ST2免疫层析定量检测试纸条的制作方法

本实用新型属于免疫检测领域，具体涉及一种高灵敏度ST2免疫层析定量检测试纸条。

背景技术：

生长刺激表达基因2蛋白(growth simulating express gene 2，简称ST2)是白介素I受体家族成员，是心肌细胞受到生物机械应力后产生的一种心肌蛋白。ST2基因产物包括4种亚型：s ST2、ST2L、ST2V和ST2LV。s ST2为可溶型ST2，其无跨膜序列，可分泌到细胞外；ST2L为跨膜型ST2，具有跨膜序列，含有跨膜片段和一个Toll/IL-1R受体(TIR)胞内结构域；ST2V和ST2LV则是ST2的两个剪切变体。ST2L可与配体IL-33结合，激活信号通路，构成一个力学激活系统，可发挥心脏的保护作用，如：抗心肌纤维化、抗心肌细胞肥大、减少细胞坏死、改善左室功能等。而sST2作为诱骗受体，阻止ST2L与IL-33结合，削弱其心脏保护作用，从而加速心肌纤维化、心肌重构和心室功能障碍，导致死亡风险增高。由于ST2在心血管疾病生理、病理学中起关键作用，2013年ACC/AHA心衰指南和2014中国心衰指南已将可溶性ST2引入生物标志物的推荐之中，为心血管疾病的辅助诊断、治疗及预后的评价提供一个新型生物学标记物。

生物素-亲和素系统(biotinavidin system,BAS)，是一种新型生物反应放大系统。BAS是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素与亲和素间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达10¹⁵M^-1)。生物素极易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。链霉亲和素是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，链霉亲和素与亲和素一样分子中每条肽链都能结合一个生物素，因几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素或链霉亲合素结合。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。将该系统应用于免疫组化，酶联免疫，荧光免疫，放射免疫等检测技术中，可显著地提高以上技术方法的敏感性、特异性和稳定性，使方法更简便，有助于临床快速诊断，并利于进行大规模流行病学调查，成为研究免疫反应的有力工具。由于BAS检测系统经济快速，又无放射物质污染，不需复杂仪器，充分显示了此系统的巨大潜力和应用的可能性。

目前，ST2检测方法主要是酶联免疫技术(ELISA)，该技术存在灵敏度低、检测时间长、重复性不好，操作不方便等缺点，不适合临床快速诊断。因此，开发灵敏度更高、检测快速的定量检测产品有利于心血管疾病的辅助诊断、治疗及预后，具有较高的社会经济价值。

技术实现要素：

本实用新型的目的，在于提供一种ST2免疫层析定量检测试纸条，其基于双抗体夹心法、荧光免疫侧向层析和生物素-链霉亲和素放大系统，使用生物相容性良好的荧光蛋白作为荧光标记物，不仅提高了检测灵敏度和检测稳定性，同时降低了非特异性结合，检测时间不大于10分钟，大大提高了诊断效率。

本实用新型解决其技术问题的解决方案是：ST2免疫层析定量检测试纸条，其包括底板，所述底板上依次设有的样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫交叠压在荧光标记物结合垫上后形成加样区；所述荧光标记物结合垫上固定有生物素标记的ST2单克隆抗体和链霉亲和素标记的荧光蛋白；所述吸水垫和荧光标记物结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端后在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定识别ST2另外一个表位的单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。

作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光标记物结合垫包括层叠的第一荧光标记物结合垫和第二荧光标记物结合垫，所述第一荧光标记物结合垫的一端垫在样品垫的下方，所述第二荧光标记物结合垫交叠压在硝酸纤维素膜的一端。

作为上述技术方案的进一步改进，还包括卡壳，所述底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均置于卡壳内，所述卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有检测窗，卡壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。

作为上述技术方案的进一步改进，所述检测窗为长方形孔。

作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。

作为上述技术方案的进一步改进，所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。

作为上述技术方案的进一步改进，所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。

作为上述技术方案的进一步改进，所述卡壳包括塑料上壳和塑料下壳，所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。

本实用新型与现有技术相比，具有如下优点：

(1)本实用新型将荧光蛋白作为标记物，此标记物稳定性良好，有利于提高检测稳定性。同时，由于其本身即为蛋白，与抗体相容性佳，可降低非特异性结合。

(2)本实用新型通过利用“链霉亲和素-生物素放大系统”，提高检测灵敏度，有利于提高试剂盒性能。

(3)利用本实用新型进行ST2的检测时间不大于10分钟，检测线性范围为2.0ng/ml～200.0ng/ml，极大地提高了检测效率。

(4)本实用新型可通过荧光免疫分析仪对结果进行判读，可实现自动化，减少主观因素的影响，提供便利、快速、可靠的诊断结果。

(5)本实用新型的卡壳设有样品进入的加样孔和供观测结果的检测窗，根据分析仪器判定结果，准确可靠。

(6)本实用新型制作方便，体积小、便于携带。

(7)本实用新型可批量生产，生产成本低，适用于临床快速诊断和现场快速诊断；易于保存，有利于基层单位推广。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单说明。显然，所描述的附图只是本实用新型的一部分实施例，而不是全部实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他设计方案和附图。

图1是本实用新型实施例一的结构示意图；

图2是本实用新型实施例二的结构示意图；

图3是本实用新型实施例三的结构示意图；

图4是本实用新型实施例四的结构示意图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例和附图对本实用新型的权利要求做进一步的详细说明；但所描述的实施例只是本实用新型的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本实用新型的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本实用新型保护的范围。另外，文中所提到的所有联接/连接关系，并非单指构件直接相接，而是指可根据具体实施情况，通过添加或减少联接辅件，来组成更优的联接结构。

参照图1，ST2免疫层析定量检测试纸条，其包括底板5，所述底板5上依次设有样品垫1、荧光标记物结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4，所述吸水垫4和荧光标记物结合垫2分别交叠压在硝酸纤维素膜3的两端后在硝酸纤维素膜3的表面形成检测区，荧光标记物结合垫2为玻璃纤维膜，所述样品垫1交叠压在荧光标记物结合垫2上后形成加样区，所述荧光标记物结合垫2上固定有生物素标记的ST2单克隆抗体(浓度0.3～1.5mg/mL)和链霉亲和素标记(或亲和素)的荧光蛋白(使用激发光波长530nm，发射光波长570nm，浓度0.1～1.0mg/mL)；所述检测区内的硝酸纤维素膜3上固定有识别ST2另外一个表位的单克隆抗体构成的检测线T(浓度0.5～2mg/mL)和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线C(浓度0.2～2.0mg/mL)，质控线C用于检测试纸条的有效性。

将生物素标记的ST2单克隆抗体和链霉亲和素(或亲和素)标记的荧光蛋白固定在荧光标记物结合垫2上，将有识别ST2另外一个表位的单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜上分别作为检测线T和质控线C。当待测样品加到样品垫1上后，通过层析作用向前移动，样品中ST2与荧光标记物结合垫2上结合荧光标记物(荧光蛋白)的ST2抗体(Mab-ST2*Fluoro)反应形成复合物ST2—Mab-ST2*Fluoro，在层析作用下反应复合物继续向前移动经过硝酸纤维膜上包被的ST2抗体(检测线)时，反应复合物被包被的ST2抗体捕获形成复合物(Mab-ST2—ST2—Mab-ST2*Fluoro)(检测线)，通过荧光免疫分析仪读取检测线的反应信号，在激发光源的作用下，荧光物质发射特定波长的荧光信号，荧光免疫分析仪俘获荧光信号，通过信号转化及设定的标准曲线自动转化为定量数值，计算出样本中ST2的浓度，得到ST2检测结果。

作为上述技术方案的进一步改进，参照图3，所述荧光标记物结合垫2包括层叠的第一荧光标记物结合垫20和第二荧光标记物结合垫21，所述第一荧光标记物结合垫20的一端垫在样品垫1的下方，所述第二荧光标记物结合垫21交叠压在硝酸纤维素膜3的一端。荧光标记物结合垫2的分层设置，便于将荧光标记物结合垫2安装在样品垫1和硝酸纤维素膜3之间。

作为上述技术方案的进一步改进，参照图2和图4，还包括卡壳，所述底板5、样品垫1、荧光标记物结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4均置于卡壳6内，所述卡壳6壳面上对应于硝酸纤维膜3的位置设有检测窗8，卡壳6壳面上对应于样品垫1的位置设有加样孔7。加样孔7对着加样区。

作为上述技术方案的进一步改进，所述检测窗8为长方形孔。

作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。

作为上述技术方案的进一步改进，所述样品垫1为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。样品垫由玻璃纤维构成，经表面活性剂缓冲液浸泡处理，干燥后使用。所述样品垫1的裁剪宽度为0.3～0.5cm。

作为上述技术方案的进一步改进，所述底板5为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。

作为上述技术方案的进一步改进，所述卡壳6包括塑料上壳60和塑料下壳61，所述塑料上壳60扣合塑料下壳61上后形成卡壳6。

以上是对本实用新型的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本实用新型精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。