质量导向分离的制作方法

本发明涉及分离领域，例如液相色谱法。更具体而言，本发明涉及有效分离液体或固体样品的组分的质量导向方法；自动化的这种方法和能够执行该方法的计算机；以及用于质量导向分离液体或固体样品的组分的系统。

背景技术：

许多诊断和制备方法包括针对由例如从经受测试的受试者中获得的液体样品(例如血液或尿液样品)或从合成和/或制造过程中获得的液体样品，进行有机分子的检测。液相色谱法对于任何制备或诊断分离而言，是公知且应用广泛的方法。

快速色谱法是一种已经使用了数十年的色谱技术，它使用填充有不溶性固体载体的(称为固定相)柱或筒和洗脱溶剂混合物(称为流动相)来分离和纯化有机化合物的混合物。固定相和流动相通常具有非常不同的极性，其同时起作用以分离化合物混合物。

众所周知地，在快速色谱法中使用各种非破坏性检测器(例如uv检测器)和/或破坏性质量检测器(例如蒸发光散射检测器(elsd)或质谱仪(ms))，以检测经过分离的在流动相中的分子，并指导自动级分收集器根据来自检测器的信号将经过分离的分子收集在单独的小瓶中。

分离的有机化合物可以在各种应用(例如合成)中找到后续用途，或用作最终产品。

当质谱仪用作自动快速色谱法中的检测器时，通常产生总离子流(tic)色谱图，并且其表示在分析中的每个点处检测到的整个质量范围内的总强度。或者，产生提取的离子色谱图(xic，有时表示为eic)，其中从用于色谱运行的整个数据集中找回表示一种或多种目标分析物的一个或多个m/z值。在这种xic(eic)分析中的每个点处绘制特定分析物的m/z值左右的质量公差窗口内的总强度或基峰强度。

但是，在复杂样品中，在所得色谱图中个别物质的信息可能会被主要由溶剂引起的背景噪声所掩盖。因此，在该领域中需要提供新的具有改善的分辨率的方法。

在常规的质量导向快速色谱法中，通常在真正的分离之前进行准备步骤，以鉴定各个目标物质的质量。但是，这是一个需要大量人力且耗时的步骤。

us2014/0312216(advioninc.)涉及质量导向的级分收集的信号处理，并且更具体地涉及从质谱仪信号中去除噪声的方法，以便改进从色谱柱中洗脱液的级分的收集。该方法被描述为广泛地适用于任何形式的液相色谱法，例如反相色谱法、正相快速色谱法和超临界流体色谱法。该专利申请还记载了一种用于进行级分收集的系统，其中通过质谱法分析来自色谱柱的洗脱液而获得原始信号；基于所述原始信号计算基线信号；并且通过从原始信号中减去基线信号来生成经加工的信号，其将用于后续的级分收集中。因此，所记载的降噪是通过以下方式实现的：对于来自色谱柱的洗脱液进行分析，并且之后直接进行对于分析物的真正的色谱分离，即在相同的色谱运行中。因此，建议将所提出的这种方法用于等度洗脱，并且这种方法在梯度色谱法中似乎是不可行的。此外，由于该方法预先假定在纯溶剂上完成降噪计算，因此重要的是要清楚地意识到分析物何时突破到洗脱液中。因此，us2014/0312216中提出的方法可能难以成功应用于小规模色谱柱中。

技术实现要素：

本发明涉及质量导向分离两种或更多种组分的方法，其可以提供改善的分辨率并因此改善级分收集。

更具体而言，本发明可以基本上减少或甚至消除通常由于溶剂效应而引起的基线漂移所产生的噪声。

这可通过一种方法来实现，其中在真正进行样品分离之前的步骤中，将被确定用于预期的分离的溶剂梯度送至质谱仪，以确定溶剂噪声水平，这对于每一个溶剂梯度都是特定的。

因此，本发明可以无需为确定样品中存在的每一种可能的目标化合物各自的质量而进行的常规、耗时的准备步骤。

另外，在本发明的方法中，基本上消除了样品受检测到噪声的影响的风险。

附图说明

图1为本发明的方法的流程图；

图2(a)为示意性的质谱谱图，其说明m/z部分的噪声水平的选择；和

图3为用于进行本发明的质量导向分离的系统的示意图。

定义

tic(总离子色谱图)为由ms分析中每个点处检测到的整个质量范围的总强度创建的色谱图，其为总离子电流与保留时间的关系图。在常规使用中，tic包括背景噪声以及样本组分。

在提取的离子色谱图(xic或eic)中，从用于色谱运行的整个数据集中提取一个或多个表示一种或多种目标分析物的m/z值。

具体实施方式

在第一方面，本发明涉及通过快速色谱法进行样品的两种或更多种组分的自动化质量导向分离的方法。适用于执行本发明的方法的系统在图3中以示意图示出，并且在参考图3的详细说明的部分中描述。

该方法在图2的流程图中示出，并包括以下步骤：

a)通过改变组成来确定溶剂梯度；

b)通过使所述溶剂梯度进行质谱法(ms)来确定溶剂噪声水平，但并不使溶剂梯度流经色谱柱，并在预定的m/z值范围内产生多个梯度信号t1、t2、t3等。

c)通过使包含根据步骤a)确定的至少一部分梯度的溶剂梯度流经已施加了样品的填充的快速色谱柱来分离样品的两种或更多种组分；

d)使从所述柱流出的洗脱液进行ms并在预定的m/z值范围内产生多个样品信号t’1、t’2、t’3等；其中，作为色谱法的结果，样品信号t’1、t’2、t’3在色谱分析过程中随时间变化。

e)基于步骤b)和步骤d)中获得的ms信号产生谱图；

f)基于步骤e)中产生的谱图，引导级分收集器收集包含分离的组分的每一个级分；

其中，在步骤e)中，从样品信号t’1、t’2、t’3等中减去梯度信号

t1、t2、t3等，得到结果信号r1、r2、r3等，其中如果(tn’–tn)≥0

则rn＝(tn’–tn)，且如果(tn’–tn)<0则rn＝0，这用于在所选m/z值范围内产生谱图，并且

其中可以使用步骤b)中获得的梯度信号，使步骤c)至f)重复一次或多次。

预定的m/z值范围通常由用于自动化质量导向分离的系统的制造商设定，并且通常涉及质谱仪的特性，例如m/z的分辨率。该范围包括m/z的预定数量的离散区域。m/z的离散区域可以具有m/z的相等长度，但是如果人们认为例如在m/z范围中的一部分具有比其他部分更多的信息，则也可以想到所述离散区域具有m/z的不同长度。如所述，预定的m/z值范围通常是用于自动化质量导向分离的系统的基本配置的一部分，然而，系统的熟练用户可以选择修改包含m/z的离散区域的预定m/z值范围的范围，以进一步调整和优化分离方法。无论包含m/z的离散区域的预定m/z值范围是基本配置的一部分还是被用户修改的，包含m/z的离散区域的预定m/z值范围必须在步骤b)确定溶剂噪声水平以及随后涉及样品分级的步骤d-f中保持相同。

确定溶剂噪声水平的步骤b)包括以下子步骤：

b:1)进入预运行阶段；

b:2)将一部分所确定的溶剂梯度引导至质谱仪；

b:3)针对m/z的每个离散区域：

b:4)确定标量值tn，该标量值tn表示所确定的溶剂梯度在m/z的相应离散区域中的噪声水平。根据本发明的一个实施方案，选择标量值tn作为m/z的相应离散区域n的强度中的最大值。根据一个实施方案，选择标量值tn，一个高于强度中的最大值的预定值或预定百分比。这将确保所确定的梯度溶剂的噪声绝对不会影响例如tic。对于其中某些噪声可以接受的应用，选择这样的标量值tn也可能是合适的，一个低于强度中的最大值的预定值或预定百分比。也可以使用处理实验数据的常用措施，例如识别和排除明显的异常值等。

b:4)退出预运行阶段并进入色谱阶段。

图3为简化的质谱谱图，说明了对于m/z的各离散区域如何选择相应的梯度信号t1、t2、t3…、tn、…tn。在m/z的各离散区域中的所确定的溶剂梯度的最大强度值tn也表示组合色谱-ms运行中的最大强度值，尽管由于色谱柱中的分离而延时。因此，对于与确定的溶剂梯度混合的样品而言，可以将来自单独的所确定的溶剂梯度的ms的最大强度值tn视为在组合色谱-ms运行中相应的m/z的离散区域的最大噪声水平。

可以将确定溶剂噪声水平的步骤b)视为预运行。根据本发明方法的一个实施方案，它是全自动的，其包括b:1)的引导步骤通过控制选择器以将所确定的溶剂梯度与质谱仪溶剂混合并将其供给质谱仪来进行，因此，在预运行阶段期间，绕过色谱仪。

在步骤e)中，可以使用所有接收的强度的总值来创建总离子色谱图(tic)。或者，使用选择的信号来创建提取的离子色谱图(xic/eic)。如技术人员将理解的，结果信号永远不会是负的，因此(t’1–t1)≥0、(t’2–t2)≥0、(t’3–t3)≥0等的判别式必须满足。

步骤a)的溶剂梯度将包含逐渐变化的离子强度，其易于被本领域技术人员根据色谱领域中公知的原理(包括例如关于样品的折射率、所用柱的填充等的考虑)进行限定。快速色谱法中常用的溶剂的实例包括乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷、丙酮等。

此外，步骤b)中产生的梯度信号本身可用作线性梯度，在这种情况下，在步骤c)中，根据步骤a)限定的溶剂梯度——即与限定的梯度相同或基本相同——流经整个柱体。

或者，在步骤c)中，所限定的梯度的仅一部分可以较短的线性梯度或非线性梯度(例如逐步梯度)使用。

根据本发明使用的梯度的斜率可为从陡峭梯度至基本平缓梯度的任何值，这取决于期望的分离。

本发明的分离可为液相色谱法，例如flash色谱法。所用的色谱柱可为任何市售的和常规的填充柱，例如在flash色谱法的情况下的二氧化硅柱。技术人员能够为期望的分离选择合适的材料和方法。

可将样品预先或仅在分离之前施加到柱上，并且可为干燥样品或液体样品。更具体而言，样品可以未经稀释的形式施加，简单地按原样施加到柱上；以合适溶剂中的溶液施加；或以沉积干燥的样品施加。可以使用为这类样品的施加配置了合适大小的空间色谱柱。

本发明的方法有利地用于物质和/或化合物的组合鉴定和纯化。本发明可用于任何可能成功进行质谱法的靶分子，例如包括合适大小的核酸和肽的有机分子。由于快速色谱法通常用于检测生物样品中的物质(如疾病标记物或药物)，样品可来自血液、尿液、唾液等。

如本文中使用的，术语“自动化”分离意指至少一个步骤是自动化的。有利地，所有步骤都是自动化的，并且本发明的方法可以称为“完全自动化”。本发明的方法的一个或多个步骤可由计算机控制。

因此，在第二方面，本发明涉及软件，即计算机程序，其可以在任何合适的数据载体上提供，并且能够执行本发明方法的至少一个自动化步骤(例如所有步骤)。本发明还包括被编程为执行本发明的方法的一个或多个步骤的计算机。

本发明的计算机程序可包括用于使系统执行本发明的方法的计算机可执行指令。

因此，更具体而言，根据本发明提供了一种计算机程序产品，其包括存储器和/或计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质具有在其中具体表达的上述计算机程序。本文中提及的存储器和/或计算机可读存储介质可以包括基本上任何存储器，例如rom(只读存储器)、prom(可编程只读存储器)、eprom(可擦除prom)、快闪式存储器、eeprom(电可擦除prom)或硬盘驱动器。

在第三方面，本发明涉及一种用于进行样品的两种或更多种组分的自动化质量导向分离的系统，例如液相色谱(例如快速色谱)。

本发明的系统可包括色谱柱，其被构造成容纳任何种类的色谱填充物，如上所述。本发明的系统可以进一步包括一个或多个容器，所述容器被构造成容纳适当的溶剂以提供改变所述溶剂的组成的液体梯度。为了便于制备溶剂的液体梯度，本发明的系统可以进一步包括选择器，该选择器被构造成接收溶剂并将其以适当比例流经所述柱。选择器可例如为手动阀或可由控制信号控制的致动器阀的形式。

本发明的系统可以进一步连接到质谱仪(ms)或者包括质谱仪(ms)。如技术人员将理解的，本发明可使用任何常规的质谱仪，其通常与液相色谱(例如flash色谱)结合使用。根据本发明使用的ms可为例如四极质谱仪。

本领域技术人员还能够将质谱仪与常规级分收集器组合以收集一种或多种目标样品组分，根据本发明，所述目标样品组分将以比任何现有技术方法更高的纯度获得。

因此，本发明使用与常规质谱仪连接的常规元件，但是首次建议通过在对样品的组分进行真正的分离之前的步骤中确定特定梯度导致的噪声水平，以降低质谱仪中的溶剂引起的噪声。换句话说，根据本发明，在预运行中对所确定的溶剂梯度进行质谱分析，以确定其在质谱分析期间产生的信号。由于如果在用于从色谱柱中洗脱目标组分的后续步骤中使用梯度的话，这类梯度信号构成了噪声，因此根据本发明建议将梯度信号从在后续色谱步骤中获得的样品信号中减去。

如本领域技术人员将理解的，本发明的预运行用于获得梯度中使用的相关浓度的信号，而不需要在预运行中使用与后续色谱步骤中相同的流速。因此，本发明的预运行的优点在于它可以比在相关的填充色谱柱上执行的传统“校准运行”更快。

如本领域技术人员所理解的，本发明的预运行可以以任一方向进行梯度；以与后续色谱步骤设定的相同的组成开始，或替代性地从设定的最终组成开始并运行直至达到设定的起始组成。

如本领域技术人员将理解的，可以有利地在柱的下游使用分流器类型的阀门，以便将来自柱的洗脱液或已经绕过柱的液体梯度与常规质谱仪溶剂组合。阀门或分流器应由控制信号控制。在us5,803,117中记载了在本发明的方法和系统中用作分流器装置的示例性阀门。

因此，更具体而言，本发明可为用于执行两种或更多种组分的自动化质量导向分离的系统，在图3中示意性地示出的该系统包含

i.色谱柱30；

ii.至少第一容器31和任选的第二或更多容器32，其位于所述色谱柱30的上游，并被构造成容纳一种或多种溶剂；

iii.选择器34，其被构造成至少从第一容器31和任选地从第二容器32接收溶剂，并将得到的溶剂流引导至色谱柱30；

iv.质谱仪(ms)35，其位于所述色谱柱30下游；

v.额外的溶剂容器33，其被构造成容纳ms溶剂；

vi.分流器装置36，其被构造成接收来自色谱柱30下游的点处的洗脱液流，并且将至少一部分的所述洗脱液流与ms溶剂组合并将洗脱液-溶剂混合物引导至ms35；和/或将至少一部分的所述洗脱液引导至级分收集器37，以便随后分离进入单独的收集器单元38，

其中，将校准旁路回路39布置为使溶剂从选择器下游的点经由阀门进入色谱柱30下游但在分流器装置36上游的管道中。

本发明的系统可进一步包括处理器，将该处理器构造成(i)从一组样品信号中减去一组梯度信号，所述梯度信号是在下游阀被设置为经由旁路回路将溶剂流引导至分流器装置时获得的，所述分流器装置设定为将所述流与ms溶剂组合并将所述组合流引导至ms；所述样品信号是在下游阀被设置为将流出色谱柱的洗脱液流至分流器装置时获得的，该分流器装置被设定为将至少一部分的所述洗脱液引导至ms并将一部分的所述洗脱液引导至级分收集器；并且将该处理器构造成(i)基于使用所得信号而产生的谱图，指示所述级分收集器的操作。

更具体而言，本发明使用的控制单元可为电子控制单元(ecu)或车载(on-board)计算机。本发明的控制单元可包括可通信地耦合到用于有线或无线通信的收发器的处理器。在一个实施例中，处理器可以选择处理电路和/或中央处理单元和/或处理器模块和/或被配置为彼此协作的多个处理器中的任何一个。此外，控制单元可有利地包括存储器。存储器可包含可由处理器执行以进行本文描述或所示的方法中的任何一种的指令。处理器可以通信方式耦合到所选择的收发器和存储器中的任何一个。

本发明的系统有利地用于化合物的组合鉴定和纯化，例如上述讨论的那些。