时透析5次。
实施例2
和本发明的方法进行对比的检测抗肾小球基底膜抗体的方法，包括如下步骤：
a)抗原包被：用ph=8.5的20mmtris-hcl包被液稀释抗肾小球基底膜抗原至1-10ug/ml，以每孔50-100ul加入酶标板中，至于适宜环境中孵化至少30分钟，然后，用含0.05％吐温-20的pbs作为洗涤液进行洗涤，酶标板中200ul/孔，震荡洗涤3-5次，每次3min，甩干；
b)封闭：以10%小牛血清作为封闭液，以每孔150-200μl的量加入，然后至于370c温度下封闭2小时，然后洗板；
c)酶标抗体：将酶标抗体进行1：260稀释后，与待检血清进行1∶15稀释后，每孔加入80μl，在370c下静置，然后洗板；
d)显色：每孔加入30μltmb显色液，避光显色20分钟，然后每孔加入2mh2so4终止液终止反应。
实施例3
收集400份临床确诊的患者血清，分别用实施例1和实施例2中的检测方法对其进行检测，统计检测结果如下：
通过计算可知：
实施例1中方法：诊断灵敏度（%）=318/(310+82)×100%=79.5%；
实施例2中方法：诊断灵敏度（%）=251/(251+149)×100%=62.7。
从临床上收集健康人的血清和非患者（包括其他类型患者）血清各400份用上述的方法测试，统计结果如下：
计算可知诊断的特异性（%）=776/800=97%。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及内容所作的等效结构或者等效流程变换，或者直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。